Animales
El pez cebra se mantuvo a 28,5 ° C en un ciclo de luz de 14 horas de ENCENDIDO/10 horas de APAGADO en la solución de Danieau . El mutante de cristal combinatorio (albb4 / b4; nacrew2 / w2; roya9/a9) se generó mediante el cruce secuencial de tres cepas mutantes individuales diferentes, a saber, nacrew2/w2 (ref. 9), roya9/a9 (ref. 4) y albb4 / b4 (ref. 18) mutantes. Es importante destacar que tanto las larvas como los peces cebra cristal adultos son viables y no presentan anomalías morfológicas, funcionales o de comportamiento visibles que no sean el fenotipo de la pigmentación. El mutante casper se obtuvo cruzando mutantes nácarw2 / w2 y roya9/a9, como se describió previamente4. La línea AB se utilizó para obtener peces cebra de tipo salvaje. Las líneas transgénicas utilizadas en este estudio incluyen Tg (elavl3: GCaMP5G)21 y Tg(elavl3:GCaMP6f) 28. Se realizaron experimentos de imágenes funcionales confocales en el mutante de nácar. Se realizaron experimentos de obtención de imágenes con láminas de luz en mutantes de nácar, casper y cristal. Se realizaron experimentos de imágenes funcionales de dos fotones en larvas de cristal. Para tratar las larvas de pez cebra con PTU, se siguieron procedimientos normales8, específicamente las larvas se criaron en PTU de 200 µM (Sigma) en solución de Danieau a partir de las 24 horas posteriores a la fertilización (hpf). Las larvas de Tg(elavl3:GCaMP5G) utilizadas para la obtención de imágenes funcionales confocales de la actividad neural evocada visualmente en el tectum óptico se trataron con 200 µM PTU de 24 hpf a 3 dpf y se obtuvieron imágenes a 4 dpf. Este trabajo fue aprobado por el Organismo local de Revisión Ética y Bienestar Animal (King’s College London), y se llevó a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986, bajo licencia del Ministerio del Interior del Reino Unido (PPL70/8057).
Obtención de imágenes
Microscopía in vivo de animales enteros
Se tomaron imágenes de animales enteros de peces cebra adultos con una cámara réflex digital Nikon D7000 equipada con un objetivo macro Sigma de 150 mm. El pez cebra adulto fue anestesiado con 0.tricaína al 2% (MS222, Sigma) en el agua de la instalación de peces y colocada en una placa de petri de 90 mm que contiene agua de la instalación de peces. La obtención de imágenes de larvas se realizó utilizando un microscopio ZEISS Axioskop conectado a cámaras CCD azules EXi (Retiga) y al software de adquisición de Volocity (PerkinElmer). Las larvas de pez cebra se anestesiaron con tricaína al 0,02% en solución de Danieau y se inmovilizaron en agarosa de bajo punto de fusión (Sigma) al 1% en portaobjetos de vidrio.
La obtención de imágenes confocales de calcio
se realizó utilizando un microscopio confocal ZEISS LSM 710 equipado con un cabezal de detección espectral y un escáner 20X/1.0 NA objetivo de inmersión en agua (Carl Zeiss). Se adquirieron series temporales funcionales de respuestas de calcio evocadas visualmente en células ganglionares de la retina (RGC) a una velocidad de 4,1 Hz y una resolución de 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 píxeles), y una abertura estenopeica de 1 UA. La luz de excitación fue proporcionada por un láser multilínea de 488 nm. Las larvas de Tg(elavl3:GCaMP5G) no anestesiadas se inmovilizaron en agarosa de bajo punto de fusión (Sigma) al 2% preparada en solución de Danieau y se montaron con la cara dorsal hacia arriba en una plataforma de vidrio elevada que se colocó en una cámara llena de Danieau hecha a medida. La agarosa era suficiente para contener las larvas, de modo que no se requería anestesia. Las imágenes se realizaron por la tarde (1-8 pm).
