Resumen
Los ensayos de quimiotaxis existentes no generan gradientes quimiotácticos estables y, por lo tanto, con el tiempo, miden funcionalmente solo el movimiento aleatorio inespecífico (quimiocinesis). En comparación, la tecnología microfluídica tiene la capacidad de generar un microambiente estrechamente controlado que se puede mantener de forma estable durante largos períodos de tiempo y, por lo tanto, es susceptible de adaptación para el ensayo de quimiotaxis. Describimos aquí un novedoso dispositivo microfluídico para el ensayo sensible de la migración celular y mostramos su aplicación para evaluar la quimiotaxis de las células musculares lisas en un gradiente de quimioquinas.
1. Introducción
La migración celular dirigida desempeña un papel fundamental en los trastornos inflamatorios, las enfermedades vasculares, la cicatrización de heridas y las metástasis tumorales . Se han desarrollado varios enfoques in vitro para cuantificar la migración celular, incluido el cierre de heridas monocapa («ensayo de rasguños») y la cámara de Boyden . Sin embargo, estos métodos actuales son relativamente insensibles. Además, tales enfoques pueden medir solo quimiocinesis, es decir, aumento del movimiento aleatorio, en lugar de la migración celular dirigida por quimiotaxis.
De hecho, la utilidad del ensayo de rasguños y de los pozos transversos de la cámara de Boyden está limitada por su diseño metodológico.
Para el ensayo de rasguño, se hace una «herida» definida (rasguño) en una monocapa de células confluentes; las células en los bordes del defecto se llenan progresivamente en el vacío, y se cuantifica el tiempo para restaurar la confluencia. Se ha interpretado que la reparación más rápida del rasguño refleja una «quimiotaxis» mejorada debido a la manipulación celular o a la naturaleza de los agentes solubles añadidos al medio. Mientras que el experimento es conceptualmente sencillo y técnicamente fácil de realizar, las células están bañadas en una concentración uniforme de agente, y no hay gradiente de concentración quimioatrayente durante todo el experimento; el movimiento que llena el espacio por lo tanto representa solo un «paseo aleatorio». Por lo tanto, la «migración» en un ensayo de rasguño es en gran medida una función de solo aumento de la quimioquinesis. Además, como se realiza normalmente, especialmente durante varias horas de un ensayo prolongado, el cierre de una «herida» de rasguño también probablemente incluye un componente sustancial de proliferación celular.
El otro método más común para medir la «quimiotaxis» implica el uso de travesaños de cámara de Boyden. Diferentes concentraciones de quimiocinas específicas se colocan en el compartimento inferior del dispositivo, mientras que las células a evaluar se incuban en el inserto superior; una membrana microporosa separa las dos cámaras y forma un soporte para el crecimiento celular y una barrera parcial para la migración. Las células que se cuentan en la cara inferior de la membrana, o que se acumulan en la cámara inferior, se evalúan típicamente en un único punto final fijo. Este ensayo tiene la ventaja de una migración aparentemente dirigida, es decir, de la cámara superior a la inferior, pero sigue siendo problemático. En primer lugar, no hay un «gradiente» de quimiocinas de arriba a abajo, sino más bien una función de un solo paso de concentraciones bajas a altas. En segundo lugar, no hay forma de mantener el diferencial de quimioquinas de las cámaras superior a inferior . Inicialmente, la concentración de quimiocinas en el compartimento inferior es mayor, pero en cuestión de minutos a horas, las concentraciones se igualan debido a la difusión, momento en el que cesa la quimiotaxis específica. En cambio, es más probable que las mediciones a largo plazo reflejen un elemento significativo de quimioquinesis. Además, una vez que las células caen a través de la membrana y entran en la cámara inferior, no hay oportunidad de migración inversa. Finalmente, la cámara de Boyden también está limitada porque el conteo de celdas requiere la terminación del experimento; por lo tanto, un curso de tiempo requiere múltiples dispositivos.
