Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC), que representa el subtipo histológico principal de cánceres primarios de hígado, es el quinto cáncer más frecuente en todo el mundo y la tercera causa de mortalidad por cáncer (1,2). Las tasas más elevadas de cáncer de hígado se encuentran en los países en desarrollo, especialmente en Asia Oriental y Sudoriental y África Central y Occidental,mientras que las tasas son bajas en Asia centromeridional, Occidental y Europa Septentrional y Oriental (3). La alteración genética y los factores epigenéticos de alto riesgo,como la infección crónica por VHB o VHC, la cirrosis hepática, la enfermedad hepática alcohólica y las aflatoxinas, explican la alta morbilidad del CHC (4-6).Sin embargo, el mecanismo molecular acompañado por laregenogénesis y progresión patocarcinogénica aún no está muy claro.Por lo tanto, es fundamental para nosotros aclarar la etiología e investigar la alteración molecular vital subyacente al inicio y progresión del carcinoma hepatocelular y, en última instancia, mejorar nuestros conceptos actuales para el diagnóstico, la detección y el tratamiento de esta enfermedad.

Durante el proceso de hepatocarcinogénesis, la gestación de puntos de control del ciclo celular es un sello importante que puede promover la formación de cáncer (2).Como uno de los reguladores del punto de control del ciclo celular, el ciclo de división celular 20 (CDC20) parece actuar como una proteína reguladora que interactúa con el complejo/ciclosoma promotor de anafase (APC/C)en el ciclo celular, que se requiere para el inicio de anafase y la salida de la mitosis tardía (7,8). Dos factores reguladores, CDC20 y CDH1 se unen directamente al APC y activan su actividad de ubiquitinación de ciclinas durante la mitosis y la fase G1 (9,10).Se ha reportado que la proteína 80 asociada al receptor(RAP80), que recluta BRCA1 a sitios de daño al ADN en la vía de señalización ubicua inducida por daño al ADN, puede degradarse por el complejo promotor de anafase (APC/C-Cdc20) o (APC/C-Cdh1) a través de la poliubiquitinación durante la mitosis a la fase G1 (11). El agotamiento de RAP80 mostró un control efectivo del punto de control de la fase G2-M y promovió la progresión del ciclo de células mitóticas.

La expresión de CDC20 puede ser notablemente suprimida por la proteína p53 que inhibe la transformación maligna a través de la regulación del ciclo celular, la senescencia celular y los genes relacionados con la apoptosis(12). Se ha informado de una alta expresión de CDC20 en varios tumores malignos, incluidos el adenocarcinoma pancreático ductal (13), el carcinoma de células escamosas orales, el cáncer gástrico (14), el cáncer de cuello uterino (15) y varias células cancerosas (14,16).Sin embargo, el patrón de expresión de CDC20 y su significación clínica en el carcinoma hepatocelular humano no se han aclarado.

En este estudio, mediante el análisis del conjunto de datos de microarrays (número de acceso. GSE14520) de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), encontramos que CDC20 era el nodo principal en las redes de interacción molecular HCC. Analizamos el nivel de expresión de CDC20 en tejidos no tumorales y de CHC primario y contiguos, y evaluamos su significación clinicopatológica en 132 muestras de CHC archivadas. También se investigó el efecto de la caída de CDC20 por siRNA en el crecimiento y el ciclo celular de las células cancerosas de hígado. Nuestros hallazgos sugieren que el CDC20 puede desempeñar un papel significativo en el desarrollo del CHC.

