Abstrakti

jännitteellä gated L-tyypin Cav1.2 kalsiumkanavat pari kalvon depolarisaatio sytoplasmattoman Ca2+-pitoisuuden ohimeneväksi nousuksi, joka käynnistää useita olennaisia solutoimintoja, mukaan lukien sydämen ja verisuonten lihassupistus, geeniekspressio, hermosolujen plastisuus ja eksosytoosi. Kalsiumvirran inaktivointi tai spontaani Päättyminen cav1.2: n kautta on kriittinen vaihe näiden prosessien säätelyssä. Tämän prosessin patofysiologinen merkitys ilmenee verenpaineessa, sydämen vajaatoiminnassa, rytmihäiriössä ja useissa muissa sairauksissa, joissa kalsiumvirran hajoamisen kiihtymisen pitäisi olla hyötytoiminto. Keskeinen kysymys tässä asiakirjassa on inaktivointi cav1.2 kalsium kanava välittämä useita taustatekijöitä.

1. Introduction

the voltage-gated inward Ca2+ current () is a common mechanism of transient increase in sytoplasmic free Ca2+ concentration launched by cell depolarization. Tämä Ca2+ – signaloinnin muoto aktivoi olennaisia soluprosesseja , mukaan lukien sydämen supistuminen , sileän lihasäänen säätely , geeniekspressio, synaptinen plastisuus ja eksosytoosi . Ca2+ – soluvirtauksen täydellinen ja nopea Päättyminen välittyy monimutkaisella spontaanilla kalsiumkanavan inaktivointimekanismilla, joka on ratkaisevan tärkeää Ca2+-solun ylikuormituksen estämiseksi toimintakykypotentiaalien aikana ja solulimakalvoston soluliman vapaan Ca2+ – pitoisuuden palauttamiseksi . Tässä asiakirjassa keskitytään cav1.2-kalsiumkanavan inaktivaation molekyyliperusteisiin ja moninaisiin taustatekijöihin.

2. Cav1. 2: haasteet ja ratkaisut

2.1. Molekyylikompleksi

cav1.2-kalsiumkanava on oligomeerinen kompleksi, joka koostuu A1C -, α2δ-ja β-alayksiköistä . Ionikanava huokonen muodostuu cacna1c-geenin koodaamasta A1C-peptidistä (Kuva 1). Apuyksiköt β ja α2δ ovat välttämättömiä kanavan toiminnalliselle ilmentymiselle ja PLASMAKALVON (PM) kohdistukselle . Niitä esiintyy useissa genomisissa isoformeissa, joita tuottaa neljä cacnb-geeniä (CACNB1–4) ja kolme cacna2d–geeniä (CACNA2D1-3). Kaikkiin kolmeen alayksikköön sovelletaan vaihtoehtoista liitosta. Cav1.2-molekyyliorganisaation monimutkaisuuden lisäksi β-alayksiköt pyrkivät oligomerisoitumaan . Kaikki yhdessä, genomivaihtelu, vaihtoehtoinen liitos, ja hetero-oligomerisaatio tuottaa lukuisia cav1 .2 liitos variantteja, jotka ilmaistaan soluissa laji -, kudos -, ja kehitys-riippuvainen tavalla, kun taas muutos niiden hieno tasapaino voi olla merkittäviä patofysiologisia seurauksia.

2, 2. Haasteet isäntäsolun valinnassa

luonnossa esiintyvä cav1.2: n moninaisuus vaikeuttaa kotoperäisistä soluista saatavan datan tulkintaa saati yksikanavaista dataa. Tämän taustalla on cav1.2-Tutkimuksen merkitys rekombinanttiekspressiojärjestelmissä, joissa kanavan molekyylikoostumus ja sen ainesosien rakenne on ennalta määritelty. Tässä kokeellisessa lähestymistavassa oli kuitenkin ongelmana sopivan isäntäsolun valinta.

