Compuestos

Inhibidores de ALDH1A130. Los inhibidores de LDHA fueron descritos previamente en Rai et al.29. Los inhibidores de IDH1 fueron descritos previamente en Urban et al. y Davis et al.24,36. Otros compuestos utilizados en el estudio fueron Metotrexato (MedChem Express, HY-14519), Panobinostato (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomina (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) y LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Para qHTS, los compuestos de la placa de interrogación del mecanismo (MIPE) se probaron en 11 puntos (intraplaca, factor de dilución de 1:3). La colección de inhibidores de la cinasa que contenía 977 inhibidores de la cinasa se probó en dosis de 7 puntos (interplaca, factor de dilución de 1:5). En todos los casos, se utilizó DMSO como vehículo.

Clonación

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Los marcos de lectura Abiertos (ORF) de los genes de interés se clonaron en las espinas dorsales aceptoras utilizando sitios BamHI/EcoRI (N-terminal) o NheI/BamHI (C-terminal) mediante PCR amplificando la región codificante con oligonucleótidos compatibles con infusión, definidos en detalle en la Tabla Suplementaria S1. Los constructos IDH1, LDHA, DHFR, GC y ALDH1A1 fueron preparados por síntesis génica GeneArt (Termofisher) en pcDNA3.1 (+). Para la clonación de puerta de enlace (solo construcciones IDH2), se creó un vector de destino que contenía la etiqueta 86b reemplazando la etiqueta V5 en pcDNA3.2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes «LPTFLYKVVDLEGPR» prior to the 86b tag.

Cultivo celular

Se obtuvieron células HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22RV1, MDA-MB-468 y HT-29 de ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 y HTB-38, respectivamente). HuCC-T1 y CC-LP-1 fueron un regalo amable del Dr. N. Bardeesy (Hospital General de Massachusetts, Boston). Se cultivaron células HEK293T en DMEM (4,5 g/L de glucosa) con suero bovino fetal al 10% (FBS), L-glutamina de 6 mm, piruvato de sodio de 1 mM, penicilina de 50 U/ml y estreptomicina de 50 µg/mL. Se cultivaron células LN18, HT-29, CC-LP-1 y HeLa en el medio anterior, sin piruvato de sodio. Las células OV-90 se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio MCDB 105 (Cell Applications Inc.) y medio M199 (HyClone, GE), suplementado con 15% de FBS, 1% de Penicilina-Estreptomicina (Life Technologies), y una concentración final de 1,85 g/L de bicarbonato de sodio (HyClone, GE). Se cultivaron células 22RV1, HuCC-T1 y MDA-MB-468 en RPMI 1640 suplementadas con FBS al 10%, L-glutamina de 6 mm, penicilina de 100 unidades/ml, estreptomicina de 100 µg/mL. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una incubadora humidificada mantenida al 5% de CO2 y dieron negativo para micoplasma utilizando un kit de detección de micoaléridos (Lonza).

Producción y purificación de proteínas y péptidos recombinantes

Las proteínas 11S y 86b fueron producidas por GenScript. Para el fragmento recombinante de 11S, la secuencia de ADN codificante se fusionó con una etiqueta His de 6x para facilitar la purificación aguas abajo y la secuencia se subclonó en un vector de expresión de E. coli. Las células de estrella BL21 (DE3) se transformaron con plásmidos recombinantes y una sola colonia se inoculó en medio LB que contenía IPTG para la inducción de la expresión de proteínas. Se utilizaron análisis de SDS-PAGE y Western blot para monitorear la expresión y seleccionar el momento óptimo de cosecha. Las células se recolectaron por centrifugación y los gránulos se lisaron mediante sonicación. Después de la purificación de su etiqueta, las fracciones se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 µm. Las proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot utilizando protocolos estándar y un mAb anti-His de ratón (GenScript, N. o Cat. A00186). La concentración de proteína purificada se determinó mediante un ensayo de proteína Bradford con ASC como estándar. La proteína se almacenó en 1X PBS, glicerol al 10%, pH 7,4, y la pureza fue de aproximadamente 90%, según lo estimado por el análisis densitométrico del gel SDS-PAGE teñido de azul de Coomassie en condiciones reductoras. El péptido 86b de 15 aminoácidos se almacenó en dH2O ultrapuro y fue puro al 99,9% por HPLC.

