Resumen
Las cisteína catepsinas son un grupo de enzimas que normalmente se encuentran en los endolisosomas, donde están involucradas principalmente en el recambio de proteínas intracelulares, pero también tienen un papel crítico en el procesamiento y presentación de antígenos mediados por MHC II. Sin embargo, en una serie de patologías catepsinas cisteína se encuentra fuertemente regulada y secretados al medio extracelular, donde fueron encontrados para degradar una serie de proteínas extracelulares. Un papel importante en la modulación de las actividades de la catepsina es el de los glucosaminoglicanos, que no solo facilitan su activación autocatalítica, incluso a pH neutro, sino que también modulan críticamente sus actividades, como en el caso de la actividad colagenolítica de la catepsina K. La interacción entre las catepsinas y los glicosaminoglicanos se discutirá con más detalle.
1. Introducción
Las catepsinas de cisteína son miembros de la familia de la cisteína peptidasa similar a la papaína . A pesar del hecho de que las once catepsinas de cisteína encontradas en el hombre representan solo una pequeña fracción del repertorio proteolítico humano, estas enzimas han estado atrayendo mucha atención por sus diversos roles en procesos fisiológicos y patológicos que van desde el recambio de proteínas inespecíficas dentro de la vía endolisosómica hasta funciones altamente especializadas en la homeostasis tisular. Recientemente se han publicado una serie de excelentes revisiones que resumen las características estructurales y funcionales de las catepsinas de cisteína en la salud y la enfermedad .
Todas las catepsinas comparten el mismo andamio estructural, también llamado pliegue similar a la papaína. La estructura consta de dos subdominios que se han denominado dominios L y R en referencia a su posición cuando la molécula se muestra en la orientación estándar (Figura 1). La hendidura del sitio activo se encuentra en la parte superior de la molécula entre los dominios L y R y contiene la díada catalítica conservada Cys-His(marcada por esferas amarillas y azules en la Figura 1, resp.). En general, las peptidasas similares a la papaína pueden actuar como endo o exopeptidasas. En una endopeptidasa típica, el determinante primario de especificidad es el sitio S2 y los sitios bien determinados de la enzima interactúan con los residuos P3 a P2′ del sustrato . Cinco de los once miembros humanos de la familia (catepsinas F, K, L, S y V) son exclusivamente endopeptidasas, la catepsina B es también una peptidil dipeptidasa, la catepsina X es una carboxipeptidasa, la catepsina H es una aminopeptidasa y la catepsina C es una dipeptidil peptidasa. La actividad proteolítica de los dos miembros restantes, las catepsinas O y W, aún no se ha determinado . La mayoría de las catepsinas de cisteína se expresan de forma ubicua en el cuerpo humano, mientras que algunas (catepsinas K, S, V y W) se expresan en patrones más restringidos . La catepsina K se expresa abundantemente en osteoclastos y fibroblastos sinoviales, pero también se encuentra en otras células de los linajes hematopoyéticos, epiteliales y fibroblastos . Los niveles más altos de expresión de catepsina S se encuentran en las células presentadoras de antígenos , la catepsina V se expresa predominantemente en el timo y los testículos , y la expresión de catepsina W se limita a los linfocitos CD8+ y a las células asesinas naturales .
2. Regulación de la Actividad de las catepsinas de cisteína
La activación del zimógeno es uno de los principales medios de regulación de la actividad de la catepsina. Todas las catepsinas se sintetizan como zimógenos inactivos y se activan en el medio ácido de las vesículas endolisosomales. El mecanismo molecular de su activación fue desconcertante durante mucho tiempo. La información crítica provino de la combinación de estudios estructurales de procatepsinas B, K y L, que mostraron que el propéptido recorre el sitio activo de las catepsinas en dirección opuesta al sustrato, excluyendo así la escisión del propéptido en la molécula sin movimientos estructurales enormes y energéticamente desfavorables del propéptido, eliminando así el mecanismo unimolecular sugerido inicialmente , y estudios cinéticos detallados, que demostraron claramente que la activación de la catepsina B es un proceso bimolecular . El modelo actual, que se basa principalmente en los estudios de la catepsina B, sugiere que el propéptido en el zimógeno de la catepsina cambia entre dos conformaciones, las llamadas «cerradas» y «abiertas».»En la conformación «cerrada», favorecida a pH neutro a ligeramente ácido, el propéptido bloquea el sitio activo y previene la hidrólisis del sustrato, mientras que, en la forma» abierta», favorecida a pH ácido por debajo de pH 5.0, el propéptido se elimina de la hendidura del lado activo, lo que resulta en una baja actividad catalítica del zimógeno. Esta actividad es suficiente para activar otro catepsina zimógena en uno o varios pasos, iniciando así la reacción en cadena, en la que dicha catepsina B madura totalmente activa procesa la mayoría de las moléculas de zimógeno .
