La NBN se degrada de manera eficiente mediante la heterodimerización de PROTACS VHL-CRBN
La tecnología PROTAC utiliza ligasas E3 para destruir las proteínas diana. Por lo tanto, nos preguntamos si una ligasa E3 en sí misma puede ser ubiquitinada y degradada por otra ligasa E3 si dos ligasas E3 diferentes se colocan en proximidad. Los degradadores del VHL podrían ser potencialmente sustitutos de la eritropoyetina mediante la activación de HIF1a. Para diseñar esto, conectamos pomalidomida, una molécula dirigida al NCR, con el VHL032, un ligando de la ligasa VHL E3 (Fig. 1A). El enlazador conectaba el grupo amino de pomalidomida y el grupo acetilo terminal de VH032; debido a que estas son regiones expuestas al disolvente, una conexión entre ellas probablemente no perturbaría su unión a cada ligasa E3. Para la síntesis de PROTACs heterodimerizantes BVS-NBN (Fig. 1B y Suplemento Fig. S1A), 4-fluorotalidomida (1) y ligando VHL (5) se prepararon como se informó previamente33. La 4-fluorotalidomida (1) se trató con cuatro enlazadores de aminas (2) con un grupo éster terc-butilo en presencia de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para formar un intermediario (3). Después de la desprotección del grupo terc-butilo en 3 por tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM), el ácido (4) se acopló con el ligando VHL (5 o 7) en presencia de 1 hex 1H-1,2,3-hexafluorofosfato de óxido de 3 triazolopiridinio (HATU) y DIPEA para producir los PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 y TD-487 (8).
CRBN es eficiente degradado por la BVS-CRBN heterodimerizing PROTACs. A) Diagrama esquemático del PROTAC que contiene pomalidomida y el ligando VHL (VH032). B) Estructura de los TD-158, TD-165, TD-343 y TD-487. C) Las células HEK293T se trataron con TD-158, TD-165, TD-343 o TD-487 (0,1, 1 y 10 µM) durante 24 h, y los niveles de proteína VHL se analizaron mediante inmunoblotaje. L. E. indica una larga exposición del Western blot. D) Gráfico DC50 de los compuestos TD-158 y TD-165 (TD – 165, DC50 = 20,4 nM; TD-158, DC50 = 44,5 nM). E) HA-CRBN y Flag-VHL se expresaron en células HEK293T. Después de 24 h, las células fueron tratadas con TD-158 (500 nM) durante 24 h. Los lisados de células enteras se analizaron mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. F) Las células HEK293T se trataron con TD-158 de 500 nM en diferentes momentos, y los niveles de CRBN se analizaron mediante inmunoblotaje. L. E. indica una larga exposición del Western blot.
Después del tratamiento con estos compuestos, examinamos los niveles de VHL y CRBN por análisis de Western blot. El tratamiento con TD-158, TD-165 o TD-343 causó una disminución dependiente de la concentración en el nivel de proteínas CRBN (Fig. 1C, panel superior). Sin embargo, los niveles de BVS en forma larga y BVS en forma corta aumentaron, presumiblemente debido a la estabilización por la interacción químico-proteína (Fig. 1C, paneles medio-alto y medio-bajo) 34. En el caso del tratamiento con 10 µM TD-158, se restauraron los niveles de CRBN; este efecto «gancho» es una característica típica que ocurre en el contexto de la degradación de proteínas inducida por PROTAC a altas dosis 9,35,36,37. Sin embargo, el TD-487, un estereoisómero del TD-165, no logró inducir la degradación de los NBN (Fig. 1C). El TD-343 poseía una actividad relativamente débil, lo que implica que la incorporación de oxígeno en el enlazador inhibe la actividad de PROTAC. Un análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) indicó que la disminución en el nivel de NCR inducida por PROTACs heterodimerizantes BVS-NCR no resultó de cambios en el ARNm (Suplemento Fig. S1B). Se midieron los valores de concentración de degradación del 50% (DC50) y degradación máxima (Dmax) para todos los compuestos sintetizados. Los valores de DC50 y Dmax calculados para TD-158 fueron de 44,5 nM y 97.1%, respectivamente, y los valores correspondientes para TD-165 fueron de 20,4 nM y 99,6% (Fig. 1D y Suplemento Fig. S1D). El degradador TD-156 que contiene un enlazador más corto (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) mostró una actividad más débil en comparación con el TD-165 (Fig. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), con oxígeno incorporado en el enlazador, condujo a una degradación ineficiente de CRBN. Para probar el efecto de la vinculación a la talidomida, examinamos la degradación de la NRC por PROTACs heterodimerizantes BVS-NRC con una vinculación diferente. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), con un enlace glicólico, y TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), con un enlace de amida, exhibieron una degradación reducida de CRBN, mientras que TD-759 (DC50 = 28,8 nM), con un enlace de glicina, mostró una potencia similar a la del TD-165. Para determinar si los niveles relativos de proteína podrían contribuir a esta degradación sesgada de la proteína, tratamos células que sobreexpresan VHL, CRBN o ambos con TD-158, y analizamos los niveles de CRBN y VHL. En todos los casos, los niveles de NBC se redujeron mientras que los niveles de BVS se mantuvieron similares o aumentaron (Fig. 1E). En experimentos a lo largo del tiempo, el TD-158 degradó el CRBN en más de un 80% en 3 h y lo degradó completamente después de 12 h (Fig. 1F). También se observó degradación de CRBN inducida por TD-158 en varias líneas celulares humanas (Fig. S2A-D).