Obtención de imágenes de láminas de luz
La obtención de imágenes de láminas de luz de todo el cerebro se realizó utilizando un microscopio ZEISS Lightsheet Z. 1 equipado con dos objetivos de iluminación de 10X/0,2 NA y un objetivo de detección de inmersión en agua de 20X/1,0 NA (Carl Zeiss). se utilizó luz de excitación láser de 488 nm para obtener fluorescencia GCaMP6f y se utilizó un filtro de 505-545 BP para la detección de la luz emitida. El escáner de pivote (Carl Zeiss) se utilizó para proporcionar una iluminación homogénea y, por lo tanto, evitar sombras a lo largo del eje de iluminación. El grosor de la lámina de luz era de 5,39 µm en el centro y de 10,8 µm en los bordes del campo de visión. El tiempo de exposición fue de 29,97 ms. El tamaño de las imágenes volumétricas fue de 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 píxeles) con una resolución de 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. 4 larvas dpf de nácar, casper y cristal Tg(elavl3:GCaMP6f) se paralizaron por primera vez durante 10-15 minutos en α-bungarotoxina (1 mg/ml; Biotio) preparada en solución de Danieau. Posteriormente, las larvas se inmovilizaron en agarosa de bajo punto de fusión al 2% (Sigma) y se colocaron dentro de un capilar de vidrio (volumen de 20 µl, 701904; Marca). Posteriormente extruimos la sección del cilindro de agarosa que contiene la cabeza de la larva del capilar, y orientamos las larvas de modo que el lado dorsal de la cabeza estuviera orientado hacia el objetivo de detección y los ojos hacia los dos objetivos de iluminación. La obtención de imágenes de láminas de luz de todo el cerebro de larvas mutantes de casper se realizó utilizando un microscopio de láminas de luz hecho a medida construido por el Dr. Martin Meyer (King’s College de Londres) y equipado con un objetivo de detección XLUMPlanFLN de inmersión en agua de 20X/1.0 NA (Olympus).
Obtención de imágenes de calcio de dos fotones
La obtención de imágenes funcionales de dos fotones en la retina se realizó utilizando un microscopio Nikon A1R MP equipado con un NDD GaAsP de 4 canales y un objetivo de inmersión en agua Apocromático 25X / 1.1 NA (Nikon). La excitación fue proporcionada por un láser de zafiro de titanio bloqueado en modo Chameleon Ultra II (Coherente) sintonizado a 930 nm. Se adquirieron series temporales de respuestas de calcio evocadas visualmente a una velocidad de 4 Hz y una resolución de 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 píxeles). Tras la activación del escaneo láser, esperamos 60 segundos antes de iniciar la estimulación visual para asegurarnos de que la retina se adaptara al nivel de luz de fondo causado por el láser multifotónico. 4 larvas de dpf crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) se paralizaron por primera vez durante 10-15 minutos en α-bungarotoxina (1 mg/ml; Biotio) preparada en solución de Danieau. Posteriormente, las larvas se inmovilizaron en agarosa de punto de fusión bajo al 2% (Sigma) y se montaron en una plataforma de vidrio elevada hecha a medida con el lado dorsal hacia arriba (ángulo de inclinación de 45°) y un ojo frente a una pantalla LCD (véase Estimulación visual) que se colocó debajo de una cámara llena de Danieau hecha a medida. Las imágenes se realizaron por la tarde (1-8 pm).
Estimulación visual
Barras móviles en preparación confocal
Se generaron estímulos de barras móviles como se describió previamente22, 33. Un filtro de difusión (3026, Rosco) se unió a un lado de la cámara para servir como pantalla de proyección. Se quitó la agarosa frente al ojo frente a la pantalla de proyección, lo que permitió una visión sin obstrucciones de la imagen proyectada en el lateral de la cámara. Las larvas se colocaron a 3 cm de distancia de la pantalla y la imagen proyectada llenó un campo visual de ~97 ° × 63°. Los estímulos visuales consistieron en barras claras (56 cd / m2) o oscuras (8 cd/m2) (175% y 25% de la luminancia media, respectivamente) sobre un fondo gris medio (32 cd/m2). Como no se observaron diferencias cualitativas entre las barras claras y oscuras, se combinaron los datos obtenidos utilizando los dos estímulos. Cada barra tenía un ancho de 10° y se movía a una velocidad de 20°/s y estaba separada de la barra anterior por 30°, lo que permitía que hubiera más de una barra en la pantalla a la vez. Los ejes largos de las barras eran ortogonales a la dirección del movimiento. Cada una de las 12 direcciones de movimiento se presentó una vez (3 segundos) en un orden pseudoaleatorio único para cada rebanada en cada animal fotografiado. Cada intervalo entre épocas fue de 10 segundos para permitir que las señales de GCaMP5G volvieran a la línea de base. También se intercaló una condición nula de pantalla en blanco de 2 segundos. Los experimentos visuales se generaron y controlaron utilizando código Labview y MATLAB escrito a medida (MathWorks), implementado en un presentador de estímulos de ViSaGe (Cambridge Research Systems) y entregado a través de un proyector pico DLP (Optoma).