Las células de bajo rendimiento (placas o tiras de PCR de 96 pocillos) del ensayo de complementación CETSA

se transfectaron en platos de 6 pocillos mediante un procedimiento de transfección inversa, donde se combinaron 1,25 ml de complejos (6,25 µL de Lipofectamina 2000 y 3 µg de ADN por pocillo) con 1,25 ml de suspensión de células HEK293T (1 × 106/ml, 1,25 × 106 células en total). Para CDK9, se utilizaron 2 µg de ADN por pocillo. Después de 24 h (48 h para CDK9), las células se recolectaron por tripsinización y se resuspendieron a 1 × 106 células/ml (a menos que se indique lo contrario) en un tampón CETSA que contenía DPBS (con CaCl2 y MgCl2) más 1 g/L de glucosa, 1 CÓCTEL inhibidor de proteasa Halt (ThermoFisher) y 0,5% de DMSO (DMSO no se añadió para experimentos que recibieron tratamiento posterior con compuestos y vehículos). Para experimentos de rango de temperatura (sin dosis compuesta o única), las muestras se alícuotas en tiras de PCR a 30 µL por tubo. Se añadió compuesto y se incubaron las células a 37 °C durante 1 h. Luego se calentaron las muestras durante 3.5 min utilizando un termociclador precalentado, se dejó equilibrar a temperatura ambiente, y se agregaron 6 µL de 6% de NP40 a cada pocillo. Para los experimentos de congelación y descongelación, los tubos se colocaron en un bloque de PCR de aluminio en un baño de hielo seco/etanol durante 3 minutos, seguido de incubación a 37 °C durante 3 minutos, torbellino durante 3 segundos y repetir estos pasos tres veces más. Se añadieron 11S (GenScript) y sustrato de furimazina (del Sistema de Ensayo de Luciferasa Nano-Glo, Promega), a concentraciones finales de 100 nM y 0.5X, respectivamente, y las muestras se analizaron para determinar la intensidad de luminiscencia utilizando un generador de imágenes CCD de alto rendimiento ViewLux (Perkin Elmer) equipado con filtros transparentes.

Ensayo CETSA de 384 pocillos

Se transfectaron células en matraces T75 mediante un procedimiento de transfección inversa, en el que se combinaron 9 mL de complejos (45 µL de Lipofectamina 2000 y 22,5 µg de ADN) con 10 ml de suspensión de células HEK293T (1 × 106 células/ml, 10 millones de células en total). Después de 24 h, las células se recolectaron por tripsinización, se resuspendieron a 1 × 106 células/ml como se describió anteriormente y se dispensaron (células de 15 µL/pocillo) en placas de PCR de 384 pocillos (Roche) utilizando un Combi de Múltiples gotas (Termofisher). Los compuestos (63 nL) o el control DMSO del vehículo (63 nL) se fijaron posteriormente con una herramienta de fijación (GNF) y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Las placas se sellaron y calentaron a la temperatura indicada durante 3,5 min y se enfriaron a 25 °C con una máquina AB qPCR (Roche) con una velocidad de rampa de 1,5 °C/seg para la fase de calentamiento y una velocidad de rampa máxima para la fase de enfriamiento. Se añadieron tres µL de NP40 al 6% por pocillo y se incubaron durante 30 minutos para permitir la lisis celular seguida de la adición de sustrato de 11S y furimazina (a concentraciones finales de 100 nM y 0,5 X, respectivamente). Las muestras se analizaron para determinar la intensidad de la luminiscencia utilizando un lector ViewLux.

Las células del ensayo CETSA de 1.536 pocillos

se transfectaron y se cosecharon como se indica anteriormente (protocolo de 384 pocillos). Se dispensaron células (5 µL de célula / pocillo) en placas blancas de 1.536 pocillos (Aurora, polímero de olefina cíclica, cat# EWB041000A) utilizando una combinación de múltiples gotas. Los compuestos (23 nL) se fijaron posteriormente con una herramienta de fijación (Automatización Wako) y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Las placas se calentaron a la temperatura y el tiempo indicados utilizando un bloque calefactor (véase más adelante) y se enfriaron a 25 °C. Se añadió un µL de 6% de NP40 por pocillo y las placas se incubaron durante 30 minutos para permitir la lisis celular, seguida de la adición de 3 µL de 11S (concentración final de 100 nM) y sustrato de furimazina. Las placas se centrifugaron y se analizaron para determinar la intensidad de luminiscencia utilizando un lector ViewLux. Para las pantallas LDHA y CDK9, una concentración final de 0,5 X y 0.Se utilizó 25 VECES furimazina, respectivamente. Los controles de normalización incluyen muestras tratadas con DMSO y GSK2837808A o muestras sin calentar para LDHA y CDK9, respectivamente. La pantalla lcd CDK9 se realizó como se indica anteriormente con las siguientes diferencias: 5 µL de células HEK293T no transfectadas (1 × 106/ml en tampón CETSA) se dispensaron en placas de 1.536 pocillos, seguidas de adición de compuesto, incubación a 37 °C, calentamiento y pasos de lisis como se indica anteriormente. Posteriormente, se agregaron 500 pM (final) de 86b a los pozos, seguido de la adición de 100 nM 11S y 0,25 X sustrato de furimazina (final).