Degradación de CRBN por PROTACs heterodimerizantes de VHL-CRBN depende de CRL2VHL
Para verificar que la degradación de CRBN por TD-158 dependía de UPS o de ubiquitinas ligasas DE ANILLO DE SACRIFICIO (CRL), probamos bortezomib, un inhibidor del proteasoma, y MLN4924, un inhibidor de la neddilación. El tratamiento conjunto con TD-158 y bortezomib o MLN4924 previno la degradación de los NCR (Fig. 2A y Suplemento Fig. S3A). Como era de esperar, la formación de cadenas de poli-ubiquitina aumentó notablemente en presencia de TD-158 (Fig. 2B). Además, el derribo del VHL por el ARN de interferencia pequeño (siRNA) atenuó la degradación del NCRB inducida por el TD-158 en células HEK293T (Fig. 2C). Por el contrario, la expresión de VHL en células 786-O, una línea celular de carcinoma renal con deficiencia de VHL, restauró la degradación de la NCR inducida por el TD-158 (Fig. 2D). En línea con estos resultados, el derribo mediado por siRNA de Cullin2, una proteína de andamiaje del complejo CRL2VHL, previno la degradación de CRBN inducida por TD-158 (Fig. 2E). Colectivamente, estos resultados indican que la degradación de la NBC por PROTACs heterodimerizantes de BVS-NBC depende del complejo CRL2VHL.
la Degradación de CRBN por BVS-CRBN heterodimerizing PROTACs depende de CRL2VHL. A) Las células HEK293T se trataron con TD-165 (1 µM) durante 12 h, seguido de la adición de bortezomib (20 nM) o DMSO durante 8 h. Los lisados de células enteras se sometieron a análisis inmunoblot para las proteínas indicadas. B) CRBN marcado con bandera (CRBN-Flag) y Ubiquitina marcado con HA (HA-Ub) se expresaron en células HEK293T. Después de 24 h, las células fueron tratadas con TD-158 (500 nM) y bortezomib (20 nM), o DMSO y bortezomib (20 nM), durante 12 h. Se analizaron lisados de células enteras y proteínas inmunoprecipitadas utilizando perlas magnéticas Flag M2 mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. C) Las células HEK293T se transfectaron con siRNA específico para VHL o siRNA revuelto (control). Después de 24 h, las células se trataron con TD-158 (500 nM) durante 24 h. Los lisados de células enteras se analizaron mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. (D) Las células 786-O y las células 786-O que expresan VHL (786-O + VHL) se trataron con TD-158 (500 nM) durante 24 h. Los lisados de células enteras se analizaron mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. E) Se trataron células HEK293T y células HEK293T de segunda mano con TD-165 (1 µM) o TD-487 (1 µM) durante 24 h y se analizaron lisados de células enteras mediante inmunoblotaje. F) El indicador CRBN se expresó en células HEK293T. Después de 36 h, las células se trataron con TD-158 (1 µM) y bortezomib (20 nM), o DMSO y bortezomib (20 nM), durante 12 h. Se analizaron lisados de células enteras y proteínas inmunoprecipitadas utilizando perlas magnéticas de Bandera M2 mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. G) Se mezclaron proteínas del complejo CRBN purificado y VHL/ELOB/ELOC y se aliquotaron en cuatro tubos. Las perlas de glutatión y TD-158 se agregaron según lo indicado y se incubaron durante 3 h. Después de la incubación, las perlas de glutatión se lavaron y analizaron mediante inmunoblot y tinción Azul de Coomassie.