suurin osa kalsiumkanavia koskevista tutkimuksista tehtiin HEK293-soluilla. Nämä solut tarjoavat rekombinanttien Ca2+ – kanavien korkean ilmentymistehokkuuden, mutta valitettavasti sisältävät endogeenisiä kalsiumkanavia, joissa Ca2+ – virrat ovat jopa 3 pA / pF . Näin ollen hek293-solut mahdollistavat rekombinanttien Ca2+ – kanavien riittävän tutkimuksen vain silloin, kun virran amplitudi on tarpeeksi suuri, jotta endogeenisten kanavien osuus voidaan sivuuttaa. Ca2+ – kanavien toiminnallisten taustatekijöiden oikea arviointi edellyttää kuitenkin sellaisten isäntäsolujen käyttöä, joissa ei ole endogeenisia Ca2+ – kanavaalayksiköitä. COS1 – tai COS7-solut sopivat tähän vaatimukseen hyvin, koska ne eivät tuota merkittävää kalsiumvirtaa, eivät sisällä endogeenisia Ca2+ – kanavayksiköitä tai niiden esiasteita eivätkä indusoi endogeenisia cav1.2-alayksiköitä rekombinanttien ilmentymisen seurauksena . Cos1-soluissa mitattujen cav1.2-kanavavirtojen aktivoinnin ja inaktivoinnin kinetiikkaparametrit ja jänniteriippuvuus ovat yhdenmukaisia muista ilmentymisjärjestelmistä saatujen tietojen kanssa . Cos-solujen tärkeä etu on niiden suhteellisen hidas jakonopeus, joka mahdollistaa paremman kontrollin eri kokoisten cav1.2-kanavaisten alayksiköiden ilmaisun ja kokoonpanon tehokkuudesta.

2, 3. Fluoresoivien merkintöjen ja mittausten ongelmat

GFP: n kaltaisten fluoroforien fuusio rekombinantti a1C: n N-ja / tai C – terminiin tai β: n n-terminukseen ei merkittävästi muuta ilmentyvien kanavien elektrofysiologisia ominaisuuksia, mahdollistaa fluoresoivan ja FRET-mikroskopian (fluoresoivan resonanssienergiansiirron) soveltamisen cav1.2: n subsellulaarisen jakautumisen ja kokoonpanon tutkimiseen sekä kanavan molekyyliarkkitehtuurin ja dynamiikan monimutkaisiin näkökohtiin. Kanava säilyttää tärkeimmät elektrofysiologiset ominaisuudet muuttumattomina, kun distaalisten eksonien 46-50 koodaama A1C C-terminaalinen sekvenssi (Kuva 1, jäämät 1833-2138 kohdassa A1C,77) korvataan ECFP: llä. N – tai/ja C-Terminin eyfp: hen fuusioima a1C on kuitenkin erittäin herkkä valoherkistymiselle, joka peruuttamattomasti inaktivoi sen. Tunnetaan fluorofore-avusteinen valo inaktivointi (FALI), tämä mielenkiintoinen ominaisuus rajoittaa sovellettavuutta acceptor photobleaching mittauksiin tuskailla cav1.2 koska epävarmuus toiminnallinen tila kanavan . A1C-ja/tai β-alayksiköiden häntiin fuusioitujen fluoroforeiden välisen korjatun tuskan ratiometrinen analyysi heijastaa kuitenkin kanavan palautuvia tilariippuvaisia rakenteellisia uudelleenjärjestelyjä, jotka johtuvat transmembraanijännitteen muutoksista patch clampin alla .

2, 4. Rekombinantti Cav1. 2: Mitä se tarvitsee toiminnalliseen ilmaisuun ja miten se näkyy?

”villin tyypin” rekombinantin Cav1.2 tyypillisiä ominaisuuksia havainnollistetaan kuvassa 2(A) Käyttäen esimerkkinä ihmisen kaikkialla esiintyvää A1C,77-isoformia (GenBank no. z34815). Kun EYFP-merkitty a1C ilmaistiin pelkissä COS1-soluissa, fluoresoiva merkitty kanavaproteiini jakautui diffusaalisesti sytoplasmaan eikä tuottanut mitattavissa olevaa kalsiumvirtaa (kuva 2(A), paneeli a). Kvantitatiivinen analyysi A1C: n jakautumisesta PM: n ja sytoplasman välillä (Kuva 2 B) vahvisti, että A1C ei kohdistanut merkitsevästi PM: ää itsenäisesti α2δ: n(baarit A ja b) esiintymiseen. Cavß: n ilmentyminen α2δ: n puuttuessa kiihdytti A1C: n HIUKKASTAVOITTELUA, mutta kanava pysyi äänettömänä (kuva 2(A), paneeli c), ellei α2δ: ää koekspressoitu (paneeli d). Siten β-ja α2δ-alayksiköt riittävät funktionaaliseen kanavaan; näissä kokeellisissa olosuhteissa β-alayksiköt stimuloivat KANAVAKOMPLEKSIN HIUKKASTAVOITTAMISTA ja α2δ läsnä ollessa helpottavat cav1.2-kanavan jännitteen gatointia.

