El hongo Candida guilliermondii está ampliamente distribuido en la naturaleza, incluida la microbiota humana de la piel y las superficies mucosas.22 Aunque esta especie muestra una virulencia reducida en comparación con otras especies de Cándida,3 actualmente se considera un patógeno emergente, con una incidencia mayor en América Latina.18C. guilliermondii ha sido reconocido como el agente etiológico de una amplia variedad de infecciones clínicas, incluidas las diseminadas principalmente en pacientes inmunodeprimidos, 22 y los brotes nosocomiales en pacientes quirúrgicos con dispositivos intravasculares.13 Actualmente, el tratamiento recomendado para la candidiasis invasiva en pacientes neutropénicos incluye caspofungina (CFG) o micafungina (MFG) como terapias de primera línea, la anfotericina B liposomal (CORDERO) y la anidulafungina (AFG) como alternativas, mientras que el fluconazol (FLC) se recomienda solo cuando se confirma la susceptibilidad a este medicamento.23 Sin embargo,varios estudios han demostrado que C. guilliermondii tiene una susceptibilidad disminuida a FLC8,15, 19, y se han notificado fracasos terapéuticos asociados con aislados con concentraciones inhibitorias mínimas (CMI) de anfotericina B (AMB) altas.9,12,24 Aunque casi el 90% de los aislados muestran MICRAS de equinocandinas iguales o inferiores a los puntos de corte clínicos (PBC) de susceptibilidad (2 µg/ml) 17,similares a otras especies de Cándida, como C. parapsilosis, algunos aislados de C. guilliermondii muestran micras considerablemente altas.8,15 Los datos disponibles sobre la eficacia de la AFG en la candidiasis invasiva son limitados y el papel potencial de ese fármaco en la práctica clínica es poco conocido.23 En este contexto, los estudios en animales pueden desempeñar un papel importante para una mejor comprensión de la correlación in vitro–in vivo.11 Por lo tanto, nuestro objetivo principal fue evaluar las actividades in vitro e in vivo de AFG frente a diferentes aislados de C. guilliermondii, comparando los resultados con los de AMB y FLC.
Materiales y métodos Aislados de fungales
Cuatro aislados clínicos de C. en el estudio in vitro se utilizaron guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 y UTHSC 10-3207) y se seleccionaron dos de ellos (UTHSC 11-685 y UTHSC 11-142) para el modelo murino en función de sus diferentes susceptibilidades in vitro. Los aislados se identificaron secuenciando la región del espaciador transcrito interno (ITS) y los dominios D1–D2 del ARNr, comparando las secuencias con las de la cepa tipo de esta especie.
Estudios in vitro
La susceptibilidad in vitro de las cuatro cepas a AMB, FLC y AFG se evaluó utilizando un método de microdilución de caldo de referencia, 6candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 6258 se incluyeron como controles de calidad.
Se desarrollaron curvas de tiempo muerto para todas las cepas de acuerdo con estudios previos.5,20 En resumen, se preparó una solución madre de cada antifúngico, AMB (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, USA) y AFG (Pfizer Inc., Madrid, España) se disolvieron en dimetilsulfóxido y FLC (Pfizer Inc., Madrid, España) en agua destilada. Además, se prepararon diluciones de medicamentos en 9 ml de medio RPMI 1640 estándar para obtener concentraciones de 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 y 32 µg / ml de cada fármaco. Los aislados se subculturaron a 35 ° C durante 24 horas en placas de agar de dextrosa de patata (PDA). Los cultivos de C. guilliermondii se suspendieron en solución salina estéril y las suspensiones resultantes se ajustaron a 5×106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml mediante recuentos de hemocitómetros y mediante placas seriadas en PDA para confirmar la viabilidad. Se inocularon diluciones y controles (libres de fármacos) con 1 ml de suspensiones fúngicas, lo que resultó en un inóculo inicial de 5×105 UFC / ml, y se incubaron a 35 ° C. Se recogió una alícuota de 100 µl de cada tubo en 0, 2, 4, 6, 8, 24, y 48h después de la inoculación y diluidos en agua destilada; 30 µl de ellos se cultivaron en placas de PDA y se incubaron a 35°C durante 48h para la determinación de UFC/ml. Se consideró fungicida una disminución de UFC de ≥99,9% o 3 unidades log10 en comparación con el inóculo inicial, mientras que se consideró fungistático una reducción de
unidad log10. El límite de detección fue de 50 UFC / ml. Todos los estudios de la curva de pérdida de tiempo se realizaron en duplicate.In en el experimento se utilizaron estudios vivos
de ratones macho DE-1 (Charles River; Criffa SA, Barcelona, España) con un peso medio de 30 g. Los ratones se alojaban en cajas estándar con acceso gratuito a alimentos y agua. Todos los procedimientos con animales fueron supervisados y aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la Universitat Rovira i Virgili.