Materiales y métodos

Análisis bioinformático

El conjunto de datos de microarrays GSE14520 (17) se descargó de GEO. En este estudio se utilizaron un total de 183 CHC y 179 tejidos para carcinoma correspondientes que se analizaron con los GeneChips Affymetrix U133A de pacientes chinos de la cohorte 2. Los datos de perfiles de expresión génica se re-resumieron utilizando el método RMA (18) y archivos CDF centrados en genes de Entrez(19) (en lugar de archivos CDF originales de Affymetrix), que filtraron sondas inespecíficas en los chips de genes y fusionaron múltiples conjuntos de sondas que representaban el mismo gen Pérez en un conjunto de sondas. Se realizó un análisis de significación del microarray(SAM) (20) para identificar genes de expresión diferente entre el CHC y los tejidos paracarcinoma correspondientes. Delta se estableció en 2,25, y el umbral ofFDR se estableció en 0,001. Se estudiaron genes sobreexpresados en el CHC que se expresaban en más de 50 tejidos del CHC pero menos de 10 tejidos para carcinoma correspondientes. Los genes se analizaron posteriormente con el software GenCLiP (21) (http://ci.smu.edu.cn) para anotar funciones génicas y construir redes de interacción molecular.

Declaración de ética

Las muestras clínicas se utilizaron únicamente para fines de investigación. Se obtuvo la aprobación del comité de ética del Hospital General ChinesePLA (LREC 2012/40). Todas las muestras se recogieron bajo la condición de un consentimiento informado previo por escrito de los pacientes.

Los pacientes y las muestras de tejido

Dieciséis pares de CHC fresco y tejidos adyacentes no tumorales utilizados para PCR en tiempo real y análisis de western blot se recolectaron durante la cirugía en el Hospital General de PLA de China(Beijing, China) de noviembre de 2012 a febrero de 2013. Los tejidos se congelaron a presión en nitrógeno líquido hasta su uso. El CHC archivado con parafina y los tejidos no tumorales adyacentes utilizados para inmunohistoquímica (IHC) se obtuvieron de 132 pacientes con CHC que se sometieron a una resección hepática parcial en el mismo hospital entre enero de 2006 y diciembre de 2007. La mediana de edad de los pacientes era de 52 años (intervalo de 24 a 80 años).

Cultivo celular

Se compraron una línea celular normal de hígado (LO2) y tres líneas celulares de HCC (HepG2, SMMC7721, Huh7) de la Colección de Tipicultura Estadounidense (ATCC, Manassas, VA) o del Banco de Células de Ciencia de la Academia China y se mantuvieron en el Instituto de Biotecnología, Academia de Ciencias Médicas Militares. Todas las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen,CA) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS, Gibco, Carlsbad,CA) y L-glutamina de 2 mM, penicilina de 100 U/ml, estreptomicina de 100 µg/ml a 37°C con 5% de CO2.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y análisis de PCR en tiempo real

El ARN total se extrajo de líneas celulares y muestras de tejidos utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se invirtió un total de 2 µg de ARN utilizando el Transcript y el Kit de síntesis de ADNc Detransgen Biotech (Beijing, China). Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. Los datos de expresión se normalizaron a la media geométrica del gen de limpieza β-actina y se calcularon con ΔΔCt (22) y los resultados se expresaron con 2 ΔΔCt.

Análisis de Western blot

El análisis de Western blot se realizó bajo el protocolo estándar. La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (10%) se utilizó para separar la proteína, que luego se electrotransfería del gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después del bloqueo con 5% de leche descremada seca durante 1 h, la membrana se sumergió con anticuerpo policlonal CDC20 antihumano de conejo(1:1,000, Tecnología Bioworld, St. Louis Park, Minnesota) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizó como control interno el anticuerpo monoclonal de α-tubulina antihumana de ratón(1:5.000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Después de lavarse con solución salina tamponada con Tris entre 20 (TBST) tres veces, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante contra el conejo o el ratón (dilución 1:5.000). La detección de quimioluminiscencia se realizó con el Substratekit Inmobilon Western Chemiluminescent HRP (Millipore Corporation, Billerica, MA).

Inmunohistoquímica (IHC) y puntuación

La inmunohistoquímica para la expresión de CDC20 en CHC y muestras adyacentes no tumorales se realizó utilizando métodos estándar.Brevemente, las secciones de tejido se incubaron con anti-cdc20dilutado 1:200 de conejo (Tecnología Bioworld) durante la noche a 4°C. Se utilizó como control negativo la seroalbúmina bovina (1%; ASC) sin anticuerpo primario. El anticuerpo IgG de poli-rábano picante secundario (HRP)anti-conejo (ZSGB-Bio, Beijing, China) se incubó a temperatura ambiente durante 20 min.