kuvassa 2(A) (paneeli d) esitetyn kalsiumpitoisuuden huippuvirran muoto ja ulkonäkö on melko tyypillinen β2-moduloidulle Cav1.2: lle . Sen tärkeimmät ominaisuudet ovat suhteellisen hidas rappeutuminen ja suuri osa jatkuva jäljellä loppuun depolarisoiva pulssi . On selvää, että pitkäaikaisten vaikutusmahdollisuuksien aikana tällaiset ominaisuudet voivat johtaa patogeeniseen kalsiumin ylikuormitukseen solussa, jos sitä ei tasapainoteta vahvoilla kompensoivilla mekanismeilla. Se oli cav1: n lopullinen rooli.2 määriteltäessä sydänsolujen toimintakyvyn kestoa, joka laukaisi kalsiumkanavan salpaajien tutkimuksen ja kehityksen, lääkeryhmän, jolla on nyt miljardin dollarin markkinat. Juuri tämä Cav1.2: n rooli herättää nykyisen kiinnostuksen cav1.2: n inaktivaatioon vaikuttavien molekyylitekijöiden tunnistamiseen siinä toivossa, että löydettäisiin tarkempia ja tehokkaampia lääkkeitä.

2, 5. Viimeisenä mutta ei vähäisimpänä komplikaationa: Cav1. 2 ryhmittely

yksittäinen kammiosykyytti sisältää ~300 000 cav1.2-kanavaa, mutta vain ~3% kanavista on auki huipussaan . Toisin kuin yleisesti luullaan, cav1.2-kanavat eivät jakaudu tasaisesti plasman kalvolle. Kotoperäisissä hermo-ja sydänlihassoluissa ne muodostavat suuria klustereita. Funktionaalisten rekombinanttien eyfpn-a1C/ß2a/α2δ-kanavien yksimolekyylinen kuvantaminen ilmaistuna HEK293-soluissa paljasti klustereita, jotka koostuivat ~40 kanavasta, jotka liikkuivat plasmakalvossa . Sekä fluoresenssikorrelaatiospektroskopia että fluoresenssin talteenotto fotobleaching-kokeiden jälkeen tuottivat sivusuuntaisen diffuusiovakion µm2/s. cav1.2-klusterien liikkuvuuden toiminnallinen merkitys ei ole selvä. Uskotaan, että sydänlihassoluissa tällaista liikkuvuutta voivat rajoittaa vuorovaikutukset muiden proteiinien, esimerkiksi ryanodiinireseptorien kanssa . Cav1.2-klusterien koko ja niiden spesifinen tiheys plasmakalvossa riippuvat ilmaistusta β-alayksikön tyypistä . Naapureiden A1C-alayksiköiden termiinin välinen etäisyys vaihtelee 67 Å: sta neuronaalisen/sydämen ß1b: n ja 79 Å: n välillä verisuonten β3: n kanssa. Kaikkein tiheimmät cav1.2-klusterit plasmakalvossa ja pienin klusterikoko havaittiin ß1b: n läsnä ollessa. Cav1.2-klusterien arkkitehtuuria ja ominaisuuksia määrittävien molekyylimekanismien ymmärtäminen on tärkeää, jotta voidaan paremmin ymmärtää cav1.2-aktiivisuuden ja Ca2+ – signaalin transduktion indusoitujen vasteiden välisen kytkennän patofysiologiaa.

