tulokset

karakterisointi ohutsuolen Plasmasytoididendriittisoluista.

käytimme tavanomaisia menetelmiä eristääksemme epiteelissä (intraepiteeli, IE) ja LP: ssä sijaitsevat immuunisolut suolistosta. Molemmista soluvalmisteista löytyi erillinen populaatio CD11c+B220 + Ly6C+ soluja, joita oli jopa 1% kaikista soluista. Toisin kuin pDC, myeloidista (M)DC: tä (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) esiintyi IE-valmisteessa vain hyvin pieninä määrinä (Kuva. 1 A). Sekä LP-että IE-valmisteen pDC-arvot osoittivat alhaista pinnan MHC-luokan II ilmentymistä (Kuva. 1 A). Lisäanalyysi osoitti, että molempien valmisteiden CD11c+B220+Ly6C+ – solut ilmentävät tasaisesti PDC-markkereita PDCA1 sekä 120G8 (Kuva. 1). IE-valmisteen lajitellusta pDC: stä (CD11c+B220+Ly6C+) ja myeloidisesta DC: stä (mDC) saadut sytospiinit paljastivat PDC: n pyöreän ja sileän plasmasolun kaltaisen morfologian, kun taas mDC: llä oli tunnusomaisia dendriittejä (Kuva. 1 C). Edelleen karakterisoida lokalisointi PDC suolistossa sovellimme anti-B220, anti-120g8, ja anti-CD3 mAb immunohistologia. Micrographs otettiin satunnaisesti osioista ja, kuten kuvassa. 1 D, 120g8+B220+CD3− solujen sijoittelu epiteelisoluihin nähden määritettiin kuva-analyysin avulla (analyysi; Olympus, Hampuri, Saksa). Arvioidessamme paikannusta ≈150 pDC havaitsimme, että 4,9% näistä soluista sijaitsi selvästi epiteelisolukerroksen sisällä, kun taas toiset 6,7% sijaitsivat 5-10 µm etäisyydellä epiteelisolujen apikaalisesta kärjestä (Kuva. 1 D). Nämä tiedot osoittavat, että tietty määrä PDC: tä sijaitsee suolen epiteelissä tai sen lähellä, kun taas >80% analysoiduista soluista oli sijoitettu etäisyyksille >15 µm, mikä tekee niistä LP-soluja (Kuva. 1 D). Koska IE-ja LP-valmisteessa oli tavanomaisten eristysmenetelmien jälkeen yhtä paljon pDC: tä, on tällä hetkellä epäselvää, saastuttaako LP-valmisteen pDC: t IE-valmistetta vai eristetäänkö epiteeliin sijoittuva PDC tehokkaammin. Koska me tuskin löytää MDC sisällä IE valmistelu suosimme jälkimmäistä mahdollisuutta. Vielä on kuitenkin selvittämättä, palvelevatko molemmat populaatiot eri tehtäviä vai kuuluvatko ne yhteiseen solupopulaatioon. Koska IE-valmisteen pDC, toisin kuin LP-valmisteen pDC, voidaan eristää melko hellävaraisilla menetelmillä, funktionaalisissa määrityksissä käytettiin tässä tutkimuksessa yksinomaan IE-valmisteen pDC: tä.

CCR9 ilmentymä suoliston pDC: ssä.

tunnistaaksemme molekyylimekanismit, jotka mahdollistavat PDC: n siirtymisen suolistoon, analysoimme homing-molekyylien ilmentymistä. Vaikka on hyvin osoitettu, että integriini aE (CD103) välittää lymfosyyttien adheesiota epiteelisoluihin suolistossa, emme onnistuneet tunnistamaan tämän integriinin ilmentymistä suoliston PDC: ssä. Vastaavasti CCR7 (Kuva. 1 E), joka liittyy olennaisesti lymfosyyttien siirtymiseen perifeerisiin lymfoidisiin elimiin, ei ilmene suolen pDC: llä. Sen sijaan havaitsimme korkeita CD18 (β2-integriini) ja välitasoja α4β7, kun taas ≈50% PDC express P-selektiiniligandeista (Fig. 1 E). Kiinnostavaa on, että valtaosa suoliston pDC: stä ilmaisi suuria määriä kemokiinireseptoria CCR9 (Kuva. 1 E), kun taas LP: n mDC ilmaisi ccr9: n vähäisen määrän .

