tulokset ja keskustelu

nisäkkäiden järjestelmissä cdc42-aktiivisuuden on osoitettu olevan tärkeää ihon varren/progenitorisolujen erilaistumisen säätelyssä karvatuppisoluiksi, neuroepiteelisen varren/progenitorisolujen polariteetin ja aivojen puolipallon bifurkaation säätelyssä sekä solujen määrän ja kasvun säätelyssä perinataalisen kehitysjakson aikana (6-9). Mielenkiintoista on, että cdc42-aktiivisuuden tutkiminen eri-ikäisillä aikuisilla hiirillä paljastaa, että vanhempien eläinten suhteellinen Cdc42-GTP-taso on huomattavasti korkeampi kuin nuorempien erilaisissa kudoksissa, kuten sydämessä, aivoissa, keuhkoissa, maksassa, luuytimessä, pernassa ja munuaisissa (Kuva. 1 A ja tietoja ei näytetä), mikä lisää mahdollisuutta, että lisääntynyt Cdc42-aktiivisuus on mukana normaalissa ikääntymisprosessissa.

selvittääksemme, onko luonnolliseen ikääntymiseen liittyvällä lisääntyneellä Cdc42-aktiivisuudella fysiologista merkitystä, tutkimme cdc42-negatiivista säätelijää, Cdc42GAP: tä, geeneihin kohdistetuilla hiirillä niiden saavuttua täysi-ikäisiksi. Aiemmat tutkimukset homotsygoottisilla cdc42gap-knockout-hiirillä perinataalivaiheessa osoittivat, että eri kudoksissa/soluissa cdc42-GTP oli suurentunut, ja cdc42gap − / − genotyypin alkioilla / vastasyntyneillä poikasilla oli pienentynyt elin/organismikoko, joka liittyy lisääntyneeseen spontaaniin apoptoosiin eri solutyypeissä (6). Aikuisilla Cdc42GAP -/-hiirillä cdc42-aktiivisuus oli konstitutiivisesti korkeampi useissa kudos / solutyypeissä kuin vastaavilla WT-hiirillä, kun taas RhoA-GTP: n tai Rac1-GTP: n taso pysyi samana kuin WT: n (kuva. 1; tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa spesifiseen cdc42: n hyötyaktiivisuuteen täysikasvuisilla eläimillä, joka on samanlainen kuin perinataalivaiheessa. Suurin osa cdc42gap−/− hiiristä kuoli vastasyntyneen aikana pienemmän kokonsa ja heikon ruumiinrakenteensa vuoksi (6). Kuitenkin, osa heistä (≈7%) voisi selviytyä vastasyntyneiden aikana sijaishoidossa, johon ei liity hoivaa naaraat. Huolimatta säännöllisestä maidonsaannista ja normaaleista seerumin glukoosi− ja insuliinipitoisuuksista homotsygooteilla syntymänjälkeisessä vaiheessa , cdc42gap−/ – hiirten painonnousu alkoi hidastua ≈3 kuukauden iässä verrattuna ≈5 kuukauden ikään WT-hiirillä tai heterotsygooteilla, ja kypsien homotsygoottien paino oli ≈30% pienempi yleisen sellulaarisuuden vähenemisen vuoksi (kuva. 1 C ja tietoja ei näytetä). Cdc42GAP −/− hiirten eliniän mediaani oli ≈12 kuukautta, kun taas kontrollihiiret (WT tai heterotsygootti) pysyivät elinvoimaisina, kunnes mediaani-ikä oli ≈27 kuukautta (Kuva. 1 D). Homotsygoottien hiirten eloonjäämiskäyrä poikkeaa jonkin verran tyypillisestä Gompertz-käyrästä, mutta on samanlainen kuin BubR1: n (mitoottisen tarkastuspisteen säädin) knockout (10) tai p44: n (p53-tuumorisuppressorin lyhyt isoformi) siirtogeenisten (11) eläinten osalta. Kyfoosi ja elinvoiman puute cdc42gap−/− hiirillä ilmeni ≈12 kuukauden iässä (Kuva. 1 E). Nyljetyillä cdc42gap−/ – hiirillä havaittiin 15 kuukauden iässä selvää kehon massan vähenemistä, subdermaalisen rasvakudoksen huomattavaa vähenemistä, vaikeaa lordokyfoosia ja lihasten surkastumista (tietoja ei näy). Röntgenkuvauksessa cdc42gap−/− hiirillä havaittiin merkittävä kyfoosin fenotyyppi ja luun mineraalitiheyden (BMD) väheneminen 15 kuukauden iässä (Kuva. 1). Cdc42gap – / – hiirten leikeltyjen luiden tarkempi kvantifiointi paljasti sääriluun BMD: n 3-ja reisiluun 2, 6-kertaisen pienenemisen (SI Kuva. 7). Lisäksi sekä urokset että naaraat cdc42gap – / – hiiret menettivät hedelmällisyyttään varhaisemmalla iällä verrattuna WT-hiiriin. Parittelussa cdc42gap – / – naaraiden ja WT-urosten välillä homotsygootit tulivat hedelmättömiksi 26 viikon iässä verrattuna 48 viikon ikäisiin WT: hen (Kuva. 1 G). Nämä havainnot osoittavat, että cdc42gap-puutos johtaa perustuslaillisesti kohonneeseen cdc42-GTP-tasoon, kehon koon pienenemiseen, varhaiseen kyfoosiin, luun mineraalitiheyden pienenemiseen, hedelmällisyysajan lyhenemiseen ja eliniän lyhenemiseen aikuisilla hiirillä.

h&E värjätyt kohdat 8 kuukauden ikäisen naarashiiren selkärangan läpi osoittivat, että Cdc42GAP- / -hiirillä oli ohuempi, kumarainen aivokuori ja ohuempi trabeculae verrattuna WT − hiiriin (Kuva. 2 A). Vastaavasti homotsygoottisten hiirten reisiluun pituuspiirit osoittivat aivokuoren luun paksuuden vähenevän verrattuna WT-hiirten paksuuteen (tietoja ei näy). Nämä havainnot ovat sopusoinnussa osteoporoosin karkean ulkonäön ja kliinisten ominaisuuksien kanssa. Aikuisten cdc42gap−/− hiirten pernan, maksan ja munuaisten massa pieneni johtuen kokonaissellulaarisuuden vähenemisestä, mikä näkyi h&e-värjäytyneissä pernan osissa, ja 12-kuukautisten cdc42gap-/-pernan t− ja B− solua sisältävät valkoisen massan alueet pienenivät huomattavasti verrattuna ikääntyneiden WT-hiirten (Kuva. 2 B ja tietoja ei näy), mikä viittaa voimakkaaseen lymfaattisen atrofiaan homotsygooteilla. Subdermaalisen rasvakudoksen näennäisen vähenemisen mukaisesti selkäihon poikkileikkausten histologinen analyysi paljasti, että 9 kuukauden ikäisillä cdc42gap- / -hiirillä ei ollut lainkaan S. C. − rasvasoluja (Kuva. 2 C). Lihasmassan väheneminen ja lihasatrofia vahvistettiin myös tutkimalla H&E-värjättyjä luurankolihasosioita 12 kuukauden ikäisillä Cdc42GAP-/-hiirillä ja age− matched WT− hiirillä (Kuva. 2 C). Cdc42GAP – / – hiiret osoittivat myös huomattavaa vähenemistä karvojen uudistumisessa sen jälkeen, kun dorsaalinen karva oli poistettu parranajolla, kun taas iän ja sukupuolen mukaisella WT: llä oli vankka karvankasvu (SI Fig. 8). Kyky sietää stressiä, kuten haavan paranemista, ikääntymiseen liittyvä aktiivisuus (12) cdc42gap – / – hiirten, oli merkittävästi vähentynyt verrattuna WT (Kuva. 2 D). Haavan osien histopatologinen analyysi osoitti, että cdc42gap−/− hiirten haavan reunassa oli vain vähän reepitelialisaatiota, kun taas WT-hiirten täydellinen reepitelialisaatio oli havaittavissa 4 päivää haavan käyttöönoton jälkeen (kuva. 2 E). Näiden havaintojen lisäksi useat homotsygoottisten hiirten hematopoieettiset fenotyypit, mukaan lukien anemia, pernan ja luuytimen sellulaarisuuden väheneminen, luuytimeen kiinnittyvien hematopoieettisten kantasolujen viat ja hematopoieettisten kantasolujen lisääntynyt herkkyys indusoidulle mobilisaatiolle (13, 14), olivat yhdenmukaisia hematopoieettisen järjestelmän varhaisen vanhenemisen kanssa. Tärkeää on, että nuorilla homotsygooteilla hiirillä (<4 kuukauden ikäisillä) ennen ilmeisten fenotyyppien ilmenemistä ei havaittu merkittäviä poikkeavuuksia luussa, ihossa ja pernassa (SI Kuva. 9 A ja B ja tietoja ei näytetä), mikä viittaa siihen, että cdc42gap-/− hiirten ikääntymistä muistuttavat fenotyypit eivät johdu varhaisesta kehityshäiriöstä. Lisäksi vanhoilla (>2,5 vuotta vanhoilla) WT-hiirillä (SI Fig. 9 C ja D ja tietoja ei näytetä). Kuten si-taulukossa 1 on tiivistetty, nämä tulokset antavat yhdessä vahvaa näyttöä siitä, että cdc42gap-puutos aiheuttaa eläimissä ennenaikaista vanhenemista muistuttavia fenotyyppejä.

9 kuukauden ikäisten aikuisten kudosten, mukaan lukien maksan, munuaisten ja pernan, värjäytyminen vanhenemiseen liittyvän β-galaktosidaasin (SA-β-Gal) varalta paljasti homotsygooteilla hiirillä tämän vanhenemismarkkerin voimakkaan aktiivisuuden, jota ei ollut havaittavissa ikä-ja sukupuolisuhteiltaan samanlaisten WT-hiirten kudoksissa (Kuva. 3 A ja SI Kuva. 10), mikä osoittaa, että cdc42gap−/ – aikuisten kudokset voivat käydä läpi ennenaikaisen vanhenemisen. Mielenkiintoista on, että perinataalikaudella havaittu homotsygoottien lisääntynyt apoptoosi puuttui aikuisista homotsygooteista, kun kohonnutta SA-β-gal-aktiivisuutta oli havaittavissa (viite. 6 ja tietoja ei näytetä). Cdc42gap−/ – hiiren alkion fibroblasti (MEF)-solut, jotka sisältävät ≈3 kertaa suuremman Cdc42-GTP: n, mutta normaalin Rac1-GTP: n tai RhoA-GTP: n sisällön verrattuna WT MEF-soluihin (6), osoittivat merkitsevästi lisääntynyttä SA-β-gal-aktiivisuutta ja keräsivät litistyneen ja laajentuneen senesoivan morfologian, joka alkoi kohdasta 6, Kun WT-MEF-solut olivat negatiivisia SA-β-Gal: n aktiivisuudelle ja olivat sopimussuhteisia morfologiassa (Figs. 3 B ja Si Kuva. 11). Cdc42GAP – / – MEF-solujen kasvu alkoi hidastua kohdissa 5-7, kun yhteensopivat WT MEF-solut kasvoivat eksponentiaalisesti (Kuva. 3 C) (6), ja ne kokivat massiivisen replikatiivisen vanhenemisen kohdan 7 jälkeen, kun taas useimmat WT MEF-solut saavuttivat vanhenemisen vasta kohdassa 13 (SI Kuva. 11 ja tietoja ei näytetä). Lisäksi huomattavasti suurempi osuus cdc42gap−/− MEF-soluista solukäytävässä 7 muodosti suurempia pesäkkeitä tumassa kuin WT-solut (SI Fig. 12). Nämä tulokset osoittavat, että Cdc42GAP-puutos aiheuttaa varhaista kudoksen/solujen vanhenemista.

yksi hyvin tunnettu nisäkkäiden ennenaikaiseen vanhenemiseen ja solujen vanhenemiseen vaikuttava tekijä on lisääntynyt genomin epävakaus (15). Metafaasin leviämisanalyysi osoitti, että >30% 8 kuukauden ikäisten homotsygoottien primaarisista splenosyyteistä oli aneuploidisia, kun taas iän ja sukupuolen mukaisilla WT-splenosyyteillä ei ollut havaittavaa aneuploidiaa (Kuva. 3 D), mikä osoittaa, että cdc42gap−/− kudos kärsi genomisesta epävakaudesta. Tämän havainnon tueksi Cdc42GAP – / – MEF-soluissa havaittiin Dapi-värjäyksen yhteydessä kaksoissolujen merkittävää lisääntymistä verrattuna WT-soluihin kohdassa 7 (SI Fig. 12). KARYOTYYPPIANALYYSI MEF-solujen myöhemmistä osista (kulku 6-7) paljasti edelleen, että vaikka useimmat WT− solujen kromosomit (≈80%) pysyivät koskemattomina, 42% Cdc42GAP−/ – soluista sisälsivät vähintään yhden kromosomipoikkeaman, 20% sisälsi kaksi tai useampia aberraatioita ja 14% kolme tai useampia aberraatioita (Fig. 3 E). Aneuploidian osuus ja aste lisääntyivät merkittävästi myös Cdc42GAP – / – MEF-soluissa, >32% soluista, joilla oli epänormaaleja kromosomilukuja 72: sta 102: een, kun taas useimmat WT-solut olivat diploidisia (Fig. 3 E ja Si Fig. 13). Kromosomivaurioiden karyotyyppianalyysi osoittaa, että homotsygoottisten MEF-solujen poikkeavuudet olivat moninaisia, mukaan lukien kromatidin katkeaminen, sisarkromatidin ennenaikainen erottaminen (viallisen karan kokoonpanon tarkistuspisteen tunnusmerkki), translokaatio, kromosomin katkeaminen, dikentrinen kromosomi ja kromosomin pirstoutuminen (Fig. 3 F ja Si Taulukko 2), mikä viittaa siihen, että DNA− vaurioiden korjauskoneisto on vaarantunut Cdc42GAP−/ – soluissa. Solun tumassa olevan fosfo-H2 AX: n immunofluoresenssivärjäys, DNA− vauriovastemerkki (16), osoittaa, että vaikka 10% 7 cdc42gap−/ – MEF-solusta oli positiivinen DNA-vauriomarkkerille, <1% WT-soluista oli positiivisia (Kuva. 3 G). Korrelaatio cdc42gap-/− hiirten ikääntymistä muistuttavien fenotyyppien alkamisen ja etenemisen sekä cdc42gap− / − soluissa Havaittujen genomisten poikkeamien asteen ja vakavuuden välillä tukee Cdc42: n roolia progeroidiominaisuuksien kehityksessä.

cdc42gap− / − solujen kertyneiden DNA-vaurioiden mahdollisen mekanismin määrittämiseksi vertasimme homotsygoottisolujen endogeenista reaktiivista happilajitasoa (Ros) WT-solujen tasoon, koska Rac1 ja Rac2, kaksi läheistä Rho Gtpaasia, ovat solun ROS: n (17) tunnettuja säätelijöitä. Si Fig. 14 osoittaa, että Cdc42GAP−/− soluilla oli samanlainen ROS-aktiivisuus kuin WT-soluilla, mikä osoittaa, että Cdc42GAP säätelee genomin stabiilisuutta endogeenisen ROS-riippumattoman mekanismin kautta. Koska yhtäläisyyksiä useita cdc42gap−/ – hiiri fenotyypit kuin useita geeni kohdennettu hiiri malleja DNA-vaurioita korjaus molekyylejä, mukaan lukien Brca1-/− p53+/−, Ku80−/−, ja Mtr−/− Wrn hiiri mallit (12, 18, 19), me edelleen tutkimme reagointikykyä aikaisin passaged Cdc42GAP− / – solujen eri DNA-vaurioita aineita. DNA damage response growth assayssa cdc42gap-vajavaiset solut osoittivat laajan DNA-vaurioiden korjausaktiivisuuden puutteen (Fig. 4), joka ilmenee huomattavasti suurempina solukuolemaprosentteina homotsygoottisten solujen keskuudessa verrattuna WT-soluihin käsittelyn jälkeen lisäämällä h 2O2− annoksia, ionisoivaa säteilytystä, kamptotesiinia, metyyli− metaanisulfonaattia tai mitomysiini C: tä.siten cdc42gap – / – solujen myöhemmissä kohdissa havaitut kumuloituneet erilaiset genomipoikkeavuudet voivat johtua ainakin osittain heikentyneestä DNA-vaurioiden korjaustoiminnasta.

seurauksena solujen pysyvästä genomivauriosta on useiden DNA-vauriovasteen ja / tai senesenssigeenien induktio (20, 21). P53: n, p21Cip1: n, p16ink4a: n ja phospho-p53: n (ser-15) lausekkeet Cdc42GAP−/− MEF-soluissa olivat merkittävästi korkeammat kuin WT-MEF-soluissa samankaltaisten siirtojen jälkeen, kun taas p19arf: ssä homotsygoottisissa soluissa esiintyi samanlainen kasvusuuntaus siirtojen kanssa, kuten WT-soluissa (Kuva. 5 A). P53: n, p21Cip1: n, p16Ink4a: n, phospho-p53: n (Ser-15) ja DNA-vauriomarkkerin phospho− H2 AX: n proteiinipitoisuudet cdc42gap−/–kudoksissa 8 kuukauden ikäisillä hiirillä olivat myös huomattavasti korkeammat kuin vastaavissa kudoksissa vastaavilla WT-hiirillä (Kuva. 5 B). Nämä tulokset osoittavat, että erityisesti p53-säännellyn reitin, p21Cip1: n ja p16Ink4a: n, aktivoituminen liittyy cdc42gap-puutoksen aiheuttamaan varhaiseen vanhenemiseen. Selvittääksemme, riittääkö kohonnut Cdc42-aktiivisuus cdc42gap-puutteellisissa soluissa selittämään varhaisen vanhenemisen fenotyypin, ilmaisimme cdc42: n, Cdc42F28L: n aktivoivan mutantin primaarisissa WT MEF-soluissa ja määritimme solujen SA-β-gal-aktiivisuuden verrattuna vastaaviin EGFP: tä ilmentäviin soluihin eri kohdissa. Cdc42f28l-ekspressio aiheutti merkittävän kasvun SA-β-Gal-positiivisissa soluissa (35% Cdc42F28L-soluissa verrattuna 7% EGFP-ilmentävissä soluissa) varhaisissa MEF-soluissa (Kuva. 5 C), mikä osoittaa, että cdc42-aktivaatio riittää solujen varhaisen vanhenemisen induktioon.

tutkiaksemme tarkemmin mahdollisuutta, että cdc42gap−/− solujen vanheneva fenotyyppi voitaisiin pelastaa p53−vialla, tuotimme cdc42gap+/− p53+ / – hiiriä ja yritimme valmistaa MEF-soluja risteytetyistä. 44 alkiosta saatiin kuusi cdc42gap−/−p53+/− genotyyppiä ja yhtään Cdc42GAP−/−p53−/− genotyyppiä. Cdc42GAP – /− p53+/− MEF− solut kasvoivat nopeudella p53+/− ja WT− solujen välillä, ja niillä oli tyvi− senesoiva populaatio, joka oli verrattavissa p53+/− tai WT-solujen populaatioon kohdassa 7, kun taas p53-/-ja Cdc42GAP – / – MEF-solut proliferoituivat lineaarisella käyrällä ja mutka-populaation kaksinkertaistumiskäyrällä ja olivat vanhenemiskestäviä ja vanhenemiselle alttiita vastaavissa kohdissa (Kuva. 5 D ja E). Nämä tulokset osoittavat, että cdc42-aktivaation aiheuttama ennenaikainen vanheneminen riippuu p53: sta.

solujen ja eläinten rajallinen elinikä voi johtua replikatiivisesta vanhenemisesta vastauksena erilaisiin rasituksiin, kuten DNA-vaurioihin (22), telomeerieroosioon (23), ROS-eroosioon (24) ja / tai epäasianmukaisesti aktivoituneisiin onkogeeneihin (25). Cdc42gap−/ – hiirillä on gain-of-Cdc42-aktiivisuuden eläinmalli, joka jäljittelee mitogeenisen signaalin aiheuttamaa cdc42-aktivaatiota (6) ja jonka avulla voidaan arvioida Cdc42-aktivaation mahdollisia vaikutuksia eläinten ja solujen fysiologiaan. Osoitamme, että Cdc42GAP-puutos aiheuttaa varhaista vanhenemista soluissa ja ennenaikaista vanhenemista muistuttavia fenotyyppejä eläimessä. Erityisesti Cdc42GAP-geenin kohdistaminen indusoi maailmanlaajuisen cdc42-aktiivisuuden lisääntymisen ja edistää solujen genomin epävakautta vähentyneellä DNA-vaurioiden korjauskyvyllä, mikä puolestaan voi aktivoida p53: n ja p16 Ink4a: n, mikä johtaa varhaiseen vanhenemiseen (Kuva. 5 F). Aiemmin cdc42: n on havaittu aktivoituvan senesoivissa soluissa morfologisen säätelyn moduloimiseksi (26). Sen on myös ehdotettu osallistuvan p53-säänneltyyn solujen morfologiseen muutokseen, apoptoosiin ja proliferaatioon (27-29) sekä C-Jun N-terminaaliseen kinaasikontrolloituun apoptoosiin (30, 31), tapahtumiin, jotka ovat liittyneet solujen vanhenemiseen ja eläinten vanhenemiseen (32, 33). Havaintomme, että Cdc42-aktivaatio liittyy luonnolliseen ikääntymiseen ja että Cdc42GAP-puutos aiheuttaa DNA-vaurion korjausvian, jotta solut voivat kerätä genomisia poikkeavuuksia, jotka johtavat varhaiseen vanhenemiseen, viittaavat edelleen toiminnalliseen yhteyteen cdc42-aktiivisuuden ja nisäkkäiden ikääntymisen välillä.

p53-reitin aktivoitumisen tai DNA-vaurioiden korjaamiseen tai genomin stabiilisuuden säätelyyn osallistuvien geenien häiriintymisen on osoitettu aiheuttavan varhaista vanhenemista hiirillä.(11, 12, 33, 34). Aiempien havaintojen mukaisesti, joiden mukaan Cdc42 ei välttämättä osallistu solujen superoksiditoimintojen säätelyyn (17), havaitsimme, että cdc42gap−/− solujen kertyneet DNA-vauriot eivät liity ROS-aktiivisuuteen, koska homotsygootit solut eivät osoita lisääntynyttä ROS-aktiivisuutta. Cdc42gap-deleetio vähentää huomattavasti DNA-vaurioiden korjauskykyä laajalla spektrillä, mukaan lukien vasteet DNA: n ristisilloitusaineelle ja kaksijuosteiselle katkolle tai yksijuosteiselle katkoksen indusaattorille, mikä viittaa siihen, että cdc42: n pitkäaikainen aktivointi voi heikentää DNA-vaurioiden korjauskykyä. Cdc42gap−/− soluissa Havaittujen genomivaurioiden monimuotoisuus on myös yhdenmukainen globaalin DNA-vaurion korjausvian vaikutuksen kanssa. Ratkaisematta olevia tärkeitä kysymyksiä ovat muun muassa se, mitä erityisiä molekyylitekijöitä liittyy CDC42GAP-säädeltyyn DNA-vaurioiden korjaukseen ja mitkä alkupään signaalit lisäävät Cdc42-GTP: tä normaalin vanhenemisprosessin aikana.