3. Cav1.2 – kalsiumkanavan jännite-ja Ca2+ – riippuvainen inaktivaatio

cav1.2-kalsiumkanavan tapauksessa Ca2+ – virran inaktivaatiota ohjaa kaksi eri mekanismia. Yhtä mekanismia ohjaavat Ca2+ – ionit plasmakalvon sytoplasmapuolella, kun taas toinen riippuu transmembraanijännitteestä. Kokeellisesti Ca2+: n korvaaminen ba2+: lle varauskantajana poistaa Ca2+-riippuvaisen inaktivaation (CDI) siten, että Ba2+-johtoiset kalsiumkanavat inaktivoituvat jänniteriippuvaisesti nopeiden (FI) ja hitaiden (SI) mekanismien avulla . Nämä kolme inaktivointimekanismia, FI, SI ja CDI, ja niiden tärkeimmät taustatekijät esitetään kuvassa 3.

3.1. Ca2+ – riippuvainen inaktivaatio ja A1c: n Kalmoduliinia sitova domeeni

on olemassa useita eri CDI: n determinantteja, mutta vasta vuonna 1997 CDI: n Ca2+-aistiva kohta oli rajattu eksonien 40-42 (kuva 2) koodaaman A1C: n 80-aminohapon C-terminaalisen sekvenssin jaksoon, joka on merkitty punaisella lohkolla Kuvassa 3(A) (paneeli a). Luonnossa esiintyvä liitosvaihtelu tällä alueella A1C,86: ssa(kuva 3 (B)) esti CDI: n täysin, koska se ilmenee virran hidastuvuuden puuttumisesta ba2+: n ollessa varauskantajana (paneeli c, musta jälki) verrattuna (punainen jälki). Toinen estetyn CDI: n ominaispiirre oli jännitteen (kuva 3 B, paneeli d, avoimet symbolit) virtakokoriippuvuuden puute, joka pysyy vastakohtana nopean inaktivaation aikavakion () U-muotoiselle riippuvuudelle kalvopotentiaalista villityyppisessä Cav1.2: ssa (KS.kuva 3 A, paneeli d). Tämän 80 aminohapon pituudelta tunnistettiin kaksi erillistä sekvenssiä, L ja K, joiden A1C , 86: n kaltaiset mutaatiot villissä A1C-tyypissä noudattavat samoja ominaispiirteitä, mikä viittaa kahden vierekkäisen CDI-anturin olemassaoloon. Yksi niistä hahmoteltiin K-alueella kalmoduliini – (CaM -) sitovaksi IQ-motifiksi ja myöhemmin IQ Motifin yhteys CDI: hen funktionaalisena Ca2+ – CaM-sidontapaikkana vahvistettiin kolmessa riippumattomassa tutkimuksessa käyttämällä CaM-mutantteja, joilla ei ole affiniteettia Ca2+: aan. Vastaavasti LA motif liitettiin CDI: hen apo-CaM-sidontapaikkana, joka on kanavan lepotilan turvaama. Tähän A1c: n Ca2+-riippuvaiseen CaM-sidosdomaaniin (CBD) kiinnittynyt yksittäinen CaM-molekyyli on kanavan tärkein Ca2+ – anturi .

A1c: n Liitosvaihtelu A1C: n CBD-alueella 86 ei ainoastaan estä täysin CDI: tä,vaan myös poistaa si: n (kuva 3 B, paneeli c) ja riistää kanavan differentiaalisen herkkyyden β-alayksikön modulaatiolle(kuva 3 B, paneeli e) huolimatta siitä, että β liittyy edelleen A1C: hen,86 (kuva 3 B, paneeli B). Tämä osoittaa, että kaikki kanavan kolme ominaisuutta—CDI, SI ja β-alayksikkö modulaatio—liittyvät toisiinsa .

