Abstrakti
Candidan eristämiseksi suuontelosta on käytettävissä erilaisia tekniikoita. Tällaisilla menetelmillä on tärkeä rooli suun candidoosin diagnosoinnissa ja hallinnassa. Candidan kasvava merkitys liittyy osittain HIV-infektion syntyyn ja immunosuppressiivisen kemoterapian yleistymiseen. Yhdessä Candida albicans on ollut enemmän tunnustusta merkitystä nonalbicans Candida lajien suullinen candidosis. Tartuttavien Candida-kantojen tunnistaminen on tärkeää, koska Candida-lajien isolaatit eroavat toisistaan suuresti sekä kyvyssään aiheuttaa infektioita että alttiudessaan sienilääkkeille. Näin ollen tämä katsaus tarjoaa yleiskatsauksen luotettaviin menetelmiin, joilla eristetään ja tunnistetaan isolaatit suuontelosta.
1. Johdanto
termi Candida on peräisin latinan sanasta candid, joka tarkoittaa valkoista. Candidan itiöt ovat dimorfisen sienen yhteismitallinen, vaaraton muoto, josta tulee invasiivinen ja patogeeninen pseudohyphae, kun kasviston tasapainossa tai isännän heikentymisessä on häiriöitä .
tämän endogeenisen vastaavuuden muuntuminen tautia aiheuttavalle Loiselle voi liittyä muihin tekijöihin kuin itse organismin patogeenisiin ominaisuuksiin, mikä on melko ainutlaatuista verrattuna useimpiin muihin tartuntatauteihin, joissa patogeneesin avaintekijänä pidettyjen organismien virulenssi. Siksi Candida-lajit ovat ehdottoman opportunistisia. Voidaan todeta, ettei Candida-infektioiden pinnallisia eikä systeemisiä muotoja voida aloittaa ilman taustalla olevaa patologiaa .
Candida-lajeja on monia (Taulukko 1), mutta yleisin, joka otetaan talteen suuontelosta sekä yhteismitallisina että suun candidoositapauksissa, on C. albicans. Tämän lajin osuus kaikista suun kautta otettavista hiivan isolaateista on arviolta yli 80 prosenttia.
Candida albicans
Candida glabrata
Candida dubliniensis
Candida guilliermondii
Candida krusei
Candida lusitaniae
candida parapsiloosi
Candida tropicalis
candida kefyr
viime vuosina kiinnostus opportunistisen patogeenin Candidan aiheuttamiin infektioihin on lisääntynyt. Candidan kasvava merkitys liittyy osittain HIV-infektion syntyyn ja immunosuppressiivisen kemoterapian yleistymiseen . Tartuttavien Candida-kantojen tunnistaminen on tärkeää, koska Candida-lajien isolaatit eroavat toisistaan suuresti sekä kyvyssään aiheuttaa infektioita että alttiudessaan sienilääkkeille .
yhdessä C. albicansin kanssa on tunnustettu paremmin muiden kuin albicans-Candida-lajien merkitys ihmisen taudissa. C. glabrata ja C. kruseit ovat lajeja, jotka ovat saaneet huomiota, koska niiden vastustuskyky tiettyjä sienilääkkeitä vastaan on parantunut. C. dubliniensis on hiljattain tunnistettu patogeeninen laji, joka kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1995, kun se yhdistettiin C. albicansin kanssa HIV-tartunnan saaneiden henkilöiden suullisesta candidoosista .
tässä katsauksessa esitetään yleiskatsaus luotettaviin menetelmiin, joilla eristetään suuontelossa olevat isolaatit ja tunnistetaan ne.
2. Candidan patogeeniset ominaisuudet
Candidan siirtyminen vaarattomasta yhteismitallisesta patogeeniseksi organismiksi on monimutkaista ja liittyy hienovaraisiin ympäristömuutoksiin, jotka johtavat useiden virulenssitekijöiden ilmenemiseen (Taulukko 2). Se on sekä isäntä-että kandidaattitekijöiden yhteisvaikutus, joka lopulta edistää suun candidoosin kehittymistä .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
kandidoosin tyypistä riippumatta Candida-lajien kyky säilyä terveiden yksilöiden limakalvoilla on tärkeä virulenssiin vaikuttava tekijä. Tämä on erityisen tärkeää suuontelossa, jossa eliö joutuu vastustamaan mekaanista pesutoimintaa, kun sylki virtaa suhteellisen jatkuvasti kohti ruokatorvea .