Rejillas móviles en preparación de dos fotones
Rejillas móviles los estímulos en la preparación de dos fotones se generaron y controlaron utilizando Psicopy39, y se entregaron a través de una pantalla LCD (SKD5VA-3, Tecnología GoodWell) colocada debajo de una cámara de plexiglás hecha a medida. Se colocó un filtro de vidrio rojo de paso largo (FGL610, Thorlabs) entre la pantalla LCD y la cámara para permitir la obtención simultánea de imágenes y la estimulación visual. Las larvas se colocaron a 2 cm de distancia de la pantalla y la imagen en la pantalla LCD llenó un campo visual de ~140 ° × 100° (luminancia de fondo media de 30,4 cd/m2). Los estímulos visuales consistieron en rejillas de ondas cuadradas (contraste del 100%, frecuencia espacial 1,66 ciclos/cm, frecuencia temporal 1 ciclos/s). Cada barra de rejilla tenía un ancho de 8,5° y los ejes largos de las barras eran ortogonales a la dirección del movimiento. Cada una de las 12 direcciones de movimiento se presentó una vez (6 segundos) con un intervalo entre épocas de 10 segundos para permitir que las señales GCaMP6f volvieran a la línea de base. También se intercaló una condición nula de pantalla en blanco de 6 segundos. Disparadores TTL (0-5-0 Voltios) para registrar eventos de época cuando se generan a través de un dispositivo DAQ USB LabJack (U3-LV, LabJack Corporation). Tras la activación del escaneo láser, esperamos 60 segundos antes de iniciar la estimulación visual para asegurarnos de que la retina se adaptara al nivel de luz de fondo causado por el láser multifotónico.
Ensayo de respuesta optomotora
Se colocaron 5 larvas de dpf individuales en una placa de petri de 35 mm que contenía la solución de Danieau. La pantalla LCD de un iPhone 5 (Apple) controlada por un MacBook Pro (Apple) a través de Duet Display (Kairos Technologies) se utilizó para mostrar rejillas de onda cuadrada en blanco y negro (85% de contraste, frecuencia espacial 0,33 ciclos/mm, frecuencia temporal 3,5 ciclos/s) moviéndose en 4 direcciones (distancia angular de 90°) en la parte inferior de la placa de petri. Se generaron estímulos visuales en Keynote (Apple). Cada larva se probó 5 veces en total (cada ensayo duró 6 segundos seguido de 10 segundos de rejillas estáticas) y se clasificó de acuerdo con los ensayos a los que respondió (es decir, los peces giran y nadan en la dirección de las rejillas en movimiento). El comportamiento de las larvas se monitorizó visualmente mediante un microscopio estereoscópico M165 FC (Leica).Análisis
Análisis
Análisis funcionales
Se analizaron los datos de imagen de calcio in vivo descritos previamente22, 33. En resumen, las series temporales funcionales se procesaron antes del análisis de la siguiente manera: las imágenes de series temporales de cada experimento se corrigieron para el movimiento con un algoritmo de cuerpo rígido (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), la mediana se filtró con un tamaño de núcleo de 1 voxel para eliminar el ruido oscuro y de disparo, y se suavizó espacialmente con un núcleo gaussiano 2D = 2 voxels para mejorar la señal a ruido. Se determinó una línea de base (B) que corrige las derivas de baja frecuencia utilizando un algoritmo de estrías cúbicas que extrapola entre nudos promediados a partir de 5 s de los datos del intervalo entre épocas. Ambos cambios de intensidad de señal relativa (ΔF = F-B; donde F = fluorescencia cruda) y los cambios de intensidad de señal normalizados se calcularon en cada voxel. ΔF se utilizó para los datos funcionales de la población (análisis por vóxeles), mientras que %ΔF/F0 se utilizó para las regiones de interés definidas manualmente (ROI). Para cada voxel o ROI se calculó la respuesta integral a lo largo del intervalo de época para proporcionar una métrica de respuesta única de cada dirección de movimiento de estímulo presentada. La integral dentro de cada ventana epoch es una métrica de resumen más resistente a los efectos de saturación de la sonda de calcio que el cambio máximo de señal. Se determinó un umbral para cada voxel dentro de una secuencia de imágenes de adquisición a partir de la varianza de los cambios ΔF durante los intervalos inter-época y la condición nula, umbral = 5 × SDs. Todos los vóxeles que estaban por encima del umbral dentro de al menos dos épocas de presentación visual se consideraron visualmente sensibles y se sometieron a una caracterización adicional.