Los ratones se volvieron neutropénicos un día antes de la infección mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de 200 mg/kg de ciclofosfamida (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, España) más una inyección intravenosa (i.v.) inyección de 5-fluorouracilo (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, España)a 150 mg / kg.10,14 El día de la infección, los ratones fueron desafiados por vía intravenosa con 1×108 UFC/animal de cada una de las dos cepas de C. guilliermondii, UTHSC 11-685 y UTHSC 11-142, en 0,2 ml de solución salina estéril en la vena lateral de la cola.Se establecieron aleatoriamente 3,4 Grupos de ocho animales para cada cepa y fármaco. Los grupos fueron tratados de la siguiente manera: desoxicolato de anfotericina B (AMBd) (Farmacia Xalabarder, Barcelona, España) a dosis de 0,8 mg/kg por vía intravenosa una vez al día (QD); anfotericina B liposomal (CORDERO) (Gilead Sciences S.A., Madrid, España) a 10 mg / kg i. v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, España) a 25 mg/kg por vía oral (p. o.) por sonda, dos veces al día (BID); y AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Reino Unido) a 10 mg / kg de peso corporal / dosis i. p., QD. Todos los tratamientos comenzaron 24h después del desafío y duraron 7 días. Los controles no recibieron tratamiento. Para prevenir infecciones bacterianas, todos los ratones recibieron 5 mg/kg de ceftazidima al día por vía subcutánea de los días 1 a 7 después de la infección. Los ratones se controlaron diariamente y se practicaron la eutanasia el día 8 después de la infección por anoxia de CO2. La eficacia de cada fármaco se evaluó mediante la reducción de la carga tisular y estudios histopatológicos. Los riñones fueron extraídos asépticamente, y uno de ellos fue pesado y homogeneizado en 2 ml de solución salina estéril. Las diluciones seriadas de 10 veces de los homogeneizados se platearon en PDA y se incubaron durante 48 horas a 35 ° C para el cálculo de UFC/g. Para el estudio histopatológico, el riñón restante se fijó con formalina tamponada al 10%, deshidratada, incrustada en parafina y cortada en secciones de 2 µm, que se teñieron con hematoxilina–eosina (H-E) y tinción de ácido periódico-Schiff (PAS) para su examen por microscopía de luz.
Estadísticas
Los recuentos de colonias de tejido se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney, utilizando Graph Pad Prism 4.0 para Windows (Software GraphPad, San Diego, CA, EE.UU.). Cuando los valores de P estaban por debajo de 0,05, las diferencias se consideraron estadísticamente significativas.
Resultados Estudios in vitro
Las MICs de AMB fueron de 0,25–1µg/ml, 0,06–0,25 µg/ml para AFG y 0,5–1µg/ml para FLC. Tras los valores de corte de susceptibilidad para AMB, FLC y AFG frente a C. guilliermondii, 16 todos los aislados fueron susceptibles a los tres fármacos. La susceptibilidad de las cepas de control de calidad estaba dentro de los rangos aceptados.6
La cinética de muerte del AMB mostró una actividad fungicida rápida que aumentaba con la concentración del fármaco. A concentraciones equivalentes a la CIM, ese fármaco mostró un efecto fungicida contra tres de los cuatro aislados analizados (Fig. 1). Esta actividad comenzó inmediatamente después de la inoculación a concentraciones superiores a 1 µg/ml, alcanzándose el punto final fungicida después de 4 horas a 32 µg/ml. La AFG en concentraciones superiores a 0,5 µg/ml mostró actividad fungicida que comenzó después de 4 horas de incubación. La variable fungicida se alcanzó a las 12–24h de incubación a 32 µg/ml (Fig. 2). El FLC mostró actividad fungistática contra los cuatro aislados (Fig. 3).
Ensayos cinéticos que matan el tiempo de AMB contra cuatro cepas de C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ○ ) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, ( ▿ ) 8 µg/ml, ( ♦ ) 32 µg/ml, ( ● ) control. Las líneas discontinuas representan una disminución de UFC de 3 log 10 unidades en crecimiento en comparación con el inóculo inicial (actividad fungicida), las líneas punteadas indican el límite de cuantificación de la prueba.
Ensayos cinéticos que matan el tiempo de AFG contra cuatro cepas de C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ○ ) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, ( ▿ ) 8 µg/ml, ( ♦ ) 32 µg/ml, ( ● ) control. Las líneas discontinuas representan una disminución de UFC de 3 unidades log10 en crecimiento en comparación con el inóculo inicial (actividad fungicida), las líneas punteadas indican el límite de cuantificación del ensayo.
Ensayos cinéticos que matan el tiempo de FLC contra cuatro cepas de C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ● ) 1 µg/ml, (Δ)2 µg/ml, (▿) 8 µg/ml, ( ♦ ) 32 µg/ml, ( ● ) control. Las líneas discontinuas representan una disminución de UFC de 3 log 10 unidades en crecimiento en comparación con el inóculo inicial (actividad fungicida), las líneas punteadas indican el límite de cuantificación de la prueba.
Los estudios in vivo
EL CORDERO a 10 mg / kg fue el único fármaco capaz de reducir la carga fúngica en los riñones de ratones infectados con cada una de las dos cepas, siendo la reducción significativamente mayor que la de las otras terapias (P≤0,04). La AMBd y el FLC solo fueron capaces de reducir la carga tisular en ratones infectados con la cepa que mostró los MICs más bajos para estos dos fármacos, es decir, 0,25 µg/ml para el AMB y 0,5 µg/ml para el FLC (P≤0,008). En el caso de la GAF, la reducción de la carga fúngica fue modesta y menor que la de la DAM, y redujo significativamente la carga tisular en el riñón solo con respecto al grupo control para la cepa UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 y FLC 50; cP0.05 versus AFG 10 y FLC 50.
El estudio histológico mostró infiltración focal de células fúngicas en riñones de animales no tratados y en ratones tratados con AMBd, FLC o AFG. Los riñones de ratones tratados con CORDERO solo mostraron una invasión fúngica leve. No se observaron signos de necrosis, respuesta inflamatoria o alteraciones del parénquima en los controles ni en los animales tratados (Fig. 5).
Discusión
Los estudios in vitro no demostraron disminución de la susceptibilidad de C. guilliermondii, aísla a la FLC o AFG. De acuerdo con estudios previos, las curvas de tiempo muerto del AMB mostraron una actividad fungicida dependiente de la concentración frente a todos los aislados4,5,7 y el FLC mostró un efecto fungistático independientemente de la concentración probada.7 Se sabe que la AMBd presenta una mayor eficacia que su formulación lipídica, especialmente en riñón, cuando se administra en ambas dosis.1 Sin embargo, los estudios farmacocinéticos mostraron que tras la administración de 0,75 mg/kg de AMBd, la Cmax de AMB alcanzada en suero de ratones fue de 0,30 µg/ml.25 Sin embargo, la CMI AMB de uno de los dos aislados analizados es superior a este valor, por lo que se utilizó una dosis alta de CORDERO para alcanzar concentraciones más altas.1 De hecho, la administración de CORDERO a 10 mg / kg fue eficaz para reducir la carga fúngica de ambas cepas. Este hecho se correlacionó con las curvas de matanza, donde el AMB logró su actividad fungicida contra los dos aislados probados in vivo, a concentraciones de 1µg/ml. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que intentó establecer una relación entre la cinética de matanza y la eficacia experimental in vivo de AFG y FLC contra aislados clínicos de C. guilliermondii. Solo existe un estudio previo sobre equinocandinas, en particular sobre caspofungina (CFG) en la infección diseminada por C. guilliermondii. CFG a 1 mg / kg fue eficaz para reducir la carga fúngica renal en ratones infectados con una cepa de C. guilliermondii con una CMI de 8 µg/ml, mientras que time killing reveló que no se alcanzó actividad fungicida a concentraciones de 64 µg/ml.4 Por el contrario, nuestro estudio mostró una actividad dependiente de la concentración de AFG, que a 32 µg/ml ejerció una actividad fungicida,como se informó anteriormente, 17 a las 24h y a 8 µg/ml. Estudios previos informaron concentraciones de AFG en suero y riñón de aproximadamente 13 µg / ml después de 7 días de tratamiento a dosis de 10 mg/kg.21 Aquí, la AFG fue capaz de reducir solo modestamente la carga fúngica en los riñones de ratones neutropénicos infectados con una de las dos cepas analizadas, lo que no parece estar relacionado con la baja diferencia de MICs de AFG entre las dos cepas analizadas (1 dilución), lo que sugiere que la respuesta al tratamiento con AFG depende de la cepa. Del mismo modo,el FLC también solo fue capaz de reducir ligeramente la carga fúngica en el riñón de ratones desafiados con una de las dos cepas a pesar de la dosis administrada que alcanza concentraciones séricas superiores a la CMI, 2 lo que tampoco fue sorprendente debido a su actividad fungistática.
En conclusión, nuestro estudio mostró la mayor actividad y eficacia del CORDERO frente a las dos cepas de C. guilliermondii, en contraste con el pobre efecto de FLC y AFG. Sin embargo, se deben llevar a cabo estudios adicionales con más aislados de C. guilliermondii que representen una gama más amplia de CMI de AFG para evaluar si existe alguna relación entre los valores de CMI y la eficacia de AFG.
Conflicto de intereses
Ninguno que declarar.