El bloque de aluminio para calentar una placa de 1.536 pocillos se diseñó midiendo una placa para determinar las dimensiones del área bordeada por costillas de refuerzo moldeadas en X e Y, y la cara del pozo inferior y la cara de la brida inferior en Z. Luego se moldeó un bloque a mecanizar a partir de la placa de aluminio 6061 T6, que sería un ajuste libre con aproximadamente 0,5 mm de espacio libre para la placa en todos los ejes. El bloque se mecanizó utilizando una fresadora vertical manual, fresas de extremo y una fresadora frontal. Para los experimentos de calentamiento de hornos, las placas se colocaron en la rejilla central del horno de laboratorio de convección (termofisher) y se cubrieron con tapas metálicas para minimizar la evaporación.

CETSA en lisados celulares

Se recolectaron células en tampón CETSA a 1,0 × 106 células/ml (como se indicó anteriormente) y se añadió NP40 a una concentración final de 0,4%. Después de rotar las muestras de extremo a extremo durante 30 min (temperatura ambiente), los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 20.000 × g durante 10 min (4 oC). Se añadió un cofactor (por ejemplo, NAD+) al lisado clarificado. Para los experimentos de respuesta a la temperatura, se transfirieron 25 µL de lisado a tubos de PCR y se calentaron durante 3,5 min a varias temperaturas. Para experimentos isotérmicos de respuesta a la dosis, se dispensaron 5 µL de lisado clarificado en placas de 1536 pocillos utilizando una estación de trabajo BioRAPTR FRD y las muestras se calentaron en un bloque de aluminio. Se permitió que las muestras se equilibraran a temperatura ambiente y se añadió sustrato (concentración final: 100 nM 11S, 0,5 X furimazina). La luminiscencia se capturó utilizando un visualizador de imágenes ViewLux, como se indicó anteriormente.

Las muestras de Western blots

se procesaron como se indica en la sección de ensayo de complementación de bajo rendimiento, utilizando ciclos de congelación y descongelación para la lisis. Los lisados se centrifugaron a 15,200 × g durante 20 min a 4 ° C. Las muestras se procesaron en un gel de NuPAGE Bis-Tris de 4-12% (TermofIsador) utilizando tampón de MOPAS y se transfirieron a una membrana de PVDF utilizando un sistema de transferencia iBlot 2 a 25 V durante 7 min. Las membranas se bloquearon con una solución de leche al 5% (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) y los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C en la solución de bloqueo. Anticuerpos fueron: anti-IDH1 (, Señalización celular # 8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Miliporo #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, Señalización Celular #3582, 1: 1000). Anti-conejo/ratón-HRP (conejo = Señalización celular 7074; ratón = Señalización celular # 7076) se añadió a 1:2500 y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Se generó una señal quimioluminiscente con la solución west dura Supersignal (Termofisher) y se capturó utilizando un sistema Chemidoc Biorad. El análisis densitométrico se realizó con el software Photoshop (Adobe).

Ensayo de 2-HG

Células HEK293T transfectadas inversamente en platos de 24 pocillos mediante la adición de 2.5 × 105 células en complejos de transfección (0,75 µg de ADN plásmido, 1,5 µL de lipofectamina 2000 por pocillo). El medio de cultivo celular se recolectó después de 72 h y 15 µL se transfirieron a una placa opaca de 384 pocillos. Se añadieron 1,5 µL de HCl de 660 mM a cada pocillo y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió a cada pocillo 1,5 µL de base Tris-HCl de 720 mm. Luego, 52 µL de solución de detección de 2-HG (HEPES de 100 mM (pH 8,0), 100 µM NAD +, 1 µg / ml D-2-Hidroxiglutarato deshidrogenasa recombinante activa (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), resazurina de 5 µM, 0,03 mg/ml diaforasa (Sigma, Cat: D5540) y la placa se incubó a temperatura ambiente. Se preparó una curva estándar de 2 HG en HEPES de 100 mM (pH 8,0). La fluorescencia se midió en un lector ViewLux utilizando filtros Ex: 525, Em: 598/25.