3, 2. Hidas inaktivaatio

on esitetty useita todisteita siitä, että A1C: n S6-segmenttien distaaliseen osaan rajoittuvilla aminohapoilla on tärkeä rooli SI: ssä . Systemaattinen tutkimus tällä alueella hahmotteli ”hitaan inaktivaation vuosittaista determinanttia” (ADSI) rakenteena, joka koostuu neljästä erittäin säilyneestä aminohaposta, joiden neljä transmembraanisegmenttiä S6 muodostavat huokospään sytoplasmapään(kuva 3 A, paneeli a). Niiden samanaikainen mutaatio (S405I is6: ssa, A752T IIS6: ssa, V1165T IIIS6: ssa ja I1475T IVS6: ssa) synnyttää A1C: n, IS-IV-kanavan. A1C: n IS-IV-kanavan nykyisen kinetiikan analyysi osoitti,että nopeasti inaktivoiva komponentti ( ≤ 10 ms) kiihtyy valtavasti, mikä käsittää noin 50% kokonaisamplitudista (tai). Hidas jänniteriippuvainen inaktivointi a1C, IS-IV on täysin estynyt, ja kanava pysyy johtavana depolarisaation ajaksi. Ca2+: n korvaaminen ba2+: lle varauskantajana (paneeli c) ei muuttanut merkittävästi tätä inaktivointimallia, kun taas jänniteriippuvuuden analyysi A1C: n kautta olevan inaktivoivan komponentin is-IV-kanavasta (paneeli d) vahvisti CDI: n puutteen. ß1a: n korvaaminen ß2a: lla (paneeli e) ei muuttanut a1C: n inaktivaatiota,IS-IV-kanavavirtaa, mikä viittaa β-alayksikön differentiaalisen modulaation puuttumiseen,kun taas rinnakkaisimmunopresipitaatioanalyysi (paneeli b) antoi suoraa näyttöä A1C: n, IS-IV: n ja β: n välisestä assosiaatiosta.

yhdessä kuvassa 3 esitetyt tulokset viittaavat siihen, että ADSI: n, CBD: n ja β: n välillä on ristipuhe, jota tukevat niiden väliset suorat vuorovaikutukset ja / tai huokosten taustalla olevan polypeptidikimpun aineosien erityinen konformaatio. Sekä β: n ja CBD: n yhteisvaikutus että funktionaalisen konformaation merkitys osoitettiin suoraan rekombinantti Cav1.2: ta ilmentävissä elävissä soluissa.

3, 3. Rooli A1c C-tail taitto

kvantitatiivinen JÄNNITERIIPPUVAINEN OTELIKROSKOPIA yhdistettynä laastari puristin elävässä solussa osoitti, että A1C alayksikkö C-terminaali häntä on alttiina reversible jännite-gated konformaatio uudelleenjärjestelyt . A1C C-pyrstön kiinnittyminen plasmakalvon sisempään pakkausselosteeseen pleckstriinihomologian (PH) domeenin kautta,joka on fuusioitu A1C: n (a1C -) C-terminaaliin, poisti tämän konformaation uudelleenjärjestelyn ja esti sekä SI: n että CDI: n(kuva 4 A)) hyvin samalla tavalla kuin A1C: n kohdalla, IS-IV (kuva 3 c)). Tällä a1C-karboksyyliterminaalin liikkuvuutta rajoittavalla muutoksella oli merkittävä vaikutus Ca2+ – signaalin transduktioon. CREB-riippuvainen transkriptioaktivaatio, joka liittyi cav1.2: n aktiivisuuteen, tukahdutettiin täysin huolimatta vankkarakenteisesta ”C-ankkuroidun” kanavan tuottamasta reaktiosta depolarisaatioon. A1C C-pyrstön vapautuminen PIP2-hydrolyysin aktivoituessa fosfolipaasi C: n aktivoituessa palauttaa täysin kaikki nämä puutteelliset toiminnot, mukaan lukien SI, CDI ja CREB-riippuvaisen transkription tehokas kytkeminen . Siten juuri A1C C-terminaalin hännän erityinen toiminnallinen taittuminen on ratkaisevan tärkeää inaktivoinnin kannalta. Se on ratkaisevan tärkeää signaalin transduktiolle, koska se on suunniteltu häkittämään CBD: hen kiinnitetty Läpitunkeva Ca2+ CaM ja siirtämään tehokkaasti tämä Häkkinen Ca2+ loppupään signalointikohteisiin, jotka liittyvät CREB-riippuvaiseen transkriptioon tai sydänlihaksen supistumiseen . Ennen kaikkea tämä toiminto tapahtuu tiiviissä koordinaatiossa solunulkoisten ärsykkeiden aktivoidessa kanavaa. Signaalin muuntamisen kannalta SI on kanavan sisäpuolella oleva lukko, jonka läpäisevä Ca2+ vapauttaa nopeuttamaan sen sulkeutumista ja käynnistämään C-terminaalin hännän liikkeen .

