El compartimento mieloide del sistema inmunitario innato consta de varios tipos de células cuyas funciones incluyen la eliminación de células dañadas y apoptóticas, la presentación de antígenos, la inmunosupresión y la protección del huésped de microorganismos extraños.

Los monocitos representan un subconjunto altamente plástico de células que componen el sistema inmunitario innato. Estas células son capaces de atravesar la vasculatura y, cuando se exponen a citoquinas específicas, se diferencian en diferentes tipos de células. Los monocitos circulantes se clasifican como no clásicos o clásicos y se pueden distinguir por su patrón de expresión de receptores en la superficie celular. Los monocitos clásicos dentro de la circulación muestran CD14 + + + Hi / CD16 – / lo y están presentes especialmente en lugares de infección o enfermedad (1,2).

Los monocitos humanos no clásicos dentro de la circulación muestran la expresión superficial CD16+++Hi/CD14+/lo (1). Después de la activación, los monocitos experimentan varios cambios funcionales morfológicos y bioquímicos, lo que resulta en la diferenciación de monocitos en nuevos tipos de células, como los macrófagos (3).

En un paradigma denominado activación clásica, los monocitos humanos muestran plasticidad fenotípica que puede iniciarse por exposición a interferón γ de citoquinas promotoras de respuesta Th1 (IFN-γ) o factor de necrosis tumoral α (TNF-α), así como al lipopolisacárido de endotoxina (LPS) (4,5). Este mecanismo de activación clásica genera macrófagos M1, que funcionan para producir mediadores proinflamatorios que proporcionan protección al huésped contra bacterias y virus (6). Los monocitos humanos también pueden diferenciarse de los macrófagos M2 por la exposición a citocinas promotoras de respuesta Th2, como la interleucina—10 (IL-10) y el factor de crecimiento transformador β (TGF-β) (4,7). Los macrófagos M2 expresan altos niveles de CD206 (receptor de manosa) y CD163, producen bajos niveles de citoquinas proinflamatorias y promueven la cicatrización de heridas y la remodelación de la matriz.Las células dendríticas (CDS) son otro conjunto de células inmunitarias derivadas de monocitos cuya función es presentar antígenos a las células T para iniciar una respuesta inmunitaria adaptativa basada en células T. Los DCs se pueden clasificar en gran medida en tres subgrupos: clásicos (cDCs), plasmacitoides (pDCs) y derivados de monocitos (moDCs). Los glóbulos blancos se encuentran típicamente en el tejido linfoide, el bazo, los ganglios linfáticos y la médula ósea. Los PDC se asemejan a las células plasmáticas y se encuentran típicamente en la circulación sanguínea (8). Los monocitos pueden diferenciarse en DCs, que a menudo se denominan DCs derivados de monocitos (moDCs), después de la exposición al factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) e IL-4 (9,10). Se ha informado que los MODC expresan marcadores de superficie celular CD80, CD83, CD86 y CD1a in vitro (11-13). Aunque los MODC difieren de los macrófagos en forma y función celular, comparten la expresión de varios antígenos de superficie celular, incluidos CD11c, CD206 y CD1a (14).

Varios grupos han reportado diferenciación exitosa de monocitos CD14+ humanos en macrófagos; sin embargo, muchos de estos protocolos publicados son diferentes. Una variación común entre estos métodos es la inclusión (15) u omisión (16) de IL-6. Otra diferencia entre los protocolos es el tiempo de tratamiento. Esta falta de coherencia entre los protocolos es problemática.

Para abordar estos problemas, examinamos y comparamos la inclusión y omisión de IL-6 en el tratamiento con citoquinas utilizado en las metodologías comunes de diferenciación de monocitos humanos. Encontramos que en ausencia de IL-6, estas estrategias producen células con un bajo grado de homogeneidad, lo que puede producir resultados experimentales ambiguos. En segundo lugar, para abordar aún más este problema, desarrollamos una nueva estrategia in vitro por fases con la inclusión de IL-6. Encontramos que esta estrategia mejoró en gran medida la homogeneidad celular de los macrófagos M1 y M2, así como de los MODC que se diferenciaron de los monocitos CD14+ humanos. Esta mejora en la metodología proporcionará a los investigadores mejores modelos para investigar el sistema inmunitario y los estados de la enfermedad.