Ensayos bioquímicos

El ensayo bioquímico de LDHA se realizó como se describió previamente29. Brevemente, 3 µL de lactato deshidrogenasa humana 5 (2 nM final) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) en el tampón de ensayo de LDH (200 mm Tris HCl, pH 7,4, EDTA de 100 µM y 0,01% de interpolación-20) se añadió a una placa de ensayo de fondo sólido negro de 1536 pocillos (Greiner Bio-One). Tras la transferencia de pin compuesto (23 nL), se dispensó 1 µL de solución de sustrato que contenía NADH (0,06 mm final) y piruvato de sodio (0,2 mm final) (Sigma-Aldrich) en tampón de ensayo de LDH para iniciar la reacción. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió 1 µL de reactivo de detección a cada pocillo. Las placas se transfirieron inmediatamente a un lector ViewLux y se midió cualquier fluorescencia de resorufina resultante (ex 540 nm, em 590 nm) a los 0 y 10 min. La fluorescencia se normalizó utilizando pocillos de control libres de enzimas y tratados con DMSO en cada placa.

El ensayo bioquímico ALDH1A1 utilizando proteína no etiquetada se realizó como se describió previamente31, 37. Brevemente, se dispensaron 3 µL de ALDH1A1 humano purificado de 20 nM en tampón de ensayo (100 mM HEPES pH 7,5 con 0,01% de interpolación 20) en una placa negra de fondo sólido de 1.536 pocillos (Greiner Bio One). Veintitrés NL de compuestos o bahía de control 11-7085 se transfirieron a través de una herramienta de pasador (Automatización Wako). Las muestras se incubaron (a temperatura ambiente, protegidas de la luz) durante 15 minutos, seguidas de una adición de sustrato de 1 µL de NAD + y propionaldehído (concentraciones finales de 1 mM y 80 µM, respectivamente). Las placas se centrifugaron y leyeron en modo cinético en un visor de imágenes equipado con filtros de excitación de 340 nm y emisión de 450 nm durante 5 min. El cambio en la intensidad de fluorescencia durante los 5 min se normalizó utilizando pocillos de control libres de enzimas y tratados con DMSO en cada placa.

El ensayo de unión de cinasas TR-FRET Lanthascreen Eu para CDK9 / ciclina K se compró a ThermoFisher y se realizó según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se distribuyeron 4 µL de una mezcla maestra que contenía 4 nM CDK9/Ciclina K (Invitrogen #PV4335), 2 nM Biotina Anti-His Ab, 2 nM Eu-Estreptavidina y 10 nM de Solución Trazadora de Quinasas 236 en 1X Tampón de quinasa en placas de unión de medio blanco Greiner de 1.536 pocillos utilizando una estación de trabajo BioRAPTR FRD. Veintitrés nL de compuesto y controles (DMSO y LY2857785 a una concentración final de 6 µM) se entregaron inmediatamente a las placas de ensayo mediante transferencia de herramienta de pasador. Se permitió incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente, y posteriormente se midió la fluorescencia TR-FRET con un lector de placas multilabel PerkinElmer EnVision (Ej: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; Tiempo de retardo 100 µs; tiempo de integración 200 µs).

Ensayo de producción de lactato

Las células HEK293T se cultivaron como se describió anteriormente. Las células se enjuagaron con PBS, se tripsinizaron y se resuspendieron en DMEM libre de rojo fenólico (Life Technologies) sin suplementos. Las células se platearon inmediatamente en placas de fondo transparentes negras de 1536 pocillos (Corning) a 250 células por pocillo en un volumen de 4 µL. Se añadió un control compuesto o de vehículo a los pocillos mediante transferencia de herramienta de pasador y se incubaron células a 37 °C durante 1 h.Se agregaron dos µL de mezcla de reacción de lactato (Biovision K607-100) a cada pocillo y se cubrieron las placas e incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. La fluorescencia se midió con un equipo de microplacas ViewLux equipado con filtros Ex/Em de 528/598 nm.

