Preparación de componentes proteicos para la reconstitución

Se prepararon los componentes del aparato de traducción de E. coli, incluidos los factores de traducción y los ARA, tal como se describieron previamente46. También se preparó la preparación de componentes de RNaseP, ARN M1 y proteína C5 como se describió previamente29. Modificamos el protocolo para la proteína C5 precipitándola con sulfato de amonio saturado al 80% y disolviéndola mediante dialización contra tampón A (acetato de sodio de 50 mM pH 6,5, EDTA de 5 mM, NaCl de 0,25 M y 2-mercaptoetanol de 7 mm). El precipitado resultante se recuperó por centrifugación y se disolvió mediante dialización contra tampón B compuesto de 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M de urea y 10 mM ditiotreitol (TDT). Las proteínas disueltas se aplicaron en una columna HiTrap SP HP de 5 ml (#17115101, GE Healthcare, EE.UU.), se lavaron con tampón B que contenía 7 mm 2-mercaptoetanol como sustituto de la TDT de 10 mM y se elutaron con un gradiente lineal de 100 mM a 2 M NH4Cl en tampón B. Las fracciones que contenían proteína C5 se analizaron mediante SDS-PAGE, se recuperaron, se dializaron contra tampón D (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 M NH4Cl, 10 mm MgCl2, urea de 2 M, 2-mercaptoetanol de 7 mm), luego dializado contra tampón D sin urea. Las soluciones resultantes se concentraron utilizando un Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, EE.UU.) y se dializaron contra tampón D sin urea que contuviera un 50% de glicerol. La proteína C5 purificada se almacenó a -30 °C. Notamos que podemos compartir todos los plásmidos a pedido.

Preparación de enzimas de modificación para ARN IVT

Las enzimas de modificación para ARN IVT se prepararon de la siguiente manera. Los genes de E. coli de TSAb, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE y GidA se amplificaron a partir del genoma de E. coli A19 utilizando cebadores apropiados (Datos suplementarios 5). Los genes amplificados para TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE y GidA se clonaron en pET15b (#69661, Merck Millipore, EE.UU.) como pequeñas proteínas de fusión de proteínas modificadoras similares a la ubiquitina (SUMO) donde las enzimas de modificación His-tag, SUMO y modificación estaban dispuestas en tándem. Los genes para TSAb y TrmD se clonaron en pET15b como proteína de fusión His-tag. Todos los genes fueron clonados con la técnica de ensamblaje Gibson (#E2611, New England Biolabs, EE.UU.). Los plásmidos resultantes se transformaron en una cepa de E. coli BL21(DE3) y se cultivaron en medio de 1 LB a un OD660 de 0,6–1,0 a 37 °C. La sobreexpresión fue inducida por la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM para TSAb, TsaC, TsaD, TsaE y TrmD, o 0,1 mM para GlyA, MnmC, MnmE y GidA. Después de 3 h de cultivo a 37°C, se cosecharon las células. Las células sobreexpresadas de TSAb, TsaC, TsaE, TrmD y MnmE se resuspendieron en 40 ml de tampón de lisis (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 y 7 mM 2-mercaptoetanol) y se interrumpieron por sonicación. El lisado resultante se centrifugó y el sobrenadante se recuperó y se mezcló con 5 ml de Resina purificadora His-tag completa (#05893801001, Roche, Suiza) durante 1 h con rotador. La resina se lavó con 100 ml de tampón de Lisis y luego la proteína se elutó con 25 ml de tampón de Elución (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol y 7 mM 2-mercaptoetanol). TSAb y TrmD se concentraron con Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, EE.UU.) y luego se dializaron contra tampón de stock (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mm KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-mercaptoetanol y 30% de glicerol). Se congelaron rápidamente con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C. Para TsaC, TsaE y MnmE, se añadió Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, EE.UU.) a las fracciones recuperadas a una concentración final de 23 µg/ml para eliminar la proteína SUMO marcada con His. Las fracciones se dializaron contra tampón de Escisión (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl y 7 mM 2-mercaptoetanol) durante la noche, mientras que el tampón de escisión contenía 500 mM KCl para la preparación de MnmE. Las muestras dializadas se volvieron a mezclar con 5 ml de Resina purificadora completa His-tag con rotador. Luego se recolectaron las fracciones de flujo que contienen enzimas de modificación. Las muestras recuperadas se concentraron con Amicon Ultra 3 kDa para TsaE o Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, EE. UU.) para TsaC y MnmE. Se dializaron contra tampón de reserva, se congelaron con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C. Para la preparación de GlyA, todos los tampones contenían 10% de glicerol y los otros procedimientos eran los mismos que la preparación de MnmE. Se encontró que el TsaD era insoluble después de la sonicación. Por lo tanto, la proteína se peletizó por centrifugación a 20.400 × g a 4 °C durante 45 min y se resuspendió en tampón de lisis suplementado con Tritón X-100 al 4%. La suspensión fue de nuevo peletizado por centrifugación a 20,400 × g durante 45 min. El pellet se disolvió con tampón de lisis suplementado con 6 M de urea. El otro procedimiento fue el mismo que la preparación MnmE, excepto que todos los tampones contenían 2 M de urea. Para la preparación de MnmC, todos los pasos hasta la eliminación de la proteína SUMO marcada con His fueron los mismos que la preparación de GlyA. Debido a que el MnmC no está específicamente unido a la resina de purificación His-tag, se seleccionó la purificación con cromatografía de intercambio de aniones. La solución después del tratamiento con Ulp1 se dializó contra tampón IEX (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 y 7 mM 2-mercaptoetanol) y luego se aplicó en una columna HiTrap Q HP de 5 mL (#17115401, GE Healthcare, EE.UU.). La columna se lavó con 25 ml de tampón IEX y luego se elutó MnmC con un gradiente de revestimiento de 100 mM a 1 M KCl en tampón IEX. Las fracciones que contenían MnmC se concentraron con Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, EE.UU.), se dializaron contra tampón de stock, se congelaron con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Observamos que podemos compartir todos los plásmidos a pedido.