Los otros reguladores principales de las catepsinas de cisteína son inhibidores macromoleculares que se unen al sitio activo y, por lo tanto, evitan la asociación de la peptidasa con su sustrato. Pertenecen a varias familias distintas, incluidas las cistatinas, las tiropinas y las serpinas que, además de las serinas proteasas, también pueden inhibir varias catepsinas .
3. Los glicosaminoglicanos como Reguladores Principales de la Actividad de la Cisteína Catepsina
Los glicosaminoglicanos (GAG) son heteropolisacáridos compuestos de unidades disacáridas repetitivas con una alta carga negativa. Esto es el resultado de la presencia de múltiples grupos carboxilos y sustituciones de sulfato. La mayoría de los GAGs son sulfatados, incluidos los sulfatos de condroitina (CS), sulfato de queratán (KS), sulfato de dermatán (DS), sulfato de heparán (HS) y heparina, mientras que el hialuronano (HA) es el único GAG no sulfatado. En los últimos años, los GAG han surgido como importantes reguladores de las catepsinas de cisteína con diversos efectos en sus dianas. Tradicionalmente, las catepsinas de cisteína se consideraban proteasas lisosomales y, al igual que otras enzimas lisosomales, se sabía que estaban inhibidas por GAGs intralisosomales en el lisosoma en reposo . Hoy en día, sin embargo, las catepsinas de cisteína se establecen como actores principales en la proteólisis extracelular . Su acción en el entorno extracelular rico en glicosaminoglicanos planteó preguntas sobre la interacción entre las catepsinas de cisteína y los GAGs fuera del lisosoma. Los dos grupos de catepsinas endógenas de cisteína humana más comúnmente asociadas con la proteólisis extracelular son las proteasas similares a la catepsina L (catepsinas K, L, S y V en humanos) y la catepsina B . Los datos acumulados en las últimas dos décadas muestran que la interacción entre estas peptidasas y GAGs va en ambos sentidos; las catepsinas de cisteína son capaces de escindir las proteínas del núcleo de proteoglicanos y, por lo tanto, liberar GAGs de su soporte, mientras que los GAGs a su vez afectan tanto a la actividad como a la estabilidad de las catepsinas de cisteína en el espacio extracelular.
La regulación de cisteína peptidasas similares a la papaína por GAGs se describió por primera vez para la catepsina L . En estos primeros trabajos se encontró que los GAG y varias superficies cargadas negativamente aceleran sustancialmente la activación del zimógeno de la catepsina L en la forma madura, incluso a un pH cercano al neutro, como también se encuentra en el medio extracelular en diversas condiciones de enfermedad. Esto se ha confirmado para varias otras catepsinas, siendo las más importantes las catepsinas B y S, e incluso para una T. congopaína homóloga del parásito congoleño, lo que sugiere que los GAG y otras superficies con carga negativa pueden desempeñar un papel importante en la activación extracelular de la catepsina en la enfermedad. Sin embargo, hallazgos recientes con catepsina S a alta concentración de mordaza sugieren que esta enzima puede comportarse de manera algo diferente en tales condiciones con condroitina-4-sulfato (C4S) incluso exhibiendo un efecto desacelerador . Sin embargo, facilitar la activación autocatalítica de las catepsinas por el polisacárido sulfato de dextrano cargado negativamente también se convirtió en un método rutinario en la preparación de catepsinas recombinantes .