Candidalle ei ole tunnistettu yhtä vallitsevaa Virulenssitekijää, vaikka on olemassa useita tekijöitä, joiden on osoitettu edistävän infektioprosessia. Näitä ovat Candidan tarttumiseen suun pinnoille liittyvät ominaisuudet (esim. suhteellinen solupinnan hydrofobisuus ja spesifisten adhesiinimolekyylien läsnäolo), kyky vastustaa isännän immuunipuolustusmekanismeja (esim. suurtaajuinen fenotyyppinen vaihto ja morfologinen siirtyminen) ja hydrolyyttisten entsyymien vapautuminen (esim., erittyy aspartyyliproteinaaseja ja fosfolipaaseja), jotka voivat aiheuttaa vaurioita isäntäsoluissa .
3. Oraalinen kandidoosi
Samaranayake ehdotti luokittelua, jossa oraalisen kandidoosin leesiot jaettiin kahteen pääryhmään: ryhmään I eli ensisijaisiin suun kandidooseihin, jotka rajoittuivat suuontelossa sijaitseviin leesioihin, joihin ei liittynyt ihoa tai muita limakalvoja; ryhmään II tai toissijaisiin suun kandidooseihin, joissa leesioita esiintyy sekä suun että suun ulkopuolisissa paikoissa, kuten ihossa (Taulukko 3). Ryhmä I vauriot koostuvat klassinen triad-pseudomembranous, erythematous, ja hyperplastinen variantit—ja jotkut ovat ehdottaneet edelleen jako jälkimmäisen osaksi plakin kaltainen ja nodulaarinen tyyppejä .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Oraalisen Kandidoosin diagnoosi
oraalisen kandidoosin diagnoosi voidaan usein tehdä kliinisten ominaisuuksien perusteella, vaikka mikrobiologiset näytteet olisi mahdollisuuksien mukaan otettava Candidan tunnistamiseksi ja kvantifioimiseksi sekä isolaattien saamiseksi sienilääkkeiden herkkyystestausta varten.
5.
Candidan eristämiseen suuontelossa käytettävissä olevia menetelmiä ovat preparointi , tavallinen vanupuikko , leimaviljelmä , koko syljen kerääminen , tiivistetty suuhuuhtelu ja limakalvobiopsia. Kullakin menetelmällä on erityisiä etuja ja haittoja, ja näytteenottotekniikan valintaan vaikuttaa ensisijaisesti tutkittavan vaurion luonne (Taulukko 4). Jos mahdollinen ja määritelty vaurio on ilmeinen, suositellaan usein suoraa näytteenottotapaa, kuten pyyhkäisynäytteen tai muistijäljen käyttöä, koska näin saadaan tietoa itse leesiossa esiintyvistä organismeista. Tapauksissa, joissa ei ole selviä vaurioita tai joissa leesioon on vaikea päästä, sylkinäytteiden viljelyyn perustuva epäsuora näyte tai suun kautta suoritettava huuhtelu on hyväksyttävämpää.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Sienikuormituksen kvantitatiivinen arviointi voidaan tehdä käyttämällä painatuksia, tiivistettyä oraalista huuhtelua ja oraalisen huuhtelun viljelyä, jotta voidaan erottaa suhteellinen kulkeutuminen ja patogeeninen oraalinen Candida, kun viimeksi mainitussa suurempina kuormituksina pidetään todennäköisenä .
6. Suora mikroskopia
Candida-lajien morfologiset piirteet (Taulukko 5) on tutkittava tunnistamista varten. Preparaatti on arvokas hiivan ja hyphal-muotojen erottelussa, mutta se ei ole yhtä herkkä kuin Kulttuuriset menetelmät . Näytteen kaliumhydroksidi (KOH) – valmiste paljastaa pigmentittömän septaattihyphaen, jolla on tyypillinen dikotominen haarautuminen (noin 45° kulmassa) . Koh-Calcofluorissa fluoresoiva tahra-menetelmä sieniominaisuudet, kuten hyphae, hiivasolut ja muut sieni-elementit, fluoresoivat .
|
||||||||||||||||||||||
lesionalisesta kohdasta otettu preparaatti kiinnitetään mikroskooppilevyihin, minkä jälkeen se värjätään joko gram-värjäyksellä tai periodic acid Schiff (pas) – tekniikalla. Näitä menetelmiä käyttäen hapanviiva ja hiivat ovat joko tummansinisiä (Gram-stain) tai punaisia/violetteja (PAS) .
kroonisessa hyperplastisessa kandidoosissa leesiosta on otettava koepala, jotta voidaan myöhemmin todeta Candidan tunkeutuminen histologisella värjäyksellä käyttäen joko PAS-tai Gomorin metenamiinihopeatahroja. Demonstrointi sienielementtien sisällä kudoksissa tehdään, koska ne värjätään syvästi nämä tahrat. Läsnäolo blastospores ja hyphae tai pseudohyphae voi mahdollistaa histopatologist tunnistaa sienen lajina Candida ja, koska läsnä on muita histopatologisia ominaisuuksia, tehdä diagnoosi krooninen hyperplastinen candidosis .