La degradación eficiente por PROTACs requiere la formación de un complejo ternario con la proteína diana y la liga E39,38. Para probar esto, realizamos experimentos de co-inmunoprecipitación. Se encontró que la BVS endógena coinmunoprecipitada de NCR marcado con bandera expresada exógenamente en presencia de TD-158, pero no en su ausencia (Fig. 2F). Los experimentos de extracción de GST con proteínas purificadas mostraron que el CRBN interactuaba directamente con el complejo B/C de VHL-Elongina en presencia de TD-158 (Fig. 2G). Además, la adición de exceso de pomalidomida o ligando VHL inhibió la degradación del NCR inducida por el TD-158 (Suplemento Fig. S3B, C). CRBN Y384/W386A (AA) expresado exógenamente, un mutante defectuoso de unión a pomalidomida 16, no fue degradado por TD-158 (Suplemento Fig. S3D). Por lo tanto, estos datos sugieren que la formación de un complejo ternario entre CRBN, BVS y TD-158 es un prerrequisito para la degradación de CRBN.
Un análisis proteómico global revela que el TD-158 induce la degradación de CRBN
Para examinar la degradación de CRBN de manera imparcial, realizamos un análisis proteómico cuantitativo. Para minimizar los efectos secundarios de la degradación de CRBN, tratamos las células Jurkat, que expresaban sustratos CRBN e IMiD neo, con TD-158 o DMSO (control de vehículos) durante 12 h. Las proteínas de cada muestra se digirieron y los péptidos digeridos se etiquetaron para etiquetado isobárico acoplados a cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Este análisis identificó 7.148 proteínas que contenían más de tres péptidos únicos no redundantes (Tabla suplementaria S1). Solo tres proteínas-CRBN, CNIH1 y LMBRD2-cumplieron los criterios de un valor de P = 0,05 y un cambio de más de 1,5 veces. Entre ellas, la NRC fue la única proteína que cambió más de 2 veces (Fig. 3A). Sin embargo, los niveles de otros componentes de los complejos CRL4CRBN (CUL4A, CUL4B, DDB1 y RBX1) y los complejos CRL2VHL (elongina C , elongina B , CUL2 y RBX1) permanecieron sin cambios (Fig. 3B, C). Curiosamente, los niveles de neo-sustratos de IMiD notificados previamente, incluidos IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 y ZNF653, no se modificaron con el tratamiento con TD-158 (Fig. 3B) 39,40,41. Estos resultados se confirmaron mediante inmunobloqueo en Jurkat y varias líneas celulares de mieloma múltiple (Fig. 3D y Suplemento Fig. S2A-D).
proteómico Global de los cambios sobre el TD-158 tratamiento. A) Diagrama volcánico de proteínas identificadas mediante análisis proteómicos cuantitativos, comparando lisados de células Jurkat tratadas durante 12 h con 1 µM TD-158 o DMSO. Los datos representan tres réplicas biológicas. El eje x representa el cambio de pliegue en los niveles de proteínas en la escala logarítmica, y el eje y representa el valor P en la escala logarítmica. B) Abundancia relativa del complejo CRL4CRBN, el complejo CRL2VHL y el neosubstrato de CRBN (*P < 0,05, **P < 0,1). La línea roja indica una diferencia de 1,5 veces. (C) Las células Jurkat se trataron con TD-158 (1 µM) o DMSO durante 24 h. Los lisados de células enteras se analizaron mediante inmunoblotaje para proteínas complejas CRL4CRBN. D) Las células Jurkat se trataron con o sin DMSO, TD-158 (1 µM), pomalidomida (1 µM) o ligando VHL (1 µM) durante 24 h. Los lisados de células enteras se analizaron mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas.