Materiales y métodos

Preparaciones celulares

Se recolectaron capas Buffy de sangre entera de cinco o más donantes masculinos sanos que se habían agrupado. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon a partir de capas buffy mediante centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Paque (densidad de 1,077 g/mL) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) a 400 × g a 18°C durante 35 minutos para separar los componentes sanguíneos. Las células se lavaron varias veces con 1 × PBS y se contaron con un contador celular Nexcelom Auto T4 plus (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Una vez contados, los monocitos CD14 + se aislaron de PBMCS mediante etiquetado magnético utilizando microesferas conjugadas CD14 de MAb (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) seguida de separación mediante columnas magnéticas (130-042-401 y 130-042-302; Miltenyl Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con una excepción: al recoger células CD14+ de la columna magnética, las células se eliminaron inicialmente utilizando un tampón de 5 mL que dependía solo de la gravedad (sin el uso del émbolo suministrado). Después del enjuague inicial de 5 ml, se añadió un tampón adicional de 5 ml que se enjuagó suavemente con el émbolo suministrado.

Cultivo celular

Los monocitos CD14+ humanos se sembraron a una densidad celular de 2,0-3.0 × 105 células/ml en medio RPMI 1640 con 2 mm/L de L-glutamina (Life Technologies, Frederick, MD) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/ml de penicilina (Life Technologies) y 100 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies) a 37°C en una incubadora humidificada de CO2 al 5%. Para diferenciar las células en macrófagos M1, las citocinas utilizadas fueron GM-CSF (20 ng/ml) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/ml), IL-6 (20 ng/mL) y LPS de endotoxina (20 ng/ml). Para la diferenciación de macrófagos M2, las citocinas utilizadas fueron factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), IL-4, IL-6 e IL-13 a una concentración de 20 ng/ml (PeproTech). Los MODC se generaron mediante la adición de GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml). El calendario de cada estrategia se describe con más detalle en la figura 1.

Citometría de flujo

Se cultivaron macrófagos polarizados y DCs durante 9 días en platos de 10 cm2 (BD Falcon, Billerica, MA). El día 9, se recolectaron medios y células no adherentes; las células adherentes se lavaron utilizando 1× PBS, se eliminaron utilizando tampón de disociación celular (Life Technologies) y luego se agregaron a los medios recolectados/células no adherentes para ser lavadas. Las células suspendidas se centrifugaron y lavaron dos veces (1× PBS, 0,5% de ASC, EDTA de 2 mm), se contaron y luego se incubaron con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos contra CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherina (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE) y CD64 (FITC) en la oscuridad durante 45 minutos a 4°C. Un clasificador de células S3TM (Bio-Rad, Hercules, CA) detectó fluorescencia.

Ensayo de endocitosis

Los macrófagos humanos polarizados se platearon en portaobjetos de vidrio de cámara de 4 pocillos (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) a una densidad de 3.0 × 105 células / ml en el Día 7 y se continuó cultivando con las citoquinas adecuadas durante los 2 días restantes. La bisimida de perileno (PBI-12-Man) (17) fue un regalo amable de Ke-Rang Wang en la Universidad de Hebei. Las células se cultivaron con 10 µg/ml de PBI-12-Man durante 30 min a 37°C, luego se lavaron con 1× PBS. Las celdas se fijaron con etanol al 70% y se montaron con DAPI (P36962; Life Technologies). Para visualizar la endocitosis del PBI-12 Hombre, se excitaron y emitieron portaobjetos a 585 nm. Las imágenes de fluorescencia roja se cuantificaron utilizando el software de escaneo de diapositivas Metafer (MetaSystems, Boston, MA). Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el software MATLAB R2015a (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Se realizaron pruebas de suma de rangos para comprobar la significación estadística univariada entre muestras.

Inmunofluorescencia

Los macrófagos se diferenciaron utilizando métodos descritos anteriormente durante 7 días y luego se transfirieron a portaobjetos de cámara de vidrio de 4 pocillos Nunc Lab-Tek II con las citocinas apropiadas. Las células se dejaron crecer durante los siguientes 7 días; 14 días después del recubrimiento inicial, las células se fijaron con etanol al 70% y se montaron con un anti-desvanecimiento de diamante Prolongado con DAPI. Las células se visualizaron mediante contraste de fase y microscopía de fluorescencia en el EVOS FL Auto (Life Technologies).