La tecnología microfluídica puede superar estas limitaciones al generar un gradiente estable y controlable a largo plazo de factores solubles que se pueden monitorear continuamente a lo largo del tiempo . El uso de células que han sido tratadas para bloquear la proliferación, un dispositivo de este tipo permite una verdadera evaluación continua de la quimiotaxis frente a la quimiquinesis. La Figura 1 muestra un dispositivo de este tipo en el que las concentraciones de fuente y sumidero se mantienen mediante la creación de pozos correspondientes cuyos volúmenes son grandes en relación con el flujo difusivo a través del canal de hidrogel de conexión . En estado estacionario, se forma un gradiente de concentración lineal entre estos dos pozos. Aunque el flujo intersticial a través de la región del hidrogel puede interrumpir el gradiente si las presiones hidrostáticas en los dos pozos no son iguales, los gradientes de presión se eliminan conectando los pozos fuente y sumidero con canales y depósitos adicionales que sirven como vías de baja resistencia para el flujo de fluido y el equilibrio de presión. Los gradientes pueden, por lo tanto, mantenerse durante varios días y usarse para estudiar la migración celular de una manera sensible y específica con una variedad de tipos de células . El trabajo que se presenta aquí describe el uso de estos dispositivos para evaluar la quimiotaxis para cultivos primarios de células musculares lisas y compararla con las técnicas de sensibilidad de scratch y Boyden chamber.
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Device design and stability of concentration gradients as a function of time. a) Los 3 pozos inferiores son pozos de celda y/o fuente para quimiocinas, y los 3 pozos superiores sirven como reservorios para mantener presiones equivalentes en los pozos inferiores. Dependiendo del diseño experimental, los pozos laterales o el pozo central pueden servir como pozos fuente; las células de un pozo central pueden migrar hacia diferentes estímulos de quimiocinas en cada lado, o diferentes poblaciones de células en los pozos laterales pueden migrar hacia un estímulo de quimiocinas central. b, c) Los gradientes de concentración se muestran esquemáticamente tras la adición de un indicador de colorante fluorescente de bajo peso molecular al pozo fuente y al depósito fuente, a las 2 horas b) o a las 72 horas c). d) Visualización gráfica de gradientes de concentración de 0 horas a 72 horas después de la adición de tinte fluorescente al pozo fuente y al depósito.
2. Materiales y Métodos
2.1. Cultivo de Células Musculares Lisas Primarias (SMC)
Las aortas se recolectaron de ratones C57/B6 de 8 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) con tijeras de disección estériles. Se eliminó la grasa adherente y se incubaron aortas durante 20 minutos a 37 ° C en un medio de Dulbecco modificado con Eagle (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) que contenía 1% de penicilina/estreptomicina, 2% de suero fetal bovino y 5 mg/ml de colagenasa tipo II (Invitrogen). Las aortas se enjuagaron en DMEM frío y la adventicia se diseccionó cuidadosamente; luego se cortaron en trozos pequeños y se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C en DMEM que contenía 1 mg/ml de colagenasa tipo I (Invitrogen) y 0,125 mg/ml de elastasa tipo III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). Después de pipetear repetidamente para disociar el tejido, la mezcla celular resultante se suspendió en un «medio SMC» fresco (DMEM con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, 2% de aminoácidos no esenciales, 1% de L-glutamina, todos los reactivos de Invitrogen) y se cultivó a 37°C en una incubadora de CO2 al 5% en placas recubiertas con 1 mg/ml de fibronectina durante 30 minutos. Una vez que se establece el cultivo celular (típicamente después del primer paso), los CME se cultivan en matraces de plástico sin recubrimiento (Corning Incorporated, Corning, NY).
Se utilizaron CME de los pasajes 2 a 7 y fueron 99.pureza del 5% evaluada por citometría de flujo después de la tinción para la α-actina del músculo liso. Para la tinción, las células se recolectan y se fijan con 1% de paraformaldehído (Sigma-Aldrich) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se aplicó anticuerpo de α-actina muscular antideslizante conjugado FITC (Sigma-Aldrich) a una dilución de 1 : 100 en tampón permanente/lavado de 10X BD (BD Pharmingen, San José, California) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan dos veces con suero fetal bovino al 1% en PBS y una vez con suero fetal bovino al 1% en PBS que contiene 1% de formaldehído y se analizan inmediatamente por citometría de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, San José, CA). El isotipo IgG1 de ratón conjugado FITC (BD Pharmingen) se utiliza como control de isotipos. Las células para ensayos quimiotácticos se recolectaron cuando habían alcanzado la confluencia.
2.2. Tratamiento con Mitomicina-C
Las células se tripsinizaron (0,25% de tripsina-EDTA; Invitrogen) durante 2 minutos a 37 ° C, se lavaron con medio SMC y luego se incubaron como suspensión unicelular en 40 µg/ml de mitomicina-C (MMC; Sigma-Aldrich) en medio SMC durante 30 min a 37°C. Después de dos lavados adicionales en PBS, se evaluó la viabilidad, proliferación o capacidad migratoria de las células. Para el ensayo de cicatrización de heridas (rasguño), el tratamiento con MMC se realizó después del recubrimiento de SMC y cuando las células eran 100% confluentes; las células se incubaron en 40 µg/ml de MMC en medio de SMC durante 30 minutos a 37°C y luego se lavaron dos veces en PBS antes del ensayo.
2.3. Ensayo de Inhibición de la proliferación de CMM
Después del tratamiento con CMM o de la incubación de control en medio de CMM, las CMM se cultivaron en placas de 6 pocillos (Corning Incorporated). Las células se recuperaron después de 1 h, 24 h o 48 h mediante tripsinización y se evaluaron el número y la viabilidad de las células mediante conteo mediante hemocitómetro y exclusión de azul tripano.
2.4. El ensayo de cicatrización de heridas/rasguño
Se cultivó en placas de 12 pocillos (Corning Incorporado) hasta el confluente y luego se trató con MMC. Después del lavado, se añadió medio SMC fresco y se rayó la monocapa celular de forma reproducible utilizando una punta de pipeta estéril de 200 µL. Diferentes concentraciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF; R& D Systems, Minneapolis, MN) en medios SMC se agregaron a cada pozo. La distancia entre los bordes del defecto de rasguño se midió y se promedió a partir de cinco puntos separados a las 3, 6 y 9 h, o hasta que el defecto de la herida se hubiera cerrado.
2.5. Ensayo Transwell de cámara Boyden
Se cargaron 100 µL de suspensiones SMC a 1,0–1,5 × 105 células/ml (1,0–1,5 × 104 células totales) en los insertos transwell superiores (Costar, Corning Incorporado) y se colocaron 600 µL de medios SMC que contenían diferentes concentraciones de PDGF en el compartimento inferior. Después de 6, 12 o 24 horas de incubación, la membrana transwell se tiñó con Hoechst 33342 (Invitrogen) de acuerdo con la recomendación del fabricante, y las células transmigradas en la cara inferior se contaron con un microscopio de fluorescencia utilizando el Software de Automatización de Microscopía y Análisis de Imágenes MetaMorph NX (BioCompare, South San Francisco, CA). Nunca se identificaron células en el medio de la cámara inferior. En experimentos para evaluar si la migración celular representaba quimiotaxis o quimiocinesis aleatoria en ausencia de un gradiente de concentración, se añadió el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF) a la cámara inferior, al pozo de inserción superior solamente o a ambos, el inserto superior y la cámara inferior.
2.6. Ensayo de dispositivos microfluídicos
Los dispositivos microfluídicos [Figuras 1 a) a 1 c)] se preparan como se describe en otra parte . Como se muestra en la Figura 1 (d), los gradientes de reactivos añadidos son estables durante al menos 72 h. Dependiendo del protocolo experimental, las células a evaluar se colocan en el pozo central y se desarrollan diferentes gradientes quimiotácticos a partir de los dos pozos laterales. Alternativamente, la migración de dos poblaciones diferentes de células se puede evaluar desde los pozos laterales, experimentando gradientes de concentración idénticos generados por reactivos colocados en el pozo central. Las concentraciones celulares fueron siempre de 4-5 × 105 / ml y se cargaron 40 µL de las suspensiones celulares (1,6–2,0 × 103 células) en los pocillos de prueba.
Las células se incubaron en los dispositivos durante varios puntos de tiempo y luego se teñieron con Hoechst 33342 (Invitrogen). La ubicación de cada célula se determinó mediante microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), y la distancia migrada se evaluó mediante el programa Matlab (MathWorks, Natick, MA). La «migración total» se define como la suma de las distancias migradas por todas las celdas más allá de una ubicación inicial inicial; este índice de migración se utiliza para el análisis estadístico (Figura 2).
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Evaluación de la migración de las células en los dispositivos de microfluidos. Las células fueron chapadas en el pocillo inferior central de un dispositivo microfluídico, con 50 ng/ml de PDGF en medio SMC colocado en el pocillo inferior izquierdo y medio SMC solo colocado en el pocillo inferior derecho, seguido de incubación a 37°C durante 48 h. a, b) Imagen de contraste de fase de la quimiotaxis celular desde el canal central en la dirección del PDGF de 50 ng / ml en el canal izquierdo; las imágenes se dividen a lo largo del canal entre el sumidero y los pozos fuente de modo que se pueda mostrar toda la longitud del canal con un aumento suficiente para permitir la resolución celular. (c, d) Imagen de contraste de fase de la quimiocinesis celular desde el canal central en la dirección del medio SMC solamente. (e, f) Imagen de fluorescencia de baja potencia del canal izquierdo (e) o derecho; (f) a las 48 h después de la tinción con Hoechst 33342. (g) Imagen de fluorescencia de alta potencia del canal izquierdo en el panel (e); el cuadrado negro sin celdas cerca del lado derecho de la imagen (asterisco) es un poste estructural que marca el punto de inicio de la migración. h) Ejemplo de análisis de la migración. Una línea roja vertical denota el punto de inicio; se mide la distancia desde el punto de inicio hasta el centro de cada núcleo celular, y la suma de todas estas mediciones individuales se convierte en la distancia total de migración utilizando Matlab.
El colágeno tipo I (Invitrogen) se utiliza para llenar el canal entre los pocillos central y lateral, y es el sustrato a través del cual las células migran. Se pueden utilizar tanto 1 mg/ml como 2 mg/ml de colágeno. Aunque 1 mg / ml de colágeno da como resultado una quimiocinesis celular de fondo inespecífica algo mayor y la carga de gel es técnicamente más difícil que con 2 mg/ml de colágeno, la concentración de colágeno más baja permite una mayor migración de cultivos primarios de CME, y la sensibilidad del ensayo es mejor. A menos que se especifique lo contrario, la concentración de colágeno en los canales de migración fue de 1 mg/ml para todos los experimentos.
2.7. Análisis estadístico
Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el test de Student o ANOVA unidireccional. El significado se definió en el nivel.
3. Resultados y Discusión
Como se muestra en la Figura 3 (a), el tratamiento con MMC bloquea la proliferación celular. No hay diferencia significativa en la viabilidad celular entre la CMM tratada con MMC (%) y la CMM no tratada (%) hasta 48 horas después del tratamiento. Por lo tanto, la acumulación celular en los diversos ensayos de migración representa un verdadero movimiento celular sin ningún componente de proliferación celular. Esto es importante porque sin el tratamiento con MMC, los índices de migración de incubaciones a largo plazo pueden confundirse por la proliferación celular coincidente.
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la migración Celular en cero y la cámara de Boyden de los ensayos. a) Inhibición de la proliferación de C-mitomicina (MMC). Los CML tratados con o sin MMC (40 µg / mL durante 30 min a 37°C) se platearon en placas de 6 pocillos y posteriormente se cosecharon. Los recuentos celulares se realizaron manualmente en un hemocitómetro después de 1 h, 24 h y 48 h; los recuentos celulares se expresan como la media ± una desviación estándar de triplicados. La exclusión del azul de Tripano no mostró diferencias en la viabilidad celular en más de 48 horas (%). El tratamiento con MMC conduce a un número estable de células recolectadas a las 24 y 48 h, con un aumento significativo de la proliferación en las poblaciones no tratadas con MMC (). b) Ensayo de arañazos; no se observan diferencias en el grado de migración entre las células cultivadas sin quimiocina versus 25-100 ng/ml de FGDD; durante las 3-6 horas de este ensayo, no se observan diferencias significativas entre las células de control y las tratadas con MMC. c) Ensayo Transwell; se agregaron diferentes concentraciones de PDGF a la cámara inferior de los dispositivos transwell en el momento cero; se enumeraron células en la parte inferior del inserto transwell después de 6, 12 o 24 horas. En comparación con no PDGF en la cámara inferior, hubo un número significativamente mayor de células migradas en el grupo de 10 ng/ml, 25 ng/mL y 50 ng/ml de PDGF después de 12 h (). Después de 24 horas, el número de células migradas en pozos transexuales con FGD de 5 a 50 ng/ml no fue significativamente diferente en relación con las cámaras sin FGD. Después de 24 horas, el número de células migradas cuando había 100 ng/ml de FPD en la cámara inferior se redujo significativamente en relación con el grupo control 0 ng/ml de FPD. (d) Quimiocinesis en transwells; la misma concentración de 50 ng/ml de PDGF se cargó en la cámara inferior, la cámara superior o ambas cámaras inferior y superior; la migración celular se analizó después de 6 h, 12 h o 24 h. En relación con la ausencia de PDGF en ninguna de las cámaras, la migración celular fue significativamente mayor con 50 ng/ml en la cámara inferior a las 12 horas (); a las 24 horas, no hubo diferencia significativa entre las cámaras de control y el PDGF de 50 ng/ml. En particular, la adición de PDGF a la cámara superior, con o sin PDGF en la cámara inferior, condujo a un aumento significativo de la migración a las 12 horas en relación con PDGF en la cámara inferior sola ().
En ensayos de rayado (Figura 3 (b)) con cultivos primarios de CME, las células migraron aleatoriamente (quimioquinesis) para rellenar los defectos a tasas comparables, independientemente de la concentración de PDGF, incluso en ausencia de cualquier agente quimiotáctico. Sin el tratamiento con MMC, los defectos de la herida tienden a cerrarse un poco antes, lo que sugiere un elemento de proliferación celular.
En la Figura 3 (c) se muestran los resultados de migración para el CME utilizando el ensayo transwell de la cámara de Boyden. El punto de tiempo inicial (12 h) muestra una migración pequeña pero significativamente mayor en respuesta a 10-50 ng/ml de PDGF en comparación con la ausencia de quimiocina en el pozo inferior. Sin embargo, no hubo diferencia distinguible en la migración en un rango de concentración de 10 veces de PDGF, lo que sugiere que el ensayo es relativamente insensible, al menos para cultivos de CMM primarios. Además, a las 24 horas, no hay diferencias entre ninguna de las concentraciones de quimioquinas (incluido el control del medio), lo que sugiere que la migración en este momento es inespecífica una vez que las concentraciones de citoquinas han comenzado a equilibrarse entre los pozos superior e inferior.
Para demostrar formalmente que la migración a través de la membrana en el pozo superior no se debe necesariamente a quimiotaxis dirigida, se agregó PDGF al pozo superior, con o sin PDGF en el compartimiento inferior. Incluso en ausencia de un gradiente de quimioquinas, el PDGF en la cámara superior condujo a un aumento marcado de la transmigración (Figura 3(d)); esto solo se puede atribuir al aumento de la quimioquinesis.
Los experimentos de transwell, por lo tanto, sugieren que aunque las diferencias iniciales de concentración de PDGF pueden inducir algún grado de aumento de la migración celular hacia concentraciones más altas en los pocillos inferiores, la difusión posterior de PDGF conduce a quimiocinesis aleatoria.
En comparación, los experimentos de respuesta a la dosis que utilizan dispositivos microfluídicos (Figura 4) demuestran quimiotaxis significativa a concentraciones tan bajas como 2.5 ng/ml PDGF (Figura 4(b)), y muestran un aumento de la quimiotaxis dependiente de la dosis con un pico de aproximadamente 25-50 ng/ml (Figura 4(a)). Curiosamente, las concentraciones más altas de PDGF (por ejemplo, 100 ng/ml) conducen a una menor migración, lo que concuerda con una detención de quimiotaxis de dosis altas (18). Cabe destacar que, sin tratamiento previo con MMC, el índice de migración es mayor (Figura 4 (a)), lo que pone de relieve la contribución no inteligible de la proliferación a la quimiotaxis «aparente» que se produce con tiempos de ensayo más largos. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or «gold standard» Boyden chamber approaches.
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Microfluidic device assay. a) Curvas dosis-respuesta con y sin tratamiento previo con MMC. Se colocaron CME tratados con MMC y no tratados en pocillos de células laterales, con diferentes concentraciones de PDGF (5 ng/ml, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL y 100 ng/ml) presentes en los pocillos de fuente central. La migración se midió después de tinción Hoechst 33342 y microscopía de fluorescencia después de 48 h, utilizando el programa Matlab para calcular la migración total. Los controles (solo medio SMC) y cada concentración de PDGF se evaluaron en dispositivos triplicados. Se pueden observar diferencias significativas de 5 ng/ml a 100 ng/ml en comparación con el grupo de control (). b) Quimioquinesis versus quimiotaxis en dispositivos microfluídicos. El CME tratado con MMC con o sin 2,5 ng/ml de PDGF se plateó en el pozo de celda central; se agregaron 2,5 ng/ml o 50 ng/ml de PDGF a los pozos de fuente lateral. Sin PDGF presente en el pozo de células centrales, el ensayo muestra una migración total significativamente mayor después de 48 h con 50 ng/ml en el pozo fuente («0-50») versus 2,5 ng/ml en el pozo fuente («0-2, 5»). La presencia de 2,5 ng/ml de PDGF en el pozo de células centrales conduce a una migración total significativamente mayor cuando hay un gradiente de concentración («2,5-50»; ) atribuible a un local quimiocinesis efecto. En ausencia de un gradiente («2.5–2.5»), hay una migración asociada a la quimiocinesis que es significativamente menor que la migración observada cuando hay un gradiente presente («0-2.5»; ). (c) Experimento de curso temporal realizado como panel (b).
El dispositivo microfluídico no solo se puede utilizar para medir la quimiotaxis, sino que también puede distinguir específicamente las contribuciones de la quimiotaxis y la quimiotaxis a la migración (Figura 4(b)). Por lo tanto, en ausencia de un gradiente de quimioquinas (por ejemplo, 2.5 ng/ml de PDGF tanto en el centro como en los pocillos laterales), el índice de migración refleja la quimiocinesis. En comparación, sin PDGF en el pozo central y 2,5 ng / ml en el pozo lateral, el índice de migración refleja la quimiotaxis dirigida. El dispositivo microfluídico también puede evaluar la quimiotaxis en presencia de quimiocinesis existente, como cuando el pozo central contiene 2,5 ng/ml de FGDP y el pozo lateral contiene 50 ng / ml. Hay una migración pequeña pero estadísticamente mayor cuando el estímulo es un gradiente quimiotáctico en lugar de una simple quimiocinesis.
Dado que el gradiente de quimioquinas se establece en 2 horas (17) y es estable durante varios días, las células pueden migrar continuamente hacia arriba en el gradiente de concentración con el tiempo (Figura 4(c)). En comparación, otros métodos clásicos no tienen gradiente de concentración (ensayo de rasguño) o solo tienen un gradiente de quimioquinas transitorio, de modo que la quimioquinesis, en lugar de la quimiotaxis dirigida, contribuye cada vez más.
El dispositivo microfluídico descrito en este trabajo es superior en varios aspectos en comparación con otros enfoques in vitro utilizados anteriormente para estudiar la quimiotaxis. En particular, la cámara de Boyden, que involucra un gradiente de quimioquinas a través de una membrana porosa, ha sido un ensayo quimiotáctico estándar desde la década de 1950. Sin embargo, este dispositivo tiene limitaciones significativas en el sentido de que los gradientes no son estables ni lineales, con un aumento inicial de la concentración aguda que se deteriora progresivamente con el tiempo. Más recientemente, se desarrollaron tecnologías de sistemas micro electromecánicos (MEMS) que utilizan biochips microfluídicos para imitar las condiciones in vivo; en estos dispositivos, las células están expuestas continuamente a fuerzas de cizallamiento bajo flujo controlado. Sin embargo, el flujo continuo de estos dispositivos presenta un desafío para el mantenimiento de gradientes de quimiocinas estables. Aunque los hidrogeles entre la fuente y el canal del sumidero pueden crear gradientes de concentración lineales , las variaciones sutiles en los pozos y canales pueden generar gradientes de presión que interrumpen los gradientes a través del flujo intersticial ; además, el flujo continuo de los dispositivos tiende a diluir cualquier quimioatractor secretado por las fuentes celulares. En el novedoso dispositivo microfluídico descrito anteriormente y validado para la migración de células de músculo liso en este artículo, los pozos fuente y sumidero de gran volumen mantienen gradientes de quimiocinas estables en el hidrogel de conexión; cualquier flujo intersticial se elimina conectando los pozos fuente y sumidero con canales y reservorios adicionales que sirven como circuito de resistencia-condensador. Los gradientes de concentración son, por lo tanto, estables y lineales durante varios días. El trabajo actual ha perfeccionado aún más la aplicación, incorporando el tratamiento con mitomicina-C para reducir cualquier contribución de confusión de la proliferación y demostrando cómo la quimiotaxis y la quimiocinesis pueden evaluarse en el mismo entorno experimental.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención de BWH-BRI Fund to Sustain Research Excellence-Bridge Research Grant. Chen Zhang fue apoyado por el Consejo de Becas de China durante 18 meses. Ovid C. Amati y Richard T. Lee fue apoyado en parte por el Centro de Ciencia y Tecnología de la NSF CBET-0939511.