La degradación de CRBN por PROTACs heterodimerizantes VHL-CRBN recapitula una deficiencia de CRBN
Un sustrato endógeno de CRL4CRBN es la glutamina sintetasa GLUL, que es una enzima clave en la biogénesis de la glutamina. La acetiltransferasa CBP / p300 acetila dos residuos de lisina N-terminal de GLUL en condiciones de altos niveles de glutamina, y el GLUL acetilado resultante es capturado y ubiquitinado por CRL4CRBN y posteriormente eliminado por proteosomas 22. Para examinar el efecto de TD-158 en los niveles de GLUL, privamos de glutamina a las células Hep3B durante 48 h y luego reabastecimos glutamina en presencia o ausencia de TD-158. TD-158 indujo degradación de los NCR independientemente del estado de glutamina, y los niveles de GLUL disminuyeron más lentamente con el tiempo en presencia de TD-158 que en su ausencia (Fig. 4A, B). Además, los ensayos de ubiquitinación in vivo mostraron que la ubiquitinación de GLUL disminuyó en presencia de TD-158 (Fig. 4C). También investigamos si el tratamiento con TD-165 confiere resistencia celular a la IMiD. Dos líneas celulares sensibles a IMiD, WSU-DLCL2 y RPMI8226, fueron pretratadas con TD-165 o DMSO durante 24 h y luego tratadas con pomalidomida, TD-165 o ambas durante 3 d. El pretratamiento con TD-165 redujo los efectos antiproliferativos de pomalidomida en ambas líneas celulares (Fig. 4D, E). Tomados en conjunto, estos datos indican que la degradación de la RBN por PROTACs heterodimerizantes de BVS-RBN recapitula una deficiencia de RBN.
CRBN por la degradación de la BVS-CRBN heterodimerizing PROTACs recapitula un CRBN deficiencia. A) Las células Hep3B carecían de glutamina y se trataban con TD-158 (500 nM) durante 48 h. A continuación, las células se trataban con glutamina (4 mm) en diferentes momentos. La degradación del GLUL se analizó mediante inmunoblot. B) Resultados cuantitativos de tres experimentos independientes. C) GLUL-Myc y V5-Ub se expresaron en células HEK293T. Después de 24 h, las células se trataron con TD-158 (500 nM) o DMSO durante 12 h y luego se trataron con bortezomib (100 nM) o DMSO durante 12 h. Se analizaron lisados de células enteras y proteínas inmunoprecipitadas utilizando perlas magnéticas Myc mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. (D,E) Las células WSU-DLCL2 (D) y RPMI8226 (E) se pretrataron con TD-165 (1 µM) o DMSO durante 24 h y, después de la cosecha, se dividieron en cuatro grupos. Cada grupo fue tratado con pomalidomida (1 µM) y DMSO, o pomalidomida (1 µM) y TD-165 (1 µM), durante 3 días. La viabilidad celular se midió utilizando CellTiter-Glo (**P < 0.001, *P < 0.01).
Para investigar los efectos in vivo de los PROTACs heterodimerizantes de BVS-NBN, intentamos determinar si el TD-165 puede inducir la degradación de la NBN en modelos animales. Aunque no se conservan residuos de aminoácidos en CRBN de ratón (mCRBN) importantes para la teratogenicidad, la mCRBN se degradó claramente, aunque en un grado ligeramente menor, por TD-165 en fibroblastos embrionarios de ratón (Fig.Suplementaria. S4A). Luego, administramos TD-165 intraperitonealmente a ratones para determinar si TD-165 induce la degradación de CRBN in vivo. Sin embargo, los niveles de CRBN no se alteraron en el bazo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o el hígado (Suplemento Fig. S4B). Dado que la farmacocinética de TD-165 es razonable (Tabla Suplementaria S2), esta ausencia de efecto podría atribuirse a la alta unión a proteínas plasmáticas (99,9%) de TD-165 (Tabla Suplementaria S3).