Resultados y discusión

Estrategias y condiciones para la diferenciación de monocitos CD14+ humanos

Comenzamos evaluando qué estrategias fueron más efectivas en la producción de poblaciones homogéneas de macrófagos M1 y M2 humanos, así como de MODC. Se aislaron monocitos CD14 + humanos y se sembraron en placas de cultivo de tejidos para diferenciarlos en macrófagos o MODC in vitro. Luego, probamos tres condiciones de tratamiento específicas para determinar el método que produjo las poblaciones de macrófagos y moDC más uniformes. Para la primera condición, cultivamos células con la adición de solo GM-CSF o M-CSF durante 9 días (Figura 1). Esta condición se denomina «solo» (Figura 1). La segunda estrategia de tratamiento fue exponer continuamente las células al entorno de citocinas aplicable en el Día 0, reponer los medios, las citocinas y los LPS en el Día 5 y analizar las células en el Día 9. Esta condición se denomina «continua» (Figura 1). La tercera estrategia fue estimular los monocitos CD14+ con GM-CSF o M-CSF durante 5 días, seguido de la adición de medios frescos que contengan LPS para los macrófagos M1 humanos y todas las citocinas aplicables para un grupo de tratamiento determinado (GM-CSF, IFN-γ e IL-6 para los macrófagos M1 o M-CSF, IL-4, IL-13 e IL-6 para los macrófagos M2). Esta estrategia de tratamiento se denominó «por fases» (Figura 1). El tratamiento de monocitos CD14+ con 100 ng/ml de GM-CSF e IL-4 durante 5 días y la sustitución de medios y todas las citocinas en el día 5 generaron MODC. Los MODC fueron estimulados con IL-6 y LPS durante 24 h antes del análisis (Día 8) para promover la maduración y activación de DC. Este método de cultivo se denominó «estimulado» (Figura 1). Los MODC que nunca recibieron exposición a IL-6 y LPS se denominaron «no estimulados» (Figura 1). Después de 9 días de cultivo en las condiciones específicas descritas anteriormente, se analizó la expresión del receptor de la superficie celular y la funcionalidad celular.

La exposición a IL-6 aumenta la eficiencia de polarización de M2 in vitro

Estudios previos han demostrado que la exposición de los macrófagos a la citocina IL-6 no solo distorsiona la diferenciación de monocitos de una célula dendrítica a un fenotipo de macrófagos, sino que la exposición a IL-6 también aumenta el perfil de expresión de ARNm asociado con los macrófagos M2 (15,18). Para confirmar estos hallazgos y probar el efecto de la IL-6 en la polarización M1 y M2, se trataron monocitos CD14+ humanos en condiciones de cultivo continuo y por fases con o sin IL-6. El examen de la expresión de marcadores de superficie de macrófagos M2 en células diferenciadas de M1 no mostró cambios significativos cuando se cultivaron con IL-6 (Figura 2), lo que sugiere que el tratamiento con IL-6 no desvía los macrófagos polarizados de M1 hacia un fenotipo M2.

Por el contrario, el análisis de los grupos de cultivo de macrófagos M2 continuos y en fase reveló que el tratamiento con IL-6 aumentó la expresión de los marcadores de superficie de macrófagos M2. En poblaciones de macrófagos M2, la expresión de CD206 y CD36 se mantuvo alta y no se alteró cuando se expuso a IL-6 (Figura 2, A y B). CD163 y E-cadherina, sin embargo, mostraron aumentos significativos en los niveles de expresión superficial y homogeneidad de la población cuando se trataron con IL-6 (Figura 2, C y D). Esto se demuestra por una disminución de los picos de CD163 y E-cadherina de baja expresión (flechas rojas en la Figura 2, C y D) y el cambio resultante hacia una población de alta expresión homogénea.

La IL-6 se utiliza a menudo para inducir la maduración moDC (18,19). Para determinar si el tratamiento con IL-6 podría dar lugar a MODC no deseados dentro de las poblaciones polarizadas por macrófagos, se examinó la expresión de marcadores de superficie de CC maduros (CD83). El análisis citométrico de flujo demostró que ninguna de las condiciones de cultivo M1 o M2 promovió un aumento significativo en la expresión de CD83 (Figura 2E). Esto sugiere que no hubo contaminación por moDC dentro de estas poblaciones de macrófagos o que cualquier MODC contaminante era insensible a la IL-6.