La mayor parte de la información sobre el mecanismo molecular de activación de catepsina asistida por mordaza proviene de un estudio de Caglič et al. usando catepsina B humana como modelo . Como se muestra, los GAG parecen contribuir al procesamiento de dos maneras. En primer lugar, al unirse, parecen convertir el zimógeno de la catepsina en un mejor sustrato. En segundo lugar, la unión de GAGs aparentemente favorece la conformación abierta del zimógeno, promoviendo así la activación no solo a pH ácido, sino también a valores de pH más cercanos a neutros. Este parece ser el caso de la mayoría de los GAGs y no depende críticamente de la densidad de carga de los GAGs, ya que también HA fue capaz de acelerar la activación, aunque en menor medida, lo que es inusual para una interacción proteína-GAG. Además, ya un tetrasacárido era suficiente para una aceleración prominente de la autoactivación de la catepsina B, que es sustancialmente menor que la encontrada para una serie de otras reacciones mediadas por mordazas . La interacción está mediada por interacciones iónicas; sin embargo, no parece haber una superficie conservada de unión a mordazas en los zimógenos, ya que se encontró que los residuos completamente no relacionados en las procatepsinas L y B, que se encontraban en gran parte en los prodomains, gobernaban la interacción .
El otro papel importante de los GAG en la regulación de la actividad de la catepsina provino de los estudios sobre la papaína, el representante arquetípico de la familia . Este modo de regulación recibió rápidamente más atención con el descubrimiento de que el sulfato de condroitina del cartílago aumentó de manera prominente la actividad colagenolítica de la catepsina K . Esta peptidasa en particular había sido descubierta unos años antes como la única proteasa responsable de la degradación del colágeno en el remodelado óseo e inmediatamente fue reconocida como un potencial fármaco candidato para el tratamiento de enfermedades metabólicas óseas, como la osteoporosis . La interacción de la catepsina K con el sulfato de condroitina y otros glucosaminoglicanos se examinó más tarde en detalle desde la perspectiva estructural y funcional , y los glucosaminoglicanos se han reconocido como los primeros reguladores alostéricos conocidos de una cisteína catepsina peptidasa, como se describe en detalle en las siguientes secciones. En paralelo, también se han documentado interacciones funcionalmente relevantes con glucosaminoglicanos para otros miembros de la familia de cisteína catepsina. Tomados en conjunto, se ha encontrado que los glicosaminoglicanos afectan tanto la actividad como la estabilidad de las catepsinas de cisteína. Los perfiles cinéticos son generalmente consistentes con mecanismos hiperbólicos, indicando interacciones con enzimas fuera del sitio activo, posiblemente a través de mecanismos alostéricos. El efecto estabilizador es importante especialmente debido a la inestabilidad relativa de las catepsinas de cisteína a pH neutro que se encuentran en la matriz extracelular.
4. Regulación de la Actividad y Estabilidad de la catepsina K
De todas las peptidasas similares a la papaína, la catepsina K se ha establecido como la catepsina más estrechamente vinculada a los glucosaminoglicanos. Se identificó originalmente como una proteasa expresada predominantemente en osteoclastos y su actividad alterada resultó en trastornos óseos graves . La catepsina K es una colagenasa con actividad única entre las peptidasas de mamíferos , que es modulada específicamente por los glicosaminoglicanos a través de mecanismos alostéricos . Debido a su papel central en el recambio óseo, la catepsina K se considera actualmente una de las dianas más prometedoras para el tratamiento de la osteoporosis . Además de la remodelación ósea, la catepsina K participa en diversos procesos fisiológicos y patológicos (para una revisión reciente, véase ). Puede escindir una serie de sustratos extracelulares, incluidos los proteoglicanos, para liberar glicosaminoglicanos activos, que a su vez modulan su actividad. En el cartílago, la catepsina K degrada los colágenos de tipo I y de tipo II y, por lo tanto, contribuye al desarrollo de diversas enfermedades inflamatorias de las articulaciones . Además, la catepsina K se ha asociado con enfermedades cardiovasculares, obesidad, esquizofrenia y cáncer .