Se clonó la preparación de genes de aRNiVET

para cada aRNiVET (Datos suplementarios 1) en el vector pGEMEX-1 (#P2211, Promega, EE.UU.) entre los sitios de restricción XbaI y BamHI. Utilizando los plásmidos resultantes como plantillas, las plantillas de ADN para la transcripción in vitro se amplificaron por PCR utilizando una imprimación promotora T7 como imprimación delantera y imprimaciones inversas apropiadas para cada ADNVI (Datos suplementarios 1). Cada imprimación inversa contenía una modificación de 2 ‘- metoxi en el segundo nucleótido del terminal 5’para evitar la adición independiente de un nucleótido extra28. Los productos se purificaron por extracción de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), seguido de precipitación de etanol, y los precipitantes se disolvieron en agua. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Los componentes de la RNasa P compuestos de proteína C5 y ARN M1 se añadieron posteriormente a las mezclas de reacción a 150 nM para eliminar los 27 nucleótidos adicionales, y las reacciones se incubaron durante 1 h a 37 °C. Los ARNV transcritos se procesaron con extracción de fenol ácido, seguida de extracción de cloroformo/alcohol isoamílico (10:1), y luego se purificaron mediante cromatografía de intercambio de aniones. Las muestras que contenían ARN IVT se cargaron en columnas HiTrap Q HP de 10 ml (#17115401, GE Healthcare, EE. UU.) y se lavaron con tampón Q (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 y 200 mM KCl). Los ARN IVT se elutaron con un gradiente lineal de 200 mM a 1 M KCl en el tampón Q. Las fracciones que contenían ARNVT objetivo, determinadas por urea-PAGE, se recuperaron por precipitación de isopropanol, y los ARNVT precipitados se disolvieron en agua y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Notamos que podemos compartir todos los plásmidos a pedido.

Modificación del ADNVI

La modificación de t6A37 se realizó en la mezcla de reacción que contenía Hepes-KOH de 50 mm, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.Piridoxal-5 ‘ – fosfato de 2 mM, Ser de 1 mM, Gly de 1 mM, SAM de 36,4 µM, inhibidor de la RNasa recombinante de 0,1 unidades/µL (#2313 A, TaKaRa, Japón), GlyA de 10 µM, GidA de 3 µM, MnmE de 3 µM, MnmC de 2,5 µM, 6 A260 unidades/ml de tRNAGluUUC o tRNAGluCUC. Después de la incubación a 37°C durante 2 h para la modificación de t6A37 y m1G37 o 4 h para la modificación de mnm5U34, los ARNT se procesaron con extracción de fenol ácido seguida de extracción de cloroformo/alcohol isoamílico (10:1) y se recuperaron mediante precipitación de isopropanol. Los ARNt precipitados se disolvieron en agua y se almacenaron a -80 °C. Para la modificación de mnm5U34, la reacción se realizó de nuevo con ARNt recuperados. Se procesaron con extracción de fenol ácido, seguida de extracción de cloroformo/alcohol isoamílico (10:1), desaladas por columnas MicroSpin G-25 (#27532501, GE Healthcare, EE.UU.) y recuperadas por precipitación de isopropanol. Los ARNt precipitados se disolvieron en agua y se almacenaron a -80 °C. Para cuantificar la eficiencia de modificación, se utilizó 57,1 µM de Thr en lugar de 1 mm de Thr y la mezcla sin TsaD se utilizó como control para la modificación de t6A37. 36.Se utilizó adenosil-Metionina de 4 µM S was y se utilizó la mezcla sin TrmD como control para la modificación de m1G y sin GidA como control para la modificación de mnm5U34. Después de la incubación a 37 °C, se retiraron alícuotas (10 µL) y se detectaron en discos filtrantes Whatman de 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, EE.UU.). Los discos de filtro se lavaron dos veces con un 10% de TCA, luego etanol, seguido de la medición de la radiactividad mediante un contador de centelleo líquido. Para la cuantificación de la modificación de mnm5U, los ARNt se purificaron como se indicó anteriormente y, en su lugar, se detectó una unidad de 0,02 A260 en los discos de filtro.