Todas las secciones inmunotenadas fueron revisadas y evaluadas de forma independiente por dos patólogos en un manner ciego sin conocimiento de la información clínica patológica, basado en el método H-score, que considera la intensidad de la tinción junto con el porcentaje de células que tintan positivamente (23,24).Para el método de puntuación H, se eligieron 10 campos aleatoriamente a magnificación ×400. La intensidad de tinción en las células se clasificó como 0,1, 2 y 3, correspondientes a la tinción negativa, débil, intermedia y fuerte, respectivamente. En cada campo se contabilizó el número total de células y células teñidas en cada intensidad. El marcador H se calculó siguiendo la fórmula: (% de células teñidas en la categoría de intensidad 1×1) + (% de células teñidas en la categoría de intensidad 2×2) + (% de células teñidas en la categoría de intensidad 3×3). Las puntuaciones H variaron de 0 a 300, donde 300 representaban el 100% de las células de cadena fuerte (3+) (24). La expresión alta de CDC20 se definió como puntajes H de tinción de células ≥200.

La supresión de CDC20 por un pequeño ARNr interferente (siRNA)

El ARN interferente pequeño (siRNA) de doble cadena se sintetizó y purificó por GenePharma (Shanghai, China). Las consecuencias correspondientes a la región de codificación del CDC20 humano eran: sentido, 5′-GGAGCUCAUCUCAGGCCA UUU-3′; antisentido,5′-AUGGCCUGAGAUGAGCUCCU-3′. Se utilizó un ARNip codificado sin objetivos para el control negativo. Estos ARNip fueron disueltos en agua de pirocarbonato de indietilo (DEPC) para alcanzar una concentración de 20 µm. Las células HepG2 del cáncer de hígado se trataron con siRNA de control ornegativo CDC20 en 20 nM utilizando el reactivo de transfección de siRNA INTERFERin invitro (Polyplus Transfection, NewYork, NY).

Se utilizaron análisis cuantitativos de PCR en tiempo real y western blot para detectar el efecto de interferencia del siCDC20. Los grupos de control fueron las células que no fueron tratadas o tratadas con siRNAoligonucleótidos de control negativo.

Ensayo de proliferación celular

Se inyectaron dos matraces de plástico de 25 cm2 con 2×105 células de cáncer de hígado (HepG2), que luego se transfectaron con 20 nM siRNA de control negativo y CDC20siRNA, respectivamente, para incubación de 48 horas. Luego, las células se digirieron y sembraron en placas de 6 pocillos que contenían 2 ml de medio por pocillo.Posteriormente, las células de un pozo fueron digeridas y contadas por el contador de células automático (Invitrogen) cada 24 h hasta el quinto día.

Prueba de clasificación celular activada por fluorescencia(FACS) del ciclo celular

siRNA para CDC20 y siRNAoligonucleótidos de control negativo se transfectaron a células HepG2 con el reactivo de transfección de siRNA in vitro de lainterferina durante 48 h. Después del tratamiento con 2 µg/ml de timidina (Sigma-Aldrich, St. Louis,MO) durante 24 h, las células se recolectaron en 0, 3, 6, 9, 12-h después de retirar la timidina del medio y fijarla con alcohol al 70%.Antes de los análisis, las células se lavaron con PBS, se trataron con 1 mg/mlRNasa A a 37°C durante 30 min y luego se teñieron con yoduro de propidio(IP). Los análisis fueron realizados por BD FACSCalibur (Becton-Dickinson,Franklin Lakes, NJ) y los resultados fueron analizados por el software WinMDI Versión 2.9.