3, 4. A1C n-terminaalin rooli

kaikki edellä mainitut funktiot riippuvat myös A1C n-terminaalin eheydestä. Rekombinantti A1C / β / α2δ-kanavan inaktivaatio-ominaisuudet eivät suuresti muutu A1C n-hännän proksimaalisen osan rakenteellisilla muutoksilla, esimerkiksi fluoresoivan proteiinin fuusioitumisella, PH-domeenilla tai vaihtoehtoisella eksonien 1/1a liittämisellä , jolloin muodostuu A1C: n pitkä isoformi . Ensimmäinen funktionaalinen analyysi A1C N-terminaalin osittaisen poiston vaikutuksesta osoitti, että se osallistuu inaktivaatioon, kun taas β estää kanavan eston n-pyrstöllä. Käyttämällä FRET-mikroskopiaa yhdistettynä patch clampiin huomasimme, että inaktivaatio aiheuttaa A1C: n ja ß1a NH2-Terminin voimakkaan keskinäisen uudelleensuuntautumisen, mutta niiden etäisyys plasmakalvoon ei merkittävästi muutu . Tämä suhteellinen liikkuvuuden puute johtuu β tavalla, joka helpottaa kanavan vastetta jännitteen gating. Kokeet A1C-alayksikön N-terminaalisen pyrstön irrottamiseksi kanavan säätelystä tehtiin β: n puuttuessa. A1C N-pyrstön kiinnitys plasmakalvon sisäselosteeseen kiinnitetyn PH-verkkotunnuksen kautta loi olosuhteet, joissa PHN-a1C ja α2δ riittivät tuottamaan vahvan sisäisen virran(Kuva 4 B). Tällä kanavalla ei kuitenkaan ole CDI: tä eikä jänniteriippuvaista inaktivaatiota. Itse asiassa Ba2+ eikä Ca2+ – virta eivät ole osoittaneet huomattavaa hajoamista (katso päällekkäiset jäljet). A1C N-hännän vapautuminen PIP2-hydrolyysin yhteydessä fosfolipaasi C: n aktivoituessa esti β-puutteellisen kanavan täysin . Samanlaisia ominaisuuksia, lukuun ottamatta virran paljon hitaampaa aktivaatiota, havaittiin poistettaessa A1C: n koko n-terminaalinen pyrstö (mutta 4 aminohappoa) (Kuva 4(C)). Jommassakummassa A1C N-terminaalin pyrstön irrotustyypissä—joko poistolla tai PM—ankkuroinnilla-kokosoluvirran aktivoitumisen viivästyminen näyttää liittyvän ensimmäisen latenssin pidentymiseen. Yksikanavaiset tallenteet paljastivat, että n-pyrstön poisto käytännössä vakautti ΔN-a1C/α2δ-kanavan avoimen tilan, joka osoitti pidempiä aukkoja pitkäkestoisen depolarisaation aikana .

CDI: n välittäjinä ovat siis A1C: n C-hännän CBD – taustatekijät, SYTOPLASMAHUOKOSALUEEN ADSI ja A1C: n C-ja N-Terminin taittuminen. Kalmoduliini yhdistää nämä taustatekijät ja tarjoaa Ca2+-riippuvaisen kytkimen, joka lopettaa hitaan inaktivaation, vapauttaa A1C C-hännän ja sukkuloi siihen liittyvän Ca2+/kalmoduliinin, joka toimii Ca2+ – signaalin transduktion aktivoivana ärsykkeenä .