La interacción de la catepsina K con diferentes glucosaminoglicanos ha sido objeto de una investigación en profundidad. Aunque varios aspectos de estas interacciones siguen siendo esquivos, los datos acumulados sugieren que las interacciones son heterogéneas y diversas y probablemente involucran múltiples sitios de unión a la enzima. La condroitina-4-sulfato (C4S) se identificó inicialmente como la mordaza con el efecto más dramático sobre la catepsina K, mientras que los efectos de la condroitina-6-sulfato (C6S), el dermatan sulfato (DS) y el hialuronano (HA) fueron más débiles. Todos los GAGs probados aumentaron la estabilidad de la catepsina K en un amplio rango de pH. C4S tuvo el efecto más prominente en la degradación de colágenos de tipos I y II por catepsina K , mientras que su efecto en la hidrólisis de un sustrato sintético fue prácticamente idéntico al de C6S y DS y resultó en un aumento de dos veces en los valores de la constante de especificidad . En un estudio posterior, se encontró que el sulfato de queratán (KS) y la C6S tenían un efecto estimulante sobre la catepsina K similar al de la C4S, mientras que la heparina y la HS tenían un efecto limitado sobre la actividad colagenolítica de la catepsina K. Los primeros experimentos también han sugerido que la formación de complejos con CS es necesaria para la actividad colagenolítica de la catepsina K ; sin embargo, hallazgos recientes han demostrado que el colágeno tipo I también puede degradarse de manera eficiente en ausencia de glucosaminoglicanos . No obstante, se ha demostrado que los GAGS residentes en el hueso potencian la actividad colagenolítica de la catepsina K y las concentraciones endógenas de GAG en el hueso fueron suficientes para lograr un efecto máximo sobre la actividad de la catepsina K.
El mecanismo cinético del efecto de CS, DS y heparina (HP)sobre la catepsina K también se investigó en detalle a un pH plasmático fisiológico de 7,4. En estas condiciones, el CS y el DS se caracterizaron como activadores no esenciales con un efecto predominante en la afinidad por el sustrato . El DS fue más efectivo que el CS, lo que se atribuyó a su mayor flexibilidad debido a la menor cantidad de enlaces de hidrógeno intramoleculares . La fluorescencia intrínseca indicó que la unión de GAGs afecta la conformación de la catepsina K. En contraste con los experimentos realizados a pH 5,5, CS y DS actuaron como inhibidores de la degradación del colágeno a pH fisiológico plasmático. En contraste, el mecanismo cinético de la heparina fue bifásico, lo que indica interacción con dos sitios distintos de la enzima. En conjunto, la heparina fue un potente activador de la catepsina K a pH plasmático fisiológico, aumentando tanto sus actividades colagenolíticas como elastinolíticas. Además, la heparina tuvo un fuerte efecto estabilizador sobre la catepsina K en estas condiciones, lo que resultó en un aumento de más de 5 veces en la vida media de la enzima .
5. Base estructural para la Interacción entre Catepsina K y GAGs
La estructura cristalina de catepsina K y C4S reveló la base estructural para la interacción . El sitio de unión se encuentra en la parte posterior de la catepsina K e interactúa con tres unidades disacáridas de CS en la estructura cristalina (Figura 2(a)). Como de costumbre, la interacción glicosaminoglicano/proteína está mediada principalmente por interacciones electrostáticas entre la cadena MORDAZA cargada negativamente y los residuos cargados positivamente en la enzima. La unión del sulfato de condroitina no causa cambios conformacionales significativos en la catepsina K en comparación con la catepsina K libre de CS.Por el contrario, la cadena CS se dobla al unirse a la catepsina K (Figura 2(b)). La mayor parte del cambio conformacional se puede atribuir a la interacción con una región helicoidal corta Arg8-Lys9-Lys10 que interactúa con cuatro grupos con carga negativa en CS (Figura 2(c)). Otros contactos cercanos incluyen Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191 y Leu195 y algunos contactos adicionales mediados por agua .
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El comportamiento cinético del DS fue análogo al del CS: por lo tanto, se propuso que interactúa con la catepsina K de la misma manera que el CS . Por otro lado, se propuso que la heparina se uniera a dos sitios de catepsina K de acuerdo con su perfil cinético. Mientras que se propuso que el primer sitio de unión fuera idéntico al de CS/DS, el segundo sitio de unión se predijo en la parte inferior de la molécula mediante experimentos de reticulación química y modelado computacional . Desde una perspectiva estructural, el sitio de unión predicho es una continuación del sitio de unión de CD/DS y consiste en varios residuos básicos (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127 y Lys214) organizados en una estructura en forma de anillo (Figura 2(d)). Experimentos cinéticos han confirmado que la heparina se puede unir a ambos sitios al mismo tiempo . Sin embargo, queda por determinar si esto requiere una cadena de HP que interactúe con ambos sitios al mismo tiempo o dos cadenas de HP separadas. Esto no está claro para la interacción de otros mordazas con el segundo sitio de unión de HP.