Análisis estadísticos

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software estadístico IBMSPSS 20.0. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar la expresión de CDC20 mrnanormalizado con β-actina en líneas celulares. También se utilizó el mismo método para comparar la diferenciación histológica en muestras de tumores normalizadas con muestras normales de hígado. Las comparaciones de datos en dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Student. El test de la χ2 se utilizó para analizar la relación entre la expresión de CDC20 y las características clínicas patológicas. Las correlaciones bivariadas entre variables se calcularon mediante los coeficientes de correlación de Spearman.El nivel de significación estadística se estableció en P<0,05 para alltests.Resultados

Resultados

El CDC20 es el nodo principal en las redes de interacción molecular del CHC

El análisis SAM identificó 4358 genes sobreexpresados en el ccNAH, en los que se expresaron 137 genes en más de 50 tejidos del CHC,pero en menos de 10 tejidos para carcinoma. El análisis de GenCLiP mostró que de los 137 genes, 72 estaban relacionados con el ciclo celular(P=1,238 e-15, por prueba de χ2), 19 genes estaban relacionados con el ensamblaje de los genes (P=2,172 e-55, por prueba de χ2) y 26 genes estaban relacionados con la segregación cromosómica (P=5,472 e-55, prueba de byx2). Entre las redes moleculares construidas con los 137 genes, el CDC20 fue el nodo principal que no ha sido previamente reportado como relacionado con el CHC. Se sabe que nueve genes (NEK2, E2F1,BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C y CDKN2A) interactúan con CDC20, en los que 7 genes estaban relacionados con el punto de control del ensamblaje del husillo (SAC) (Fig.1). El objetivo del SAC es CDC20 (25). Por lo tanto,inferimos que en el CHC, la sobreexpresión de CDC20 conduce a la ausencia de SAC, y las células rápidamente se convierten en aneuploides.

CDC20 se sobreexpresa en HCC

Se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real para examinar el nivel de transcripción de CDC20 en tres líneas celulares de HCC (HepG2, SMMC-7721 y Huh7) y una línea celular hepática normal (LO2). El nivel de ARNm CDC20 era más alto en las tres líneas celulares de HCC que en la línea celular normal (Fig. 2).

Para determinar si la regulación ascendente de CDC20 en líneas celulares de CHC es similar en pacientes con CHC, realizamos PCR cuantitativa en tiempo real en 16 pares de tejidos hepáticos normales de CHC y adyacentes compatibles. Como se muestra en la Fig.3A, se encontró que el CDC20 estaba sobreexpresado de manera diferente en 14 de todas las muestras de CHC primario humano examinadas en comparación con muestras no cancerosas de los mismos pacientes. Además, la relación tumor/no tumor(T/NT) de la expresión del ARNm CDC20 fue por lo menos >2 veces en todas estas 14 muestras con regulación ascendente, y la relación más alta fue de hasta aproximadamente 40 veces. El nivel de proteína de CDC20 se confirmó en las 16 muestras de tejido emparejadas mediante el análisis de western blot. Se utilizó el software Image J1.47v para cuantificar el nivel de gris de cada banda y calcular la relación CDC20 T/NT de cada paciente normalizándose con una tubulina. Los resultados revelaron que todas las muestras de CHC examinadas mostraron un mayor nivel de expresión de la proteína CDC20, excepto la muestra 1 y la muestra 4, que fueron consistentes con el nivel de ARNm (Fig. 3B). Estos hallazgos indicaron que el CDC20 se regulaba comúnmente al alza en tejidos de CHC o líneas celulares.