3, 5. Cav1.2: n ilmentyminen ja Inaktivoituminen β: n ja α2δ

puuttuessa ovatko β-ja α2δ-alayksiköt välttämättömiä cav1.2-kanavan funktionaaliselle ilmentymiselle? Eksogeenisen CaM: n (CaMex) vaikutusten analysointi cav1.2: n ilmentymiseen ja ominaisuuksiin β: n tai α2δ: n puuttuessa osoitti selvästi, että β ja α2δ eivät ole välttämättömiä. Camexin yliekspressio muuttaa vain hieman A1C/ß2d/α2δ-kanavan jännitteen gatointia siirtämällä aktivoinnin ja inaktivoinnin jänniteriippuvuutta kohti enemmän negatiivisia potentiaaleja, helpottaen (mutta ei nopeuttaen) inaktivaatiota ja kasvattaen tiheyttä noin 2-kertaiseksi . CDI säilyy, koska on ilmeistä, että Ca2+: n korvaaminen ba2+: lla laturin kuljettajana lisäsi merkittävästi virran inaktivointiaikaa (kuva 5 A)). Uusi käsitys β: n ja α2δ: n rooleista tulee siitä, että CaMex antaa A1C-kanavan ilmaisun ja toiminnan ilman β: ta (kuva 5 B) tai α2δ: a(Kuva 5 C)), mutta ei kumpaakaan näistä apualayksiköistä. Vaikka CaMex ei ole rakenteellisesti yhteydessä β – ja α2δ-tuotteisiin, se tukee ihmiskauppaa, CDI: tä ja channel gatingia. Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että CaMex ei stimuloinut A1C: n uudelleenjakautumista PM: ssä sytoplasmassa, vaan paransi merkittävästi A1C/α2δ-kanavien plasmakalvon kohdistusta. Toisaalta CaMex ei tehostanut A1C/ß2d-ja A1C/ß2d/α2δ-kanavien suhteellista jakautumista plasmakalvossa sytoplasman yli. Näin ollen CaMex-tuettua kanavaaktiivisuutta a1C/ß2d ja A1C/α2δ valvovat eri mekanismit apualayksiköstä riippuen. Tästä huolimatta CaMex-fasilitoiduilla, yhden apualayksikön kanavilla on melko samanlaisia ominaisuuksia, kuten huomattavasti hitaampi kalsiumvirran inaktivointikinetiikka ja aktivoinnin ja inaktivoinnin jänniteriippuvuuden voimakas siirtyminen kohti negatiivisempia potentiaaleja. Kuten perinteiset A1C / ß2d / α2δ-kanavat, nämä kanavat säilyttävät CDI: n ja suuren herkkyyden dihydropyridiini-kalsiumkanavan salpaajille . Kuitenkin vain A1C/β / CaMex-kanava näyttää kalsiumvirran helpottamista voimakkaalla depolarisaatio-prepulsella (tietoja ei näy).

koska CBD: hen liittyvä CaM on mukana CDI: ssä, on selvää, että Camexin vaikutus välittyy eri CaM-sitomiskohtien kautta. Yksi tällaisen paikan mahdollisista ehdokkaista on A1C N-terminaalisen pyrstön distaalisessa osassa . Jää nähtäväksi, onko tällä sivustolla Todella integroiva rooli useiden cav1.2-inaktivaatiota tukevien molekyylitekijöiden sääntelykimpussa. Toinen mahdollisuus rajoittaa Camexin rooli hiljaisen Cav1: n aktivointiin.2 suurissa klustereissa, joissa CaM: n rajallinen paikallinen saatavuus voi olla 2.5 kohdassa kuvatun murto-osan vähäisen aktiivisuuden syynä. Riippumatta mekanismeista, jotka liittyvät cav1.2: n säätelyyn CaM: n toimesta, niillä näyttää olevan vain vähän käytännön vaikutuksia käytettäväksi lääketieteessä tällä hetkellä juuri siksi, että CaM on ubiquitous ja monitoiminen peptidi, joka säätelee monia muita solutoimintoja, kun taas sen läsnäolo Cav1.2: ssa on elintärkeää CDI: lle.