Ensayo de aldefluor

Para la determinación inicial de la actividad ALDH1A1 marcada con 86b, se transfectaron células mediante un procedimiento de transfección inversa, en el que se combinó 1 mL de complejos (6 µL de Lipofectamina 2000 y 3 µg de ADN) con 1 mL de suspensión celular LN18 (5 × 105/ml) y 100 µL / pocillo de mezcla en placas negras de fondo transparente de 96 pocillos (Corning). Después de 24 h, se eliminó el medio y se reemplazó con 100 µL/pocillo de tampón de aldefluor (STEMCELL Technologies) que contenía sustrato BAAA y Hoechst 33342 (termofisher, concentraciones finales de 500 nM y 0,5 nM, respectivamente). Posteriormente se añadió DMSO o DEAB del vehículo (1 µM final) y se incubaron placas durante 30 minutos a 37 °C para permitir la conversión de BAAA en BAA. Se lavaron las células y se dispensaron 100 µL/pocillo de tampón de aldefluor antes de la obtención de imágenes en una célula 2200 (GE Healthcare). Para los ensayos de alto rendimiento, las células LN18 se transfectaron en matraces T75 utilizando un procedimiento de transfección inversa como se describió anteriormente para los ensayos HEK293T CETSA de alto rendimiento. Después de 16 h, se recolectaron células y se platearon (1.000 células/pocillo/5 µL) en placas negras de fondo transparente de calidad óptica de 1.536 pocillos tratados con TC (microplacas Aurora) utilizando un dispensador combinado de Múltiples gotas y se incubaron durante la noche a 37 °C. El ensayo de alto contenido de aldefluor se realizó posteriormente en células LN18 transfectadas u OV-90 no transfectado31, como se describió anteriormente. Las imágenes se analizaron utilizando el algoritmo de análisis de múltiples objetivos enlatados (GE Healthcare) del software de análisis IN Cell Investigator v1.6.2, como se describe.

Ensayo de integridad térmica de membrana

Se prepararon 30.000 células HEK293T en tampón CETSA de 30 µL que contenía 1 cóctel inhibidor de proteasa (TermofIsador) suplementado con 0,5% DMSO (1,5% DMSO total). Para el experimento de tolerancia DMSO, se agregó DMSO a DPBS a 0, 1, 2 o 3%. Las suspensiones de celdas se calentaron durante 3,5 min a 42 a 74 °C, utilizando intervalos de 4 grados, y luego se retiraron a un bloque de aluminio sobre hielo húmedo. Las suspensiones celulares se mezclaron con partes iguales de Azul Tripano (LONZA) (=0,2% de azul tripano) y se contaron inmediatamente utilizando un hemocitómetro C-chip (iNCyto, Corea). Se contaron Tripan positivo (permeabilizado) y negativo (intacto), con n = 2 a cada temperatura. Para líneas celulares adicionales, se preparó un millón de células en 100 µL de DMEM libre de rojo fenólico que contenía un 1% de DMSO. Las celdas se calentaron durante 3 minutos a más de 42 a 90 °C a intervalos de 4 grados, y luego se retiraron a un bloque de aluminio sobre hielo húmedo. La integridad de la membrana se evaluó como se describió anteriormente.

PAMPA

El método PAMPA de doble fregadero de agitación patentado por pION Inc. (Billerica, MA)se utilizó para medir la permeabilidad de los compuestos como se describió previamente38. Los compuestos se diluyeron en soluciones de donantes y aceptores tamponadas a pH7, 4 y la concentración de DMSO fue de 0,5%. Los cálculos de permeabilidad se realizaron utilizando Pion Inc. software.

Análisis qHTS

Los datos de cada ensayo se normalizaron en función de la placa a los controles correspondientes, como se describió previamente39. También se utilizaron los mismos controles para el cálculo del factor Z’ para cada ensayo. El porcentaje de actividad se obtuvo utilizando software interno (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Se ajustaron todas las curvas de concentración-respuesta y se calculó el AC50 con el software GraphPad Prism; las curvas se clasificaron como se describió previamente27. El área bajo la curva (AUC) se calculó utilizando la regla trapezoidal para aproximar el área entre la curva de respuesta y el eje x en todo el rango de concentración. Se utilizaron rangos de concentración equivalentes para todos los compuestos dentro de un experimento. Se utilizó un límite de eficacia de 3 σ de la media (del control del vehículo) para clasificar los compuestos activos.