6. Interacciones de los GAG con las catepsinas S y B
Aparte de la catepsina K, se ha demostrado que otras dos peptidasas similares a la papaína humana, las catepsinas S y B, están reguladas por glucosaminoglicanos en sus formas maduras . La catepsina S, el pariente más cercano de la catepsina K, es inusual entre las catepsinas de cisteína por ser estable a pH neutro . La catepsina S tiene funciones fisiológicas importantes en las células presentadoras de antígenos como la proteasa más importante en el procesamiento de antígenos y recientemente se encontró que estaba regulada por C4S . En contraste con el efecto de activación observado con la catepsina K, la C4S actuó como un inhibidor de la degradación del colágeno tipo IV por la catepsina S. La inhibición también se observó con la HS, mientras que HP, DS, C6S y HA aumentaron ligeramente la actividad proteolítica de la catepsina S utilizando colágeno tipo IV como sustrato. C4S, C6S y HS también inhibieron la hidrólisis de Z-Phe-Arg-AMC a través de un mecanismo mixto parcial. Al igual que la catepsina K, se observaron cambios conformacionales sutiles en la catepsina S tras la unión de C4S por espectroscopia de fluorescencia intrínseca. Se predijeron tres sitios de unión para C4S en catepsina S mediante acoplamiento molecular (Figura 3 (a)). Uno de los sitios propuestos es el sitio activo, que, sin embargo, no está de acuerdo con el perfil de inhibición mixta observado de C4S; el segundo se encuentra en la parte inferior derecha de la molécula y corresponde al sitio alostérico recientemente identificado en la catepsina K , mientras que el tercero se encuentra en la parte inferior de la molécula y corresponde aproximadamente al sitio secundario de unión a heparina identificado en la catepsina K .
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La catepsina B es única entre las catepsinas cisteína por ser tanto una endopeptidasa como una peptidil dipeptidasa, dependiendo de la conformación del asa de oclusión, una estructura específica de la catepsina B que proporciona un cambio específico de pH entre ambas actividades . En el lisosoma, el pH bajo restringe la proteasa a una conformación exopeptidasa cerrada, mientras que el pH casi neutro del entorno extracelular promueve la actividad endopeptidasa de la catepsina B. La catepsina B extracelular se asocia con mayor frecuencia con cáncer y varios tipos de artritis . La proteasa se localizó en la superficie celular en varios estudios y se encontró que estaba involucrada en la migración celular en condiciones fisiológicas y patológicas . A nivel molecular, se demostró que escinde una serie de sustratos extracelulares, incluida la laminina, el colágeno tipo IV y la fibronectina . Recientemente, también se ha sugerido que la catepsina B es una β-secretasa que produce péptidos β amiloides en vesículas secretoras de células cromafínicas neuronales . Sin embargo, también se ha demostrado que degrada los depósitos de amiloide en un modelo animal y se ha sugerido que el resultado general está determinado por el equilibrio entre la catepsina B y su inhibidor endógeno cistatina C.
Se ha demostrado que la unión de HP o HS aumenta la estabilidad de la enzima, de otro modo inestable, a un pH alcalino (8,0), al tiempo que reduce ligeramente la actividad de la enzima a lo largo de todo el perfil de pH de la enzima . Las simulaciones computacionales han predicho que la heparina estabiliza la conformación de la molécula en estas condiciones y han predicho dos supuestos sitios de unión a mordazas (Figura 3(b)), uno a cada lado de la enzima . El sitio de unión putativo en el dominio L consta de cinco residuos básicos (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 y Lys144), mientras que el del dominio R contiene solo dos (Lys158 y Arg235). Los autores han sugerido que el sitio de unión en el dominio R tiene mayor afinidad por fragmentos mordaza más cortos, como el disacárido de heparina utilizado en sus simulaciones de acoplamiento, mientras que el del dominio L es probablemente más relevante para la unión de fragmentos mordaza más largos .