Aminoacilación

Se realizaron experimentos de aminoacilación de acuerdo con un informe anterior47. Las mezclas de reacción (10 µL) contenían 100 mM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM TDT, 4 mM ATP, 1 unidad/µL de inhibidor de la RNasa recombinante (#2313 A, TaKaRa, Japón), 50 nM o 1,5 µM AAR correspondientes a cada aminoácido, 20 µM-aminoácido o 68 µM Asn para la aminoacilación de asparagina y 2 A260 unidades/ml de ARNt. Para medir la metilación, se utilizó una mezcla de Met de 0,6 µM y L-metionina fría de 3,4 µM. El Cys se obtuvo mediante cistina reductora con TDT de 50 mM a 37 °C durante 15 min. Para medir la cisteinilación, la concentración de TDT fue de 5 mm. Cuando se utilizaron mezclas nativas de ARNt, se agregaron 40 mezclas de ARNt A260 unidad/ml (#10109541001, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Después de la incubación a 37°C durante 30 min, se retiraron alícuotas (8 µL) y se detectaron en discos filtrantes Whatman de 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, EE.UU.). Los discos de filtro se lavaron dos veces con 10% de TCA, luego con etanol, seguido de la medición de la radiactividad mediante un contador de centelleo líquido.

Síntesis de octapéptidos con el sistema PURO

Las plantillas de ADN que codifican octapéptidos se amplificaron por PCR con cebadores apropiados (Datos suplementarios 2) utilizando el vector pURE1 (#PUREV001, BioComber, Japón) que contenía una secuencia promotora T7 y el sitio de unión del ribosoma (secuencia Shine-Dalgarno) como plantilla. Las plantillas de ADN amplificado se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick (#28104, QIAGEN, Alemania). Las reacciones de síntesis de octapéptidos contenían 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, glutamato de potasio de 100 mM, acetato de magnesio de 13 mM, espermidina de 2 mM, TDT de 1 mM, ATP de 2 mM, GTP de 2 mM, UTP de 1 mM, CTP de 1 mM, fosfato de creatina de 20 mM, ácido 10-formil-5,6,7,8-tetrahidrofólico de 10 µg/mL, ribosoma de 0,2 µM, plantilla de ADN de 4 nM, componentes proteicos puros del sistema, incluidos factores de traducción y enzimas, aminoácidos y ARNt. Las concentraciones de componentes puros proteicos del sistema fueron las descritas en un protocolo anterior46. Observamos que los 20 aaRSs se incluyeron en este experimento, independientemente de las plantillas de ADN y los codones de prueba. La composición y la concentración de aminoácidos, que dependen de los codones de prueba, se enumeran en los Datos complementarios 2. La composición de los ARNT IV depende de la plantilla, y las reacciones se realizaron utilizando ARNt IV basales (Datos Suplementarios 2) en presencia o ausencia de ARNt IV de prueba (Datos Suplementarios 2). La concentración de cada aDNtRVI se fijó en 6 µM. Cuando se utilizaron mezclas nativas de ARNt, se agregaron 56 mezclas de ARNt A260 unidades / ml (#10109541001, Sigma-Aldrich, EE. Las reacciones se realizaron durante 60 min a 37 °C y se retiraron las alícuotas, manchadas en papeles de filtro Whatman de 3 MM (#1822-025, GE Healthcare, EE.UU.), hervidas en ATC al 10% a 90 °C durante 30 min para desacilarar ARN aminoacil. La radiactividad en la fracción insoluble al 10% de TCA se midió con un contador de centelleo líquido.

Síntesis de proteínas con el sistema PURE

Se realizaron experimentos de síntesis de proteínas con un kit PUREfrex 2.0 (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japón) sin mezclas de ARNt en Solución I (Mezcla tampón). Añadimos, además, 0.Plantilla de ADN amplificada por PCR de 2 µM Met, 4 nM para expresión de DHFR o sfGFP (Datos suplementarios 3), y una cantidad especificada de mezcla de ARNt IV o mezcla de ARNt nativa. Las reacciones se realizaron a 30 o 37 °C durante 12 h y se analizaron las proteínas sintetizadas.