Se realizó tinción inmunohistoquímica de la proteína CDC20

Se realizó inmunohistoquímica (IHC) para analizar la expresión de proteínas y la localización de CDC20 en 132 muestras de tejido de CHC archivadas con parafina, incluidos 14 casos de tumores bien diferenciados, 78 casos de tumores moderados diferenciados y 40 casos de tumores pobres diferenciados. La proteína CDC20 se reguló al alza (puntuación H ≥200) en 90 (68,18%) de 132 tejidos de CHC. Como se muestra en inFig. 4A, se presentaron niveles elevados de CDC20 en lesiones primarias de CHC y la tinción positiva se localizó principalmente en citoplasma y núcleos. Por el contrario, el CDC20 se tiñó de forma negativa o débil en los tejidos no tumorales correspondientes. Comparando cuantitativamente los puntajes de la tinción de CDC20 entre 132 CHC archivados y tejidos no tumorales adyacentes (principalmente epatocirrosis y hepatitis), los puntajes de la tinción de CDC20 aumentaron significativamente en muestras de CHC en comparación con muestras peritumorales (Fig. 4B). Además, las puntuaciones de la tinción de CDC20 aumentaron significativamente junto con la progresión de la diferenciación histológica tumoral a partir de tejidos bien diferenciados (Fig.5).

Correlación entre el aumento de la expresión de CDC20 y los parámetros clinicopatológicos del CHC

Se volvió a analizar la relación entre la expresión de la proteína CDC20 y las características clinicopatológicas de 132 pacientes con CHC. Como se resume en la Tabla I, la expresión de CDC20 se asoció significativamente con el género (P=0,013), la diferenciación tumoral (P=0,000), el estadio TNM (P=0,012), la expresión P53 y Ki-67 (P=0,023 y P=0,007, respectivamente). Sin embargo, se encontró una asociación nostálgica significativa entre la alta expresión de CDC20 y otras características clinicopatológicas, como edad, tamaño tumoral, infección por VHB,nivel sérico de AFP, cirrosis hepática, invasión vascular y metástasis intra/extrahepática. El análisis de correlación de lanza reveló que una alta expresión de CDC20 estaba estrechamente relacionada con el género (R=0,215, P=0,013), una peor diferenciación tumoral (R=0,421, P<0,001), estadificación TNM avanzada(R=0,218, P=0,012), un nivel de expresión más alto de p53 (R=0,212,P=0,014) y Ki-67 (R=0,235, P=0,007) (Tabla II). En conjunto, estos resultados indicaban que el CDC20 estaba muy expresado en tejidos de CHC y su expresión estaba estrechamente correlacionada con la diferenciación y el progreso del CHC.

Supresión de la expresión de CDC20 por siRNA

La PCR cuantitativa en tiempo real reveló una supresión del nivel transcripcional del 90% de CDC20 a las 48 h después de la transfección con siCDC20, en comparación con células o células transfectadas con siRNA de control negativo (Fig. 6A) (P<0,0001). El western blotanálisis también mostró una supresión obvia del nivel de proteína CDC20 a las 48 h después de la transfección con siCDC20 (Fig. 6B). La expresión alterada de la proteína inhibidora de cinasa dependiente de ciclina 1A (p21) también fue examinada por el análisis de western blot, y los resultados mostraron que el nivel de proteína P21 estaba notablemente elevado debido a la supresión de CDC20 (Fig. 6B).

El efecto de la supresión de CDC20 sobre la proliferación celular y el ciclo celular

El ensayo de proliferación celular reveló que el crecimiento celular de las células transfectadas por el siRNA CDC20 estaba notablemente inhibido en comparación con las células transfectadas con siRNA de control negativo(Fig. 6C). Se esperaba que la inhibición de la proliferación celular por el siCDC20 estuviera acompañada de la detención en la metafase del ciclo celular. Por citometría de flujo, se observó un mayor número de células en la fase G2/M en las células transfectadas al SICDC20 en comparación con las células transfectadas con siRNA de control negativo (Fig. 6D). Estos datos indicaban que la supresión de CDC20 inhibía el crecimiento celular al inducir la detención de fase de G2/M.