La N-truncada N-terminal no se degrada por PROTACs heterodimerizantes BVS–CRBN
Para determinar qué dominio de la NRBN es importante para la degradación de la NRBN mediada por TD–165, generamos una serie de mutantes de deleción de NRBN (D1-D4), como se muestra en la Fig. 5A. Las células que expresaban CRBN de longitud completa o mutantes de deleción individuales se trataron con DMSO o TD-165, y los lisados celulares se examinaron para determinar su degradación después del tratamiento con TD-165. Sorprendentemente, ninguno de los cuatro mutantes de deleción de CRBN fue degradado por TD-165, mientras que el CRBN de longitud completa fue degradado eficientemente (Fig. 5B). Notablemente, los niveles de BVS fueron ligeramente elevados presumiblemente debido a la estabilización de la interacción químico-proteica en presencia de TD-165, pero no alterados por la expresión de mutantes truncados de NCR en presencia de TD-165 (Fig. 5B). Una posible explicación para esto sería la incapacidad de los mutantes de deleción para formar un complejo ternario. Sin embargo, el mutante D1 sí formó un complejo ternario con TD-165 y VHL (Fig. 5C), y la ubiquitinación de D1 aumentó en presencia de TD-165 (Fig. 5D). Luego planteamos la hipótesis de que los residuos de lisina amino-terminal de CRBN son necesarios para la ubiquitinación. Para probar esta idea, sustituimos los tres residuos de lisina dentro del N-terminal de CRBN (a.a. 1-80) con arginina, individualmente y en combinación, y luego examinamos los lisados celulares para detectar la degradación de CRBN. El TD-158 degradó eficientemente a todos los mutantes en la misma medida que el CRBN de tipo salvaje (Fig. 5E), indicando que los tres residuos de lisina en el extremo N de la NRBN no son necesarios para la degradación inducida por PROTACs heterodimerizantes BVS-NRBN.
La región desordenada N-terminal de CRBN es necesaria para la degradación, pero no para la ubiquitinación, mediante PROTACs heterodimerizantes VHL-CRBN. A) Diagrama esquemático que ilustra los mutantes de truncamiento de la NRC. LON, dominio de proteasa Lon; TB, dominio de unión a talidomida. B) Los mutantes de deleción D1, D2, D3 o D4 de longitud completa marcados con Xpress se expresaron en células HEK293T. Después de 24 h, las células fueron tratadas con TD-165 (3 µM) o DMSO durante 24 h. Lisados celulares fueron analizados por inmunotransferencia para el indicado proteínas. C) Los plásmidos que codifican D1 marcado con Xpress y VHL marcado con His-PAS fueron transfectados a células HEK293T. Después de 48 h, las células se trataron con TD-165 (1 µM) o DMSO durante 24 h. Se analizaron lisados de células enteras y proteínas retiradas con gotas de estreptavidina mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. D) Los plásmidos que codifican mutantes CRBN, K39R, K42/43 R o K39/42/43 R marcados con Xpress se transfectaron a células HEK293T. Después de 24 h, las células fueron tratadas con TD-158 (2 µM) o DMSO durante 24 h. Lisados celulares fueron analizados por inmunotransferencia para el indicado proteínas.
La región desordenada de la proteína objetivo es necesaria para una degradación inducida por PROTAC eficiente
A continuación, buscamos determinar las diferencias estructurales entre el CRBN de longitud completa y el mutante de eliminación de CRBN D1. El término N de CRBN (a.a. 1-80) se predijo que contendría una región desplegada o intrínsecamente desordenada, basado en un análisis IUPred2A (Suplemento Fig. S5A). Esta región desordenada (a. a. 1-48) fue de hecho indiscernible en la estructura cristalina CRL4CRBN debido a su flexibilidad (entrada PDB; 6BN7). Se ha demostrado que la intrínsecamente desordenados región es uno de los principales componentes de la proteasomal degron y actúa como el iniciador de la proteasomal proteolysis25. Alternativamente, en el caso de proteínas globulares sin una región desordenada, el complejo de proteínas que contienen p97/valosina (p97/VCP) puede desplegar la estructura secundaria, facilitando la degradación proteasómica de las proteínas. Para examinar la relación entre la degradación de proteínas inducida por PROTAC y el complejo p97/VCP, probamos el efecto de N2,N4-dibencilquinazolina-2,4-diamina (DBeQ), un inhibidor de p97 / VCP, en la degradación de CRBN inducida por TD-165. Estos experimentos mostraron que la degradación de los NRBC no estaba influenciada por el tratamiento con DBeQ (Fig. 6A). Los niveles de transcripción 3 inducible al daño del ADN (DDIT-3; CHOP) y LC-3II lipidizado, utilizados como controles positivos, se elevaron con el tratamiento con DBeQ. La caída de p97 por el tratamiento con siRNA o DBeQ deterioró las vías de la ERAD y la autofagia, lo que