Para analizar la selectividad de dirección y orientación de los vóxeles visualmente sensibles, se calcularon índices selectivos de dirección y orientación (DSI y OSI)40, basados en perfiles de von – Mises ajustados o gaussianos 41, junto con una estimación de su bondad de ajuste, R2. El DSI se definió como (Rpref-Rnull)/(Rpref + Rnull), donde Rpref, la respuesta a la dirección preferida, fue la respuesta integral sobre el intervalo de época de la dirección preferida. Rnull se calculó de manera similar como la respuesta integral evocada por la dirección opuesta a la dirección preferida. La IIS se definió como (Rpref-Rorth)/(Rpref + Rorth), donde Rpref, la respuesta a la orientación preferida, fue la respuesta integral sobre el intervalo de época de orientación preferida. Rorth se calculó de manera similar a la respuesta integral evocada por la orientación ortogonal. Para minimizar la conversación cruzada y el ajuste excesivo asociados con las métricas de DSI y OSI, se adoptó un enfoque estricto. Para que un voxel se considere selectivo en dirección (DS) o selectivo en orientación (OS), se utilizaron criterios mutuamente excluyentes: DS if DSI 0.5 y OSI < 0.5; y OS si OSI 0,5 y DSI < 0,5. En ambos casos, la bondad de ajuste (R2) para DSI y OSI, respectivamente, tuvo que ser >0,8; por lo tanto, las curvas ajustadas explicaron al menos el 80% de las respuestas integrales. Se utilizó una única distribución de von-Mises para ajustar las respuestas de los vóxeles DS y estimar su dirección preferida de ángulo de movimiento desde el centro de la curva ajustada. La suma de dos von-Mises (distancia angular de 180°) se utilizó para ajustar las respuestas de los vóxeles de OS y estimar su orientación preferida de los ángulos de movimiento desde los centros de las curvas ajustadas. La varianza circular también se calculó para la comparación como una métrica alternativa de selectividad de orientación (varianza circular < 0.4)41.
Análisis morfológicos
Para determinar el volumen cerebral fotografiado en 4 dpf nácar, casper y cristal Tg (elavl3:GCaMP6f), calculamos el número de vóxeles de GCaMP6f + en cada imagen volumétrica aplicando la función de umbral adjust seguida del comando analysehistogramalist en ImageJ42. Posteriormente, los valores obtenidos se multiplicaron por el volumen de un solo voxel (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).
Análisis estadísticos
Los resultados de las pruebas estadísticas se presentan en Figuras y leyendas de figuras. Los análisis estadísticos y las pruebas se llevaron a cabo utilizando Prism 6 (GraphPad) o MATLAB R2014b (MathWorks). Antes de realizar pruebas estadísticas, se utilizaron estadísticas descriptivas (por ejemplo, pruebas de normalidad para ver si los valores provienen de una distribución gaussiana o prueba F para comparar varianzas) para elegir la prueba estadística adecuada (reportada en leyendas de figuras junto con los resultados de la prueba). El criterio de significancia estadística se estableció en p < 0,05.