Discusión

A través del análisis bioinformático de un conjunto de microarraydatos de la base de datos GEO, identificamos CDC20, que era el modo principal en las redes de interacción molecular HCC, que se relacionaba con el punto de control de ensamblaje de discos (SAC) en el ciclo celular. Durante la tumorogénesis, se pensó que los defectos o la interrupción en el punto de control de ensamblaje del huso eran responsables del aumento de la tasa deaneuploidización (26). Mondalet al ha informado que CDC20 está sobreexpresado en tumores de cabeza primaria y cuello y en varias líneas celulares de carcinoma de células escamosas orales(OSCC). El alto nivel de expresión de CDC20 en células OSCC está asociado con la promoción prematura de la anafase, lo que lleva a anormalidades mitóticas (27). Los estudios también han revelado que se detecta una alta expresión de CDC20 en los tejidos de carcinoma de células escamosas orales y cáncer colorrectal, y su sobreexpresión puede predecir un pronóstico precario para los pacientes (28,29).

CDC20 también es necesario para que las células anafásicas tardías salgan de la mitosis (30). La selección del CDC20 resulta en el bloqueo de la salida de la mitosis, lo que puede ser una mejor estrategia terapéutica contra el cáncer para destruir las células cancerosas de forma más eficaz que los medicamentos que perturban el huso (31). Wang et al informaron que el CDC20, que puede funcionar como una oncoproteína para promover el progreso y el desarrollo de cánceres humanos, representa un objetivo terapéutico prometedor (32). Aunque el papel del CDC20 en la génesis tumoral y el pronóstico de varios cancerígenos humanos se ha investigado y confirmado en profundidad, algunos estudios han investigado la función potencial del CDC20 en la iniciación y progresión del carcinoma hepatocelular.

En este estudio, evaluamos el nivel de expresión de CDC20 en 16 tejidos pareados de CHC frescos congelados y las correspondientes muestras no tumorales. Los resultados indicaron que el ARNm medio y el nivel de proteína CDC20 en los tejidos del CHC eran mucho más altos que en los tejidos no tumorales compatibles. Se utilizó inmunohistoquímica para investigar la localización subcelular de CDC20 y su relación con los parámetros patológicos clínicos del CHC patients.By usando la prueba de χ2, encontramos que un nivel más alto de expresión de la proteína CDC20 se asoció con el género, la diferenciación tumoral,el estadio TNM, la expresión de P53 y Ki-67. Para investigar la función biológica potencial y el mecanismo molecular del CDC20 en el HCC, diseñamos un pequeño ARN de interferencia de doble cadena (siRNA) CDC20 para interferir con su nivel de expresión en la línea celular HepG2. Por el ensayo de proliferación celular y la prueba FACS, encontramos que las células transfectadas con oligonucleótidos siCDC20 mostraron una velocidad de crecimiento decreciente y una mayor proporción de células en la etapa G2/M.

El derribo específico de CDC20 por siRNA mostró un efecto reprimido contra el invitro de proliferación de células de cáncer de hígado, lo que indicó que la sobreexpresión de CDC20 podría acelerar la proliferación celular y promover la iniciación tumoral y la progresión del CHC. Se indujo a las células cancerosas de hígado con expresión de CDC20 comprimida a acumular fase inG2 / M, lo que puede ser responsable de la inhibición del crecimiento celular. El inhibidor de cinasa dependiente de ciclina 1A (p21), que se sabe que participa en el punto de control G2/M (33), se demostró que estaba regulado al alza cuando la expresión de CDC20 se suprimió específicamente en células de cáncer hepático. P21 puede inhibir la actividad de las CDK, lo que conduce a la acumulación de proteína supresora tumoral Rb no fosforilada, que inhibe la activación transcripcional de E2F y, posteriormente, evita la entrada de las células en la fase S del ciclo celular(34).

En conclusión, este es el primer estudio dirigido a la texaminización de la expresión de CDC20 en tejidos y líneas celulares de CHC, proporcionando un nuevo enfoque de que CDC20 puede ser un indicador clínicamente relevante y un objetivo terapéutico prometedor del CHC. Sin embargo, se requieren más estudios centrados en los mecanismos moleculares del CDC20 en el inicio y el progreso del CHC y la investigación sobre la importancia pronóstica del CDC20.

Agradecimientos

Los autores agradecen a sus colegas del Instituto de Biotecnología de la Academia de Ciencias Médicas Militares por su apoyo técnico.

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