7. Laboratorioviljelmä
7. 1. Vanupuikko
lesionaalisesta kohdasta on suhteellisen yksinkertainen menetelmä kasvun toteamiseksi, ja Candidan puolikvantitatiivinen estimointi voidaan saada. Näytteenotossa hierotaan varovasti steriiliä pumpulipuikkoa lesional-kudokseen ja siirrostetaan sen jälkeen ensisijainen eristysaine, kuten Sabouraud ’ s dekstrose agar (SDA) .
7, 2. Tiivistetty oraalinen huuhtelu
suun kautta tapahtuvassa huuhtelussa potilas pitää 10 mL: aa steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (0, 01 M, pH 7, 2) suussa 1 minuutin ajan. Tämän jälkeen liuos väkevöidään (10-kertaiseksi) sentrifugoimalla ja tunnettu tilavuus, yleensä 50 µL, inokuloidaan agar-elatusaineeseen spiraalipinnoitusjärjestelmän avulla. 24-48 tunnin inkubaation jälkeen 37°C: ssa kasvu arvioidaan pesäkkeiden lukumäärän perusteella ja ilmaistaan kandidaattipesäkkeitä muodostavina yksikköinä huuhtelumillimetriä kohti (pmy mL−1).
7, 3. Jälkiviljelmä
painomenetelmässä käytetään steriiliä, tunnetun kokoista vaahtomuovialustaa (tyypillisesti 2,5 cm2), joka on kastettu sopivaan nestemäiseen väliaineeseen, kuten sabouraud ’ n liemeen, juuri ennen käyttöä. Tämän jälkeen tyyny asetetaan kohdekohtaan (limakalvo-tai intraoraaliproteesi) 30 sekunniksi ja siirretään sitten agariin viljelyä varten .
8. Kantaviljelyaine
Candidan yleisimmin käytetty ensisijainen eristysaine on SDA, joka, vaikka mahdollistaakin Candidan kasvun, estää monien suun kautta otettavien bakteerilajien kasvun alhaisen pH-arvonsa vuoksi. antibioottien sisällyttäminen SDA: han lisää sen selektiivisyyttä entisestään . Tyypillisesti SDA: ta inkuboidaan aerobisesti 37°C: ssa 24-48 tunnin ajan. Candida kehittyy kermaisena, sileänä, tahnamaisena kuperana pesäkkeenä SDA: lle ja lajien erottaminen on harvoin mahdollista . On arvioitu, että noin 10 prosentissa suun kautta otetuista näytteistä esiintyy enemmän kuin yksi Candida-laji, ja viime vuosina kyky havaita nonalbicans-lajeja on tullut yhä tärkeämmäksi .
viime vuosina on kehitetty muita differentiaalialustoja, jotka mahdollistavat tiettyjen Candida-lajien tunnistamisen pesäkkeiden ulkonäön ja värin perusteella primaariviljelyn jälkeen. Tällaisten medioiden etuna on, että useiden Candida-lajien esiintyminen yhdessä infektiossa voidaan määrittää, mikä voi olla tärkeää myöhempien hoitovaihtoehtojen valinnassa . Esimerkkejä näistä ovat Pagano-Levin agar tai kaupallisesti saatavilla olevat kromogeeniset agarit eli CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate tai Candichrom albicans .