CCR9 ilmentymä PDC eristettynä eri Imukudoselimistä.

ottaen huomioon ccr9: n yhdenmukaisen ilmentymisen suoliston pDC: ssä analysoimme ccr9: n ilmentymisen PDC: ssä, joka on eristetty sekundaarisista lymfoidisista elimistä, mukaan lukien perna, ihon tyhjennys LN, suoliliepeen LN ja Peyerin laastarit (PP; Kuva. 2 A) ja positiivisena kontrollina käytetyt CD4+CD8+ tymosyytit, joiden tiedetään ilmaisevan suuria ccr9-pitoisuuksia (11); Kuva. 2). Mielenkiintoista, vain murto-osa PDC läsnä missään näistä elimistä ilmaistaan CCR9 (Kuva. 2 A), kun taas ≈95% BM: stä eristetystä pDC: stä kantoi tätä reseptoria (Kuva. 2 C). Suurin osa BM pDC: stä ilmaisee myös CCR5: tä ja CXCR3: a, kun taas CCR2: ta esiintyy vain noin 25 prosentissa kennoista. CXCR4, jonka tiedetään säilyttävän soluja BM: ään, ilmaistaan vain hyvin heikosti (Kuva. 2 C). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että pDC on varustettu erilaisilla kemokiinireseptoreilla ennen vapautumista BM: stä. Tämä ominaisuus oletettavasti mahdollistaa kotiuttamisen paitsi tulehduspaikoille myös tulehduksettomaan suolistoon.

Flt3l-laajennetun pDC: n Kemotaksian analyysi.

perustuen ccr9: n voimakkaaseen ilmentymiseen BM: ssä ja suoliston PDC: ssä vertasimme PDC: n ja mDC: n migraatiokykyä kemokiinin CCL25 / TECKIIN, joka on ainoa tunnettu ligandi tälle reseptorille (12). PDC: n esiintymistiheys vaihtelee eri hiirikantojen välillä ja on tunnettua, että esimerkiksi c57bl/6 (B6) – hiirillä on paljon vähemmän pDC: tä kuin 129sv-hiirillä (13). Geneettisestä taustasta riippumatta hiiren kudoksista eristettävien pDC: iden määrä ei kuitenkaan riitä tavanomaisten in vitro-kemotaksis-määritysten tekemiseen. Tämän rajoituksen poistamiseksi laajensimme DC-populaatiota in vivo istuttamalla Flt3-L-erittävän kasvainsolulinjan (B16-FL) B6-hiiriin 14 päivän ajan (14).

tänä aikana pernassa olevien CD11c+ – solujen osuus kasvoi 3%: sta 30-35%: iin (tietoja ei näy). Kahdeksankymmentä prosenttia in vivo laajennettu pDC ilmaistu CCR9, tasot hyvin samanlaisia kuin läsnä BM pDC (viikunat. 2 C ja viikuna. 4 C) kun taas In vivo laajennettu mDC ilmaisi vain pieniä määriä tätä reseptoria (SI Fig. 6b ). Pernan pDC: t rikastettiin CD11c+ MACS-lajittelulla, mikä johti 95% puhtauteen CD11c+ – soluille, jotka sisälsivät ≈15% Ly6C+B220+ pDC: tä. In vitro transwell migration assays paljasti PDC: n vahvan kemotaktisen vasteen ccl25: lle sekä cxcl9: lle, joka on cxcr3: n ligandi, ja cxcl12: lle, joka on CXCR4: n ligandi. Vain heikko vaste havaittiin kohti CCL19: ää, joka toimii ligandina CCR7: lle. mDC osoitti vain vähän kemotaktista vastetta ccl25: lle ja CXCL9: lle ja kohtalaista vastetta cxcl12: lle ja CCL19: lle (Kuva. 3 A).