La polarización por fases conduce a una mayor expresión de los marcadores canónicos de superficie celular M1, M2 y moDC

Para confirmar que los monocitos CD14+ humanos estaban completamente diferenciados en macrófagos o MODC para el día 9, se utilizó citometría de flujo para analizar los marcadores de superficie celular y evaluar las diferencias morfológicas (Figura 3, A-C). Se diferenciaron los monocitos CD14 + humanos (Figura 1) para evaluar qué estrategia produciría una alta expresión de marcadores de superficie apropiados de tipo celular. Se probó un panel de marcadores de superficie celular para cada uno de los tipos de células. Nuestro panel de marcadores de superficie celular M1 consistió en los marcadores canónicos CD86 y CD80 (Figura 3, A-C). Para el panel de macrófagos M2, se utilizaron CD206, CD163, CD124 (receptor-α de IL-4), E-cadherina y CD36 (receptor carroñero de Clase B) (Figura 3, A-C). Para los MODC, se utilizaron CD83, CD86 y CD1a. Se determinaron los niveles de expresión de superficie de todos los marcadores probados para todos los tipos celulares (Figura suplementaria S1). Se calculó la mediana de la intensidad de fluorescencia (IMF) y se mostró como cambio de pliegue en relación con el control correspondiente sin manchas (ver tablas en la Figura 3).

Curiosamente, el análisis de los marcadores de superficie celular M2, CD36 e IL-4Ra, en los macrófagos polarizados solo con GM-CSF M1 reveló aumentos dramáticos (Figura 3A). Al comparar las células tratadas solo con GM-CSF con todos los grupos de tratamiento M1, el grupo de solo GM-CSF tuvo una expresión marcadamente más alta de CD36. Estas células GM-CSF solamente también expresaron niveles bajos de los marcadores asociados a M1 CD86 y CD80. De manera similar, la condición continua produjo células que no solo eran bajas en CD86 y CD80, sino que también eran altas en expresión de CD36 e IL-4Ra. Por el contrario, cuando los monocitos CD14 + humanos se diferenciaron bajo la condición de fase M1, CD86 y CD80 se regularon notablemente, mientras que la expresión de CD36 e IL-4Ra se mantuvo baja. Un análisis citométrico de flujo adicional de la expresión de marcadores de superficie celular reveló que los macrófagos M1 tenían una expresión más baja de CD206, CD36 y CD163 en comparación con los macrófagos M2 bajo exposición gradual y continua (Figuras suplementarias S1 y S4). Además, estas variadas condiciones de cultivo generan células con características y estructura morfológicas distintas (Figura 3A). Aunque las células tratadas solo con GM-CSF parecen ser más grandes, los datos de dispersión directa (FSC) revelaron diferencias mínimas de tamaño entre los grupos (Figuras suplementarias S2 y S3). La comparación de la complejidad interna (CSC) entre las condiciones de tratamiento reveló un aumento de la granularidad en los grupos GM-CSF y por fases (Figura suplementaria S2). En conjunto, estos resultados muestran que el tratamiento solo con GM-CSF y el tratamiento continuo producen células que expresan niveles bajos de marcadores M1 y niveles altos de ciertos marcadores M2, además de presentar cambios morfológicos.

Las condiciones de cultivo de macrófagos M2 arrojaron resultados ligeramente más ambiguos que los encontrados con las condiciones de cultivo de macrófagos M1 (Figura 3B). En relación con el grupo de solo M-CSF, los grupos en fases y continuos mostraron niveles de expresión aumentados de CD206. Por el contrario, los niveles superficiales de IL-4Ra fueron notablemente más altos en condiciones de M-CSF solamente, en relación con los niveles continuos y en fase. La expresión de E-cadherina se mantuvo uniforme en todos los grupos, mientras que CD163 fue significativamente mayor tanto en los grupos de solo M-CSF como en los de fases. Una observación destacable es que el grupo de exposición continua fue consistentemente mucho menos homogéneo en lo que respecta a la expresión de marcadores de superficie celular. Esto se ilustra por la distribución bimodal y la gran variación en los niveles de expresión que se encuentran en el histograma. Además, se pueden observar diferencias morfológicas dramáticas entre los grupos de tratamiento. En base a las imágenes de contraste de fase, el grupo de solo M-CSF produjo células que parecen ser más pequeñas y altamente granulares (Figura 3B). El análisis citométrico de flujo demuestra que estas células tienen un tamaño similar (FSC), sin embargo, hay un aumento en la granularidad celular en las condiciones de tratamiento gradual y continuo (Figura suplementaria S2). Por último, la privación de glutamina alteró la polarización de M2, demostrando que los productos metabólicos son necesarios bajo esta estrategia (Figura suplementaria S5). En conjunto, estos datos sugieren que las condiciones por fases producen la mayor eficiencia para la polarización de macrófagos M2.

