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El tratamiento para el Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) se ha complicado al aumentar las tasas de resistencia a los antibióticos. Las cepas de SARM expresan la proteína de unión a penicilina 2a (PBP2a), codificada por mecA, que proporciona resistencia a los β-lactámicos al proteger la serina reactiva en una hendidura estrecha e inaccesible, permitiendo que la síntesis de la pared celular continúe en presencia de antibióticos (1, 2). Ceftobiprol y ceftarolina son cefalosporinas anti-SARM que inhiben la PBP2a a concentraciones terapéuticas útiles. El grupo R2 de ceftobiprol se extiende a la hendidura estrecha de PBP2a para acceder al sitio activo, mientras que la unión de ceftarolina causa un cambio alostérico en PBP2a, revelando el sitio activo para la unión de una segunda molécula (3, 4). El ceftobiprol se ha evaluado en ensayos clínicos, y la ceftarolina está aprobada por la FDA para el tratamiento de infecciones de la piel y de la estructura de la piel, incluidas las causadas por SARM (5-10).

Estudios previos de nuestro grupo han demostrado que el paso de la cepa COL en ceftobiprol selecciona mutantes resistentes con mutaciones en PBP2a (11). Este estudio examina si el pasaje de ceftarolina también selecciona mutaciones similares. Los experimentos de Passage se llevaron a cabo con dos orígenes de SARM diferentes: COL, un aislado arcaico de resistencia homogénea de 1961, y SF8300, una cepa contemporánea de SARM USA300 de resistencia heterogénea. COLnex y SF8300ex, cepas derivadas mecA negativas de COLn y SF8300, se obtuvieron mediante (12) escisión del cromosoma de casete estafilocócico cromosómico mec (SCCmec) (13). La mecA de tipo silvestre se reintrodujo en plásmido pYK20 (derivado del plásmido pAW8 y que contiene mecA de tipo silvestre clonado de COL ) en COLnex y SF8300ex para estudios de pasaje. Si la mecA mediaba la resistencia, entonces curar un mutante resistente del plásmido o introducirlo en un fondo susceptible debería resultar en pérdida o ganancia de fenotipo, respectivamente, lo que permitiría determinar la contribución de la mecA a la resistencia. Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas 1 y 2. COLnex (pYK20) y SF8300ex(pYK20) se pasaban en serie en caldo de soja triptico que contenía concentraciones crecientes de ceftarolina (Laboratorios Forestales) como se describió anteriormente (11).

Después de 28 días, COLnex(pYK20) y SF8300ex(pYK20) pasados en ceftarolina produjeron dos mutantes, COLnexpT(pYK20COLT*) y SF8300expT(pYK208300T*) (un asterisco indica un plásmido generado durante la selección de ceftobiprol o ceftarolina en un fondo COL o SF8300) (Tabla 1). Los MICs a ceftarolina, ceftobiprol y otros β-lactámicos (Sigma-Aldrich) se determinaron mediante el método de dilución de caldo de acuerdo con los estándares CLSI (Tabla 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT*) expresó resistencia de alto nivel tanto a ceftarolina como a ceftobiprol, con MICs de 64 µg/ml y 32 µg/ml, respectivamente. SF8300expT (pYK208300T*) expresó resistencia de bajo nivel en el día de paso 4, con una CMI de 4 µg/ml, que se mantuvo sin cambios a pesar de 24 pasajes más (Tabla 3 y Fig. 1). El mutante previamente descrito de ceftobiprol de COLnex(pYK20) (11), COLnexpB(pYK20COLB*), mostró una resistencia de alto nivel tanto a ceftobiprol como a ceftarolina, con una CMI de 64 µg/ml para cada uno.

mecA plásmido se secuenció para mutaciones en cepas pasadas. Dado que las PBP son el objetivo de los β-lactámicos, las pbp1, -2, -3 y -4 también se secuenciaron. Por último, se secuenciaron el gdpP y el acrB, ya que se habían identificado mutaciones en estos genes en un mutante mecA negativo resistente a ceftobiprol de COL (16). El plásmido pYK208300T* (pYK20 de SF8300ex passaged en ceftarolina), tenía una mutación de un solo punto (G a A en la posición de secuencia de codificación 1339) en mecA, lo que resultó en un cambio de aminoácido no sinónimo, E447K. No hubo mutaciones presentes en otros genes PBP, acrB o gdpP (Tabla 4).