llevó a la regulación ascendente de CHOP, un marcador bien establecido de la UPR, y a la acumulación de LC-3II, un marcador representativo de la autofagia, respectivamente (Fig. 6A) 42. Por lo tanto, para investigar si la región desordenada de CRBN facilita la degradación proteasómica inducida por PROTAC, unimos la región desordenada (a.a. 1-80) de CRBN a mutantes D2, D3 y D4 y examinamos las proteínas quiméricas para detectar la degradación. Todas las proteínas quiméricas, especialmente la quimera D4, fueron degradadas por TD-165 de manera dependiente de la concentración (Fig. 6B). Sin embargo, la introducción de una región desordenada de NBN en el terminal N o C de la BVS no indujo degradación de la proteína de fusión (Fig. 6C), lo que indica que la unión de la región desordenada no es suficiente para todas las proteínas objetivo. Para extender esta idea a la degradación inducida por otros PROTACs, probamos ARCC4, un PROTAC43 de receptor de andrógenos (AR) reportado previamente, porque AR también alberga una región desplegada en el extremo N (a.a. 1-330), según se determinó utilizando la herramienta de análisis IUPred2A (Fig. S5B). Tras el tratamiento con ARCC4, la RA sin la región desordenada N-terminal (ΔN330) se degradó de manera menos eficiente que la RA de longitud completa. Curiosamente, la unión de la región desordenada CRBN (a.a. 1-80) a AR ΔN330 aumentó la eficiencia de degradación (Fig. 6D y Suplemento Fig. S5C). De acuerdo con esto, la unión de la región desordenada de AR (a.a. 1-170) al mutante CRBN D1 también promovió la proteólisis por TD-165 (Fig. 6E y Suplemento Fig. S5D).
La región desordenada de la proteína objetivo es necesaria para una degradación eficiente por PROTACs. A) Las células HEK293T se trataron con TD-165 (1 µM), el inhibidor p97/VCP DBeQ (10 µM), o ambos durante 6 h. Los lisados de células enteras se analizaron mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. (B) Se insertó CRBN N-terminal (a.a. 1-80) en el terminal N o C del plásmido VHL marcado con His – PAS, y los plásmidos se expresaron en células HEK293T. Después de 8 h, se recolectaron las células y se dividieron en cuatro grupos. A continuación, se trató a cada grupo con concentraciones crecientes de TD-165 durante 48 h. Se analizaron lisados de células enteras mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. C) Los plásmidos que expresan el N-terminal de CRBN (a.a. 1-80) fusionados a D2, D3 o D4 se transfectaron a células HEK293T. Después de 8 h, se recolectaron las células y se dividieron en cuatro grupos. A continuación, se trató a cada grupo con concentraciones crecientes de TD-165 durante 48 h. Se analizaron lisados de células enteras mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. D) Los plásmidos que expresaban AR de longitud completa, AR eliminada N-terminal (ΔN330), o el N-terminal de CRBN (a.a. 1-80) fusionado a ΔN330 (CRBN (a.a. 1-80) +ΔN330) se transfectaron a células HEK293T. Después de 8 h, se recolectaron las células y se dividieron en cuatro grupos. A continuación, se trató a cada grupo con concentraciones crecientes de ARCC4 durante 24 h. Se analizaron lisados de células enteras mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas. E) Los plásmidos que expresaban CRBN de longitud completa, mutante de deleción D1 o N-terminal de AR (a.a. 1-170) fusionados a D1 (AR (1-170) +D1) se transfectaron a células HEK293T. Después de 8 h, se recolectaron las células y se dividieron en cuatro grupos. A continuación, se trató a cada grupo con concentraciones crecientes de TD-165 durante 48 h. Se analizaron lisados de células enteras mediante inmunoblotaje para las proteínas indicadas.
Para reforzar aún más estos hallazgos, seleccionamos PROTACs con alta potencia (DC50 < 1 µM) en base a una búsqueda de literatura, y luego los analizamos para una región intrínsecamente desordenada utilizando la herramienta IUPred2A. Curiosamente, se encontró que dos tercios de las proteínas dirigidas a PROTAC seleccionadas poseen una región desordenada de más de 40 aminoácidos, ya sea en uno de sus terminales o internamente (Tabla 1)44, aunque la predicción basada en la secuencia de aminoácidos de regiones desordenadas o no estructuradas no toma en consideración otros factores, como la interacción proteína-proteína o las modificaciones postraduccionales 44, 45,46. De acuerdo con esto, se ha demostrado que la BVS-Homo-PROTAC induce la degradación de la forma larga de la BVS, que alberga una región desordenada en su terminal N, pero no la forma corta de la BVS47. Por lo tanto, esto apoya nuestra idea de que la región desordenada de las proteínas objetivo es necesaria para la degradación eficiente de los PROTACs.