A continuación, examinamos la expresión de marcadores de superficie de MODC que no fueron estimulados o estimulados con IL-6 y LPS 24 h antes del análisis citométrico de flujo. La estimulación con IL – 6 y LPS produjo un aumento de la expresión de CD80, CD83 y CD86 (Figura 3C). La expresión de la superficie celular CD83 del marcador de CC maduro aumentó dramáticamente al activarse con IL-6 y LPS el Día 8 en relación con el grupo no estimulado. Esto confirmó que IL – 6 y LPS fueron capaces de promover la maduración celular dendrítica (Figura suplementaria S1L). La expresión de CD1a se mantuvo uniforme entre los grupos no estimulados y estimulados. Curiosamente, los DC estimulados permanecieron en suspensión, sin embargo, parecían comenzar a agregarse y adherirse unos a otros (Figura 3C). Estos resultados confirman hallazgos previos con respecto a la polarización moDC y proporcionan un control adicional para el análisis de marcadores de superficie para identificar poblaciones MODC no deseadas dentro de las diversas condiciones de cultivo de macrófagos.

Los macrófagos M2 generados por la exposición a citoquinas en fases poseen funcionalidad asociada a M2

El receptor de manosa (CD206) es un receptor endocítico y de reciclaje que se expresa altamente en nuestras poblaciones de macrófagos M2 en condiciones de tratamiento en fases. A continuación, queríamos evaluar la captación endocítica mediada por CD206 en nuestros macrófagos. Esto se determinó utilizando PBI-12-Man, un agente biocompatible que fluorece al unirse al receptor de manosa (17). Después de un tratamiento de 1 h de macrófagos M1 y M2 con PBI-12-Man, la fluorescencia roja de PBI-12-Man fue predominantemente intracelular en macrófagos M2 en condiciones de tratamiento gradual y continuo (Figura 4, A y B). Este hallazgo sugiere que la unión de la superficie celular a CD206 y la endocitosis producen localización vesicular. Esto concuerda con los datos anteriores de la citometría de flujo, que demostraron que en condiciones de tratamiento por fases, los macrófagos M2 mostraron una mayor expresión de CD206 en la superficie celular en relación con la población de macrófagos M1. Curiosamente, encontramos que las células solo con GM-CSF mostraron altos niveles de endocitosis PBI-12 en Hombres (Figura 4, A y B). Esto se correlaciona con nuestros datos citométricos de flujo (Figura 2), que demostraron que las condiciones de cultivo de GM-CSF producen células M1 con expresión de marcadores de superficie asociados a M2. En conjunto, demostramos que estas células poseían las características normales de los macrófagos y que CD206 era funcional en la población de macrófagos M2.

Después de 14 días de cultivo, los macrófagos M2 también mostraron la capacidad de fusionarse, alcanzando más de 200 µm de tamaño y conteniendo múltiples núcleos por célula (Figura 4C). Se asemejaban a células gigantes multinucleadas (MNGC, por sus siglas en inglés) de las que se ha informado que poseen capacidades fagocíticas y de otro tipo (20). Además, las ECMNM se han asociado con material extraño en el cuerpo, tuberculosis y cáncer (20-23). Esta fusión celular se encontró exclusivamente en nuestras poblaciones de macrófagos M2 y fue mucho más significativa en la condición de fase M2. Si bien los grupos de solo M-CSF tenían algunas células multinucleadas (Figura 4C), su tamaño y número eran mucho más bajos que el grupo de fases. Dada la capacidad de estas células para realizar esta función asociada a los macrófagos, estos resultados indican además que las condiciones de cultivo por fases producen macrófagos muy similares a M2.

Aquí describimos nuestro nuevo protocolo por fases para la polarización de macrófagos. Descubrimos que la inclusión de IL-6 y el tiempo de tratamiento de polarización por fases son absolutamente críticos para generar la mayoría de macrófagos similares a M1 y M2 in vitro. Este hallazgo se probó rigurosamente en comparación con otros métodos de polarización. Por esa razón, creemos que el método de polarización gradual constituye un importante paso adelante. Esto dará a los investigadores estándares experimentales unificados para producir poblaciones homogéneas de macrófagos para usar in vitro y la capacidad de comparar sus resultados. Si bien este protocolo ofrece una serie de mejoras en comparación con las estrategias de polarización actuales, creemos que sería útil realizar investigaciones adicionales y optimizar los tiempos de exposición y el cóctel de citoquinas. Esto nos ayudará a comprender mejor las complejas funciones de los macrófagos M1 y M2 en diversas formas de progresión de la enfermedad y a avanzar en el desarrollo de nuevas terapias.