Plásmido pYK20COLT* (pYK20 de COLnex pases en ceftaroline) no tenían mutaciones en el gen mecA. Se encontró una mutación puntual (C a T en la posición 1327 de CDS) que introduce la mutación H443Y en GdpP, una mutación puntual (G a A en la posición 466 de CDS) que introduce la mutación D156N en PBP2, y dos mutaciones puntuales (A a G en la posición 601 de CDS y C a G en la posición 723 de CDS) que introducen mutaciones T201A y F241L en PBP4 (Tabla 4). Cabe destacar que el paso de ceftarolina de COL que contiene mecA en su ubicación cromosómica natural también resultó en un mutante con resistencia de alto nivel pero sin mutaciones en mecA (datos no mostrados). El análisis de secuencias de ese mutante pasado reveló una mutación puntual en pbp2 (G a A en la posición CDS 1891), dando como resultado el cambio de aminoácido G631S, y una en pbp4 (T a A en la posición CDS 414), introduciendo una mutación N138K. Estos datos indican que, incluso en presencia de mecA, la ceftarolina puede seleccionar mutaciones en otros genes, lo que resulta en resistencia.

El curado de COLnexpB (pYK20COLB*) y SF8300expT(pYK208300T*) de sus plásmidos, cada uno de los cuales tenía mutaciones mecA, disminuyó la media de todos los β-lactámicos analizados (Tablas 5 y 6). La curación de COLEXPT (pYK20COLT*) de su plásmido, que carecía de mutaciones mecA, no tuvo efecto en los MICs (Tabla 5). La transformación de pYK20COLB*, que contiene 6 mutaciones de sustitución en mecA, en el progenitor del macho del coronel susceptible, produciendo el macho del transformador (pYK20COLB*), dio lugar a una resistencia de alto nivel a ceftarolina y ceftobiprol. La transformación de pYK208300T*, que contiene la mutación única E447K en mecA, en macho, dando lugar al transformador de macho (pYK208300T*), dio lugar a una resistencia de alto nivel a ceftobiprol (CIM de 64 µg/ml), pero solo a una resistencia de bajo nivel a ceftarolina (CIM de 4 µg/ml) (Tabla 5). La transformación de pYK20COLB* en SF8300ex, produciendo el transformante SF8300ex(pYK20COLB*), resultó en una resistencia de alto nivel a ceftarolina y ceftobiprol (CIM de 32 µg/ml para cada uno) (Tabla 6). Los múltiples intentos de transformar SF8300ex con pYK208300T * no tuvieron éxito.

Un solo cambio de aminoácido en E447 en mecA parece desempeñar un papel clave en resistencia. Está presente en COL con ceftobiprol (entre otras mutaciones) (11), es la única mutación mecA en el SF8300 con ceftarolina, y se ha notificado en aislados clínicos (17, 18). Estructuralmente, E447 reside en el dominio de unión a penicilina de PBP2a e interactúa con el grupo R2 de ceftobiprol y otros β-lactámicos (3, 19). El E447K confirió resistencia a ceftobiprol de alto nivel y resistencia a ceftarolina de bajo nivel en el fondo del macho coln, probablemente debido a diferencias estructurales entre los dos compuestos. Las mutaciones múltiples en mecA producen una resistencia de alto nivel a ambos antibióticos (20). El origen genético también juega un papel. El SF8300 heterogéneo transportado en ceftarolina desarrolló una resistencia de bajo nivel a ceftobiprol y ceftarolina con E447K (CMI 4 µg/ml). Esta mutación se ha asociado con resistencia de bajo nivel a ceftarolina en aislados clínicos (17).

En conclusión, el paso en ceftarolina o ceftobiprol selecciona una mutación E447K en PBP2a, una mutación encontrada en aislados clínicos resistentes a ceftarolina, lo que subraya su importancia en la mediación del fenotipo de resistencia (17, 18). Aunque no se realizó la secuenciación del genoma completo, que es una limitación de este estudio, otros genes que no sean mecA juegan un papel porque el nivel de resistencia difería entre los fondos COL y SF8300 al introducir la mutación E447K y el mutante COL pasante altamente resistente no tenía mutaciones mecA. Aunque es probable que haya otros, las mutaciones en los genes que codifican PBP4 y GdpP parecen ser particularmente importantes, ya que se han identificado repetidamente en mutantes pasados por ceftobiprol y ceftarolina. El papel de estos y otros genes está bajo investigación activa.