PDC: n väheneminen Ccr9-puutoksesta kärsivien hiirten ohutsuolessa.

näiden havaintojen perusteella luonnehdimme pDC: n jakautumista CCR9-puutteellisilla hiirillä. Löysimme samanlaisia prosenttiosuuksia PDC keuhkoissa ja maksassa (SI Kuva. 7) sekä nivus− ja suoliliepeen imusolmukkeissa, kun taas pernan PDC: n määrä kasvoi hieman ccr9−/ – hiirillä. Sen sijaan havaitsimme >90% suoliston vähenemisen ja 50% PP pDC: n vähenemisen (Kuva. 3).

pDC kulkeutuu mieluiten ohutsuoleen.

tähän mennessä kuvattujen havaintojen perusteella näytti todennäköiseltä, että PDC tarvitsee CCR9: ää ohutsuoleen kotiutumiseen. Todistaaksemme tämän hypoteesin siirsimme soluja B6− ja CCR9−/ – luovuttajilta, jotka kantoivat Flt3-L-erittävää kasvainta 14 päivän ajan. Flt3l: n vaikutuksesta pDC laajeni samassa määrin B6− ja CCR9−/ – hiirillä (Kuva. 4 A ja SI Kuva. 8) ja olivat erottamattomia ccr2: n, CCR5: n ja CXCR3: n ilmaisun suhteen, kun taas CCR9 havaittiin vain PDC: llä, joka oli peräisin B6: sta, mutta ei CCR9: n puutteellisista luovuttajista (Kuva. 4 C). Ilman lisäpuhdistusta näiden luovuttajien splenosyytit merkittiin vastaavasti 5 (6)-karboksifluoreseiinidiasetaatti-N-sukkinimidyyliesterillä(CFSE) ja 5 (6)-karboksitetrametyylirhodamiini-n-sukkinimidyyliesterillä (TAMRA). WT: n ja CCR9: n puutteellisten solujen seos, joka mukautettiin sisältämään yhtä monta pDC: tä, siirrettiin i.v: hen B6: n vastaanottajissa. 18 tunnin siirron jälkeen analysoimme ensin IE: ssä olevien adoptioluovutettujen WT-solujen koostumuksen sekä LP-valmisteen ja huomasimme, että 54% ja 25% kaikista IE: stä ja LP-fraktiosta talteen otetuista soluista olivat PDC (Kuva. 4). Nämä havainnot osoittavat, että erilaisista solupopulaatioista PDC siirtyi kotiin tehokkaimmin suolistoon. Nämä kilpailukykyiset siirrot osoittivat myös, että CCR9-puutteellinen pDC on suurelta osin heikentynyt kyvyssään kotiin suolistoon, mikä näkyy CCR9-puutteellisen ja WT-pDC: n alhaisena siirtymäsuhteena IE-ja LP-valmisteessa (Kuva. 4 D). Sen sijaan ccr9-puutos ja B6 pDC vaelsivat yhtä tehokkaasti perifeerisiin ja suoliliepeisiin imusolmukkeisiin (Kuva. 4 D). Solun merkintöjen luonteella ei ollut vaikutusta näihin kokeisiin, koska väriaineiden vaihto B6− ja CCR9−/ – solujen välillä tuotti identtiset tulokset (Tietoja ei näytetä). Vaikka nämä tiedot osoittavat selvästi, että PDC vaatii ccr9: ää tehokkaaseen suolistoon siirtymiseen, on syytä mainita, että PDC: n salakuljetusominaisuudet flt3-ligandilla hoidetuilta hiiriltä saattavat poiketa fysiologisissa tilanteissa esiintyvistä ominaisuuksista.