Pagano-Levin agar erottaa Candida-lajit trifenyylitetratsoliumkloridin pelkistämisen perusteella. Väliaine tuottaa C. albicansin vaalean värisiä pesäkkeitä, kun taas muiden Candida-lajien pesäkkeet ovat vaihtelevasti vaaleanpunaisia. Pagano-Levin agarilla on samanlainen herkkyys SDA: lle, mutta se on parempi useamman kuin yhden lajin havaitsemiseksi näytteestä , CHROMagar Candida tunnistaa C. albicans, C. tropicalis ja C. krusei yhdyskunnan värin ja ulkonäön perusteella , kun taas Albicans ID ja Fluroplate ovat osoittautuneet hyödyllisiksi C. albicansin oletetussa tunnistamisessa . Tunnistusspesifisyyden on raportoitu olevan 95% CHROMagar Candida-ja 98, 6% Albicans ID-ja Fluroplate agars-bakteereilla . CHROMagar Candidan käyttö ensisijaisena eristysagarina on mainittu lähestymistavaksi, joka mahdollistaa äskettäin kuvatun C. dubliniensis-bakteerin syrjinnän C. albicansista. CHROMagar Candidalla C. dubliniensiksen kerrotaan kehittyvän tummanvihreinä pesäkkeinä verrattuna C. albicansin pesäkkeisiin . Näiden kahden lajin välinen erottelu Chromagarin avulla näyttää kuitenkin vähenevän isolaattien alakulttuurin ja varastoinnin myötä. C. dubliniensis-bakteerin epäonnistumista kasvaa agar-kasvualustalla 45°C: n inkubaatiolämpötilassa on äskettäin ehdotettu vaihtoehtoiseksi testiksi näiden kahden lajin erottamiseksi toisistaan .
9. Candida-lajien
hiivojen tunnistaminen primaariviljelyaineen perusteella voidaan varmistaa erilaisilla lisätesteillä, jotka perustuvat perinteisesti isolaattien morfologisiin ominaisuuksiin (Taulukko 5) ja fysiologisiin ominaisuuksiin.
9, 1. Morfologiset kriteerit
ituputkitesti on tavanomainen laboratoriomenetelmä C. albicansin tunnistamiseksi. Kokeessa syntyy hyphal outgrowths (ituputket), kun sitä viljellään hevosen seerumissa 37°C: ssa 2-4 tunnin ajan. Noin 95% C. albicans-isolaateista tuottaa ituputkia, mikä on myös C. stellatoidean ja C. dubliniensiksen yhteinen ominaisuus .
C. albicans ja C. dubliniensis voidaan tunnistaa myös muista lajeista niiden kyvyn tuottaa chlamydospores-nimisiä morfologisia piirteitä. Chlamydosporet ovat taittuvia, pallomaisia rakenteita, jotka syntyvät hyphaen terminissä, kun isolaattiviljelmiä viljellään ravitsemuksellisesti huonolla alustalla, kuten maissijauhoagarilla. Isolaatit inokuloidaan agarilla olevaan ristiluukkukuvioon, ja ne päällystetään steriilillä peitelevyllä. Agareita inkuboidaan 24-48 tuntia 37°C: ssa, minkä jälkeen ne tutkitaan mikroskoopilla chlamydospore-bakteerin varalta .
9, 2. Fysiologiset kriteerit / biokemiallinen tunnistaminen
Candida-lajien biokemiallinen tunnistaminen perustuu pitkälti hiilihydraattien hyödyntämiseen. Perinteiseen testaukseen olisi kuulunut koe-isolaattien viljely tyviagarilla, josta puuttuu hiililähde. Hiilihydraattiliuokset laitettaisiin sitten kylvetyn agarin kuoppiin tai agarin pinnalla oleviin suodatinpaperilevyihin. Kasvu hiililähteen läheisyydessä viittaisi hyötykäyttöön. Kaupalliset järjestelmät perustuvat samaan periaatteeseen, mutta testihiilihydraatit säilytetään testiliuskan päällä sijaitsevissa muovikaivoissa. Jokaisen kaivon kasvu on luettavissa sameuden tai värimuutosten perusteella tietyissä sarjajärjestelmissä. Testituloksista saatuja numerokoodeja käytetään testiorganismin tunnistamiseen tietokantavertailun perusteella .
9, 3.
serologisia testejä käytetään usein Candida-lajien isolaattien kliinisen merkityksen varmistamiseen. C. albicans-bakteerin LGG-vasta-ainetittereiden kohoaminen saattaa viitata invasiiviseen kandidiaasiin immunokompetenteilla henkilöillä. IgA-ja IgM-vasta-aineiden osoittaminen on tärkeää akuutin infektion tunnistamiseksi. Immunosuppressiopotilailla esiintyy usein vaihtelua vasta-ainetuotannossa, ja tällaisessa tapauksessa suositellaan antigeenin osoittamistestin käyttöä. Kehittyneissä maissa on nyt saatavilla entsyymi-immunosorbenttimäärityksiä (Elisa) ja radio immuno-määrityksiä (Ria) kandidiaalisen antigeenin, joko soluseinämäisen mannaanin tai sytoplasman ainesosien osoittamiseksi .
serologinen diagnoosi viivästyy usein, eikä testeissä ole vieläkään herkkyyttä ja spesifisyyttä. Lisäksi vasta-ainetuotanto on vaihtelevaa immuunivajauspotilailla, mikä vaikeuttaa diagnoosia . Tämä johtuu siitä, että sieni-antigeenit ja metaboliitit poistuvat usein nopeasti verenkierrosta ja vasta-aineiden esiintyminen ei aina tarkoita Candida-infektiota, erityisesti potilailla, joilla on vakava perussairaus tai jotka käyttävät immunosuppressiivisia lääkkeitä .
serologiset testit eivät yleensä ole suun kautta tapahtuvan candidoosin diagnostinen väline. Tällaiset testit voivat kuitenkin ennustaa vaikeaa suun kautta otettavaa kandidoosia sairastavilla potilailla, joilla antimykoottinen hoito tehoaa huonosti .
9, 4. Molekyylipohjaiset tunnistusmenetelmät
tunnistaminen geneettisen vaihtelun analyysillä on stabiilimpi lähestymistapa kuin fenotyyppisiin kriteereihin perustuvat menetelmät. Candida tunnistetaan geneettisen vaihtelun perusteella analysoimalla elektroforeettisia karyotyyppieroja ja restriktiofragmenttien pituuspolymorfismeja (rflps) geelielektroforeesilla tai DNA-DNA hybridisaatiolla .
lajikohtaisia PCR-lähestymistapoja on käytetty myös Candida-lajien tunnistamiseen. Useita kohdegeenejä on raportoitu Candida-lajien erottelussa, vaikka yleisimmin monistetut ovat ribosomaalisen RNA operonin sekvenssejä. Tunnistaminen voidaan saada PCR: n tuotekokojen perusteella, jotka on saatu geelielektroforeesiresoluutiolla, tai PCR: n tuotejärjestyksen vaihtelun perusteella, joka on määritetty joko suoralla sekvensoinnilla tai restriktiofragmenttianalyysillä sen jälkeen, kun PCR-sekvenssit on leikattu restriktioendonukleaaseilla .
fluoresenssi in situ-hybridisaatio peptidinukleiinihappomenetelmän (PNA Fish) kanssa on uusi detektiomenetelmä, joka kohdistuu erittäin säilyviin lajispesifisiin sekvensseihin elävän C. albicansin runsaassa rRNA: ssa. Yksittäisiä soluja voidaan havaita suoraan ilman vahvistusta . Tämä tekniikka saavuttaa 98,7–100%: n herkkyyden ja 100%: n spesifisyyden, mikä mahdollistaa C. albicansin erottamisen fenotyyppisesti samanlaisesta C. dubliniensiksestä .
Molekyylipohjaista tekniikkaa voidaan käyttää myös Candida-lajien kantojen tunnistamiseen, vaikka sellaisten tekniikoiden kuin Pulssikenttägeelielektroforeesi (Pfge), Satunnaisvahvistettu polymorfinen DNA (RAPD) – analyysi ja toistosekvenssivahvistuksen PCR (REP) käyttö on suurelta osin varattu epidemiologisiin tutkimuksiin suun kautta tapahtuvan candidoosin tutkimuksessa .
10.
viime vuosina on painotettu enemmän Candida-lajien luotettavaa tunnistamista ihmisen kliinisistä näytteistä. Kaaviokuva ehdokkaasta eristämisestä ja tunnistamisesta on esitetty kuvassa 1. Koska Candida on asukas mikrobisto, asianmukaiset eristysmenetelmät ovat tarpeen selvittää läsnäolo suussa sekä niiden määrä. On myös tärkeää tunnistaa tartuttavat Candida-kannat, koska Candida-lajien isolaatit eroavat toisistaan suuresti sekä kyvyssään aiheuttaa infektioita että myös alttiudessaan sienilääkkeille. Eristetyn Candidan tunnistamiseen on käytettävissä erilaisia fenotyyppisiä tekniikoita, mukaan lukien morfologiset viljelytestit, differentiaaliset agar-väliaineet ja biokemialliset assimilaatiotestit. Näitä menetelmiä täydennetään viimeaikaisilla molekyylitekniikoilla, jotka on suurelta osin varattu epidemiologisiin tutkimuksiin.