7. Interacciones de GAGs con Otras Peptidasas similares a la Papaína
Curiosamente, la papaína también ha demostrado interactuar con GAGs. A pesar de no tener relevancia fisiológica, estas interacciones apuntan a mecanismos de regulación conservados evolutivamente dentro de la familia. HP inhibió la papaína por un mecanismo mixto hiperbólico y afectó su conformación . Se identificó una secuencia de consenso de unión a heparina clásica en la papaína, en la forma de la secuencia 187-Ile-Arg-Ile-Lys-Arg-Gly-192. Estructuralmente, esta secuencia se encuentra en el lado derecho de la molécula (Figura 3(c)) en una región que se encuentra entre ambos sitios alostéricos conocidos en la catepsina K.
Además, se han descrito algunos ejemplos de proteasas de parásitos protozoarios que interactúan con GAG, lo que sugiere la posibilidad de su influencia en las interacciones huésped-parásito. Se ha encontrado que el homólogo de la catepsina L brucipaína, un factor de virulencia crucial del parásito protozoario Trypanosoma brucei, está modulado alostéricamente por HS. El efecto de la HS en este estudio fue sutil y tuvo la capacidad de revertir la inhibición del sustrato por un sustrato dipéptido pequeño (Z-Phe-Arg-AMC) . Se observó un efecto más fuerte de la HS para la cruzipaína del parásito relacionado Trypanosoma cruzi. En este caso, el HS fue un activador de la peptidasa que causó un aumento significativo (hasta 6 veces) en la actividad de la peptidasa medida con un sustrato sintético. Además, el HS aumentó la liberación de cinina del quininógeno de alto peso molecular por parte de cruzipain in vitro, así como por tripomastigotes vivos, y redujo las propiedades inhibitorias del kininógeno hacia cruzipain . De manera similar, se ha demostrado recientemente que HP modula la actividad de la peptidasa tipo L de catepsina rCPB2.8 de Leishmania mexicana . En este caso, HP y HS, pero no CS o DS, inhibieron la hidrólisis de Z-Phe-Arg-AMC por un mecanismo mixto hiperbólico y afectaron la conformación de la proteína . En conjunto, estos ejemplos muestran que las interacciones con GAG no se limitan a las catepsinas endógenas de cisteína, sino que también pueden desempeñar diversos papeles en las interacciones huésped-patógeno y pueden actuar como parte de la defensa del cuerpo contra los patógenos invasores o como factores que contribuyen a los mecanismos invasivos del patógeno.
8. La catepsina K representa actualmente el objetivo farmacológico más atractivo entre las catepsinas, aunque la catepsina S también es un objetivo relevante en enfermedades asociadas con una respuesta inmunitaria elevada, como el asma bronquial y la psoriasis . Actualmente se están desarrollando varios inhibidores de la catepsina K, que se dirigen al sitio activo de la enzima (recogida en ). Por el momento, el inhibidor más prometedor es odanacatib (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EE.UU.), un inhibidor que contiene ojivas de nitrilo, altamente selectivo para la catepsina K . Los ensayos clínicos de fase III para odanacatib han concluido con éxito y se espera que las solicitudes de aprobación se presenten pronto. Si se aprueba, el medicamento se posicionará en el mercado frente a otros medicamentos de nueva generación, como el anticuerpo anti-ligando de rango denosumab (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, EE. UU.) y la teriparatida, una forma recombinante de hormona paratiroidea (Eli Lilly and Company, Indianápolis, IN, EE. UU.), así como los bifosfonatos bien establecidos. Atacar la interacción catepsina K / condroitina-sulfato representaría una alternativa a estos tratamientos. El sulfato de condroitina endógeno es suficiente para exhibir un efecto de activación máximo sobre la catepsina K y su digestión reduce la actividad de la catepsina K en un 40% . Una reducción del recambio óseo de esta magnitud probablemente bastaría para el tratamiento de pacientes con una reducción de la densidad ósea menos grave. Un beneficio adicional sería que la actividad de la catepsina K per se, así como la viabilidad y el recuento celular de osteoclastos y osteoblastos permanecerían inalterados.
Conflicto de