4. β-alayksikkö modulaatio Cav1.2

β-alayksiköiden huomattava molekyylivaihtelu , joka näkyy eri tavoin moduloidun Cav1.2: n muuttuneina inaktivointiominaisuuksina, esimerkkinä Kuvassa 3 A(paneeli e), tarjoaa uuden mahdollisuuden kehittää innovatiivisia lähestymistapoja Ca2+ – alayksiköiden hoitoon liittyvien sairauksien hoitoon. Useat viimeaikaiset havainnot antavat perustan tällaiselle optimistiselle näkemykselle. Ensinnäkin β-alayksiköillä on taipumus muodostaa homo-ja heteroligomeerejä, mikä osoitettiin suoraan erilaisilla biokemiallisilla tekniikoilla sekä alkuperäisissä soluissa että rekombinanttisessa ekspressiojärjestelmässä. Vaikka β-homooligomerisaation lisääminen lisää merkittävästi tiheyttä, β2-liitosvarianttien heterooligomerisaatio muiden β-alayksiköiden kanssa voi myös muuttaa cav1.2: n jänniteriippuvuutta ja inaktivointikinetiikkaa . Β-oligomerisaatio välittyy useiden molekyylien determinanttien kautta, minkä vuoksi tarvitaan useita interventioita hallittavaksi esimerkiksi β2: n patogeenisen yliekspression tapauksessa. Β2 – spesifisen hitaan ja epätäydellisen inaktivaation molekylaarinen determinantti(KS.kuva 2 A, paneeli d) tunnistettiin 40-aminohapon C-terminaaliseksi determinantiksi (ß2CED), joka esiintyy kaikissa 7 tunnetussa luonnossa esiintyvässä β2-liitosvariantissa. Sen Ca2+- ja CaM-riippumattoman vuorovaikutuksen irrottaminen CBD: n kanssa (kuva 3(A), paneeli a) palauttaa ß1b/β3-moduloidulle Cav1.2: lle ominaiset inaktivointiominaisuudet , jotka osoittavat nopean ja täydellisen inaktivoitumisen, kuten poistokokeissa osoitettiin. Mielestäni tällainen ß2CED: n valikoiva irrottaminen sitoutumasta CBD: n reseptoriin on uusi houkutteleva strategia Ca2+ – ylikuormituksen hallitsemiseksi, koska muut β-alayksiköt eivät saa vaikuttaa. Lisäksi cav1.2: n ja lähimmän kohde-Ca2+/CaM-riippuvaisen proteiinikinaasi II: n välillä säilyy ristipuhe.

5. Päätelmät

tämä paperi on osoittanut, että osaamme nopeuttaa Cav1.2: n inaktivoitumista alle 10 ms: iin (kuva 3(C)), estää sen inaktivoitumisen kokonaan (kuvat 4(B) ja 4(C)) tai poistaa sen ilmentymisen riippuvuuden β: sta tai α2δ: sta ilman merkittäviä vaikutuksia inaktivaatioon. Hahmotimme A1C Terminin ja CaM: n perimmäiset roolit inaktivoinnissa, ja silti mikään näistä tutkimuksista ei ole tuonut meitä yhtään lähemmäksi lopullista tavoitetta hallita cav1: een liittyvää kalsiumin väärinkäsittelyä.2 paitsi vanhat ja valitettavasti liian selektiiviset kalsiumkanavan salpaajat. Ainoa Uusi mahdollinen kohde on cav1.2: n patogeeninen β2-modulaatio, jossa efektori-reseptori-vuorovaikutus on todettu.

molekyylibiologian kannalta cav1.2 on varmasti monimutkaisimpia tunnettuja säätelyjärjestelmiä. Merkittävä molekyyli monimuotoisuuden kunkin Cav1.2 osatekijät aiheuttavat useita geneettisiä / liitosvariantteja kanavan, jotka ovat alttiita eriytyminen suuria ja erilaisia klustereita ja jatkuva toiminnallinen muutos kautta homo – ja heterooligomerisaatio β ja muut signalointi komponentit, puhumattakaan lajeista, kudos, ja kehityshäiriöitä vaihtelua. Olemme yllättyneitä useiden cav1.2-isoentsyymien ominaisuuksien redundanssista ja olemme vieläkin yllättyneitä, kun jotkut niistä, jotka osoittavat vain ”tavanomaisia” elektrofysiologisia ominaisuuksia, osoittautuvat liittyvän sairauteen . Etsiessämme selitystä meidän ei tulisi intuitiivisesti keskittyä pelkästään kalsiumvirta-jänniteriippuvuuden, amplitudin ja keston ominaisuuksiin. End vastaus, kuten Spatiaalinen ja ajallinen organisointi CREB signalointi tapahtumia liittyy erityisiä Cav1. 2 isoform , ja sen kilpailu muiden (esim, cAMP riippuvainen) signalointi mekanismit, tai muut cav1.2 isoforms läsnä, voi tarjota uusia ideoita ja avata uusia rajoja tutkimukselle rooleja yksittäisten Cav1.2 liitos variantteja normaaleissa ja sairaiden solujen ja kudosten.

Abbreviations