El análisis de proteínas sintetizadas

DHFR sintetizado y sfGFP conteniendo Met radiactivo se analizó con un 15% de SDS-PAGE, y la imagen en gel se visualizó utilizando un analizador de imágenes biológicas BAS-5000 (GE Healthcare, EE.UU.). El análisis de curso de tiempo de la expresión de sfGFP se realizó midiendo la fluorescencia de sfGFP cada 3 minutos utilizando un sistema de QRT-PCR StepOne (#4376373, Applied Biosystems, EE.UU.). Se obtuvieron imágenes de fluorescencia de sfGFP sintetizado en mezclas de reacción utilizando un instrumento LAS-4000 (GE Healthcare, EE.UU.). La actividad de la DHFR sintetizada se midió como se describió previamente44. Las mezclas de reacción (2 ml) contenían 50 mm de MES-KOH pH 7,0, 25 mM de TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM de etanolamina, 100 mM de NaCl, 10 mM de 2-mercaptoetanol, 0.EDTA de 1 mM, ácido dihidrofólico de 100 µM y una alícuota de 10 µL de la mezcla de reacción PURA, y se incubaron a 37°C durante 15 min. A continuación, se añadieron 20 mm NADPH a una concentración final de 200 µM, y la disminución de la absorbancia a 340 nm se midió durante un período de 10 minutos con un espectrofotómetro V-550 (Jasco, Japón). Se definió una unidad de DHFR como la cantidad de enzima requerida para procesar 1 µmol de ácido dihidrofólico en 1 min a 37 °C.

El análisis LC-MS de proteínas sintetizadas

DHFR con secuencia de BANDERA en su extremo (Datos suplementarios 3) se sintetizó con un PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japón) sin mezclas de ARNt en Solución I (Mezcla tampón). Además, agregamos una plantilla de ADN amplificado por PCR de 4 nM para DHFR etiquetada con secuencia de BANDERA en su terminal C (Datos suplementarios 3) y una cantidad especificada de mezcla de ARNt IV o mezcla de ARNt nativa. Las reacciones se realizaron a 30 °C durante 12 h. El DHFR sintetizado se purificó con Perlas magnéticas Anti-FLAG M2 (#M8823, Sigma-Aldrich, EE.UU.). Se mezclaron alícuotas (55 µL) de las mezclas de reacción con 245 µL del tampón de lavado de BANDERA (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mm NaCl, 20 mM Mg(ACo)2), y mezclado con perlas de 30 µL durante 1 h. Las perlas se lavaron con 210 µL del tampón de lavado de la BANDERA, seguido de un lavado con el tampón sin Mg(ACo)2 dos veces (210 µL y 180 µL). Luego, el DHFR se elutó con 50 µL de tampón de lavado de BANDERA sin Mg (ACo)2, pero se complementó con 100 µg/ml de péptido 3xFLAG (#F4799, Sigma-aldrich, EE. UU.) después de mezclar suavemente durante 1 h. La preparación de las muestras para el análisis de LC-MS se realizó de acuerdo con un protocolo asistido por surfactante de transferencia de fase (PTS) 48. Se añadieron 4 µL de un tampón denso de PTS (desoxicolato de sodio de 100 mM, N-lauroilsarcosinato de sodio de 100 mM y NH4HCO3 de 500 mm) a 40 µl de las muestras eluidas. Se redujeron con TCEP de 10 mM a 37 °C durante 30 min, se alquilaron con yodoacetamida de 20 mM a 37 °C durante 30 min y se apagaron con Cys de 20 mm. Cada solución de reacción se dividió en dos porciones. Una fue digerida con 10 ng/µl de Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) y 10 ng/µl de tripsina (#90057, Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) a 37 °C durante la noche. El otro fue digerido con 10 ng/µl de Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) a 37 °C durante la noche. Después de la digestión, se añadió ácido trifluoroacético (AGT) al 10% a una concentración final del 1%, y las soluciones de reacción se centrifugaron a 15.000 × g durante 5 minutos para precipitar los detergentes. Los sobrenadantes fueron desalada mediante la auto-preparados etapa tips49 y se seca con SpeedVac. El análisis LC-MS se realizó utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) equipado con una fuente de iones nanospray (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y un sistema nano-LC (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las mezclas de péptidos secos se disolvieron en una solución que contenía un 5% de acetonitrilo y un 0,1% de AGT, y cada muestra se aplicó al sistema nano-LC. Los péptidos se concentraron utilizando una columna trampa (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y, a continuación, separado mediante una columna nanocapilar (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japón) utilizando dos fases móviles A (ácido fórmico al 0,1%) y B (acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1%) con un gradiente (5% B durante 5 min, 5-45% B en 45 min, 45-90% B en 1 min y 90% B en 4 min) a un caudal de 500 nL/min. La elución se electrobrayó directamente (2,2 kV) en el MS (modo positivo, rango de escaneo de 200-1500 m/z, resolución de 60.000 FWHM)50.