PDC hakeutuu tulehtuneeseen suolistoon.

koska tiedetään, että PDC: llä on tärkeä rooli virusvastaisessa immuniteetissa (4, 10), arvelimme, että PDC voitaisiin rekrytoida suolistoon tulehduksellisten prosessien aikana vahvistamaan ensilinjan puolustusta. Koleratoksiinin (CT) tiedetään aiheuttavan suolitulehdusta suun kautta annettuna, ja on raportoitu, että 2 tunnin kuluessa suun kautta annetusta annostelusta suoleen ohimenevästi siirtyneen mDC: n määrä kasvaa 4-kertaiseksi (15). Havaitsimme, että mDC: n lisäksi pDC-luvut myös 3-kertaistuivat ruokittaessa B6-hiiriä 10 µg: lla CT: tä (Kuva. 4 E). On kiinnostavaa, että identtinen koeasetelma ei koskaan johtanut PDC: n lisääntymiseen sen enempää IE: ssä kuin LP-valmisteessakaan CCR9-puutteellisilla hiirillä 1, 2 tai 3 tunnin CT-hoidon jälkeen (kuva. 4 E ja tietoja ei näytetä). PDC: tä koskeva ccr9: n erityisvaatimus niiden rekrytoimiseksi suoleen tulehduksellisten prosessien aikana vahvistettiin siirtämällä WT: tä ja CCR9: n puutteellista pDC: tä ccr9: n puutteellisille vastaanottajille ja soveltamalla tämän jälkeen TT: tä edellä kuvatulla tavalla. Siinä missä adoptioon siirrettyjä WT-pDC: tä esiintyi runsaasti IE-ja LP-valmisteessa, CCR9-puutteellinen PDC jätettiin lähes kokonaan näiden osastojen ulkopuolelle (Kuva. 4 F). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että tulehdustapahtumien aikana PDC voidaan rekrytoida suolen limakalvolle ja että tämä mekanismi perustuu ccr9: ään.

suoliston pDC: n rooli LP-myelooisen DC: n nopeassa Mobilisaatiossa.

äskettäin on osoitettu, että tlr7 / 8 ligandiresikimodin (R848) oraalinen annostelu johtaa LP DC: n nopeaan mobilisaatioon ja että mahdollisesti PDC: n vapauttama TNFa on mukana tässä prosessissa (16). Arvelimme siis, että suoliston pDC saattaa olla TNFa: n lähde, joka mahdollisesti laukaisee viereisen MDC: n liikekannallepanon. Tämän hypoteesin testaamiseksi in vitro stimuloimme IE-ja LP-valmisteen B6 pDC: tä 16 tunnin ajan r848: lla. PDC eritti huomattavia määriä TNFa: ta, mutta ei tuottanut havaittavia määriä IL-2: ta, IL-4: ää, IL-5: tä tai IFNy: tä (Kuva. 5 A). Sitten analysoimme LP mDC: n mobilisaation in vivo r848: n oraalisen annostelun jälkeen. Kun taas käsittelemättömät B6− ja CCR9−/ – hiiret eivät poikenneet toisistaan suoliston mDC: n esiintymisen suhteen (kuva. 5 B), 2 tunnin kuluessa suun kautta annetulla R848: lla saatiin aikaan ≈60% MDC: stä WT: ssä mutta vain 10, 8% ccr9−/− hiirillä. Tärkeää on, että kun ccr9-puutteelliset hiiret i. v.saivat pernan pDC: n Flt3L-hoidetuilta WT-luovuttajilta 16 tuntia ennen suun kautta annettua r848: AA, tämä puute suoliston mDC-mobilisaatiossa voitiin pelastaa kokonaan (Kuva. 5 C). Nämä kokeet osoittavat, että ccr9-riippuvainen PDC: n kotiutuminen suoleen osallistuu suoliston mDC: n nopeaan mobilisaatioon tlr7/8-ligandin oraalisen levityksen jälkeen. Koska muut rotan mallissa ovat osoittaneet, että LPS: n käyttö saa aikaan myös LP mDC: n (17) mobilisaation, sovellimme 50 µg LPS: n i.p.: tä WT: n ja CCR9: n puutteellisiin eläimiin. Mielenkiintoista on, että näissä koe-olosuhteissa emme havainneet mitään eroa WT: n ja CCR9: n puutteellisten eläinten välillä LP mDC: n mobilisoinnin suhteen (SI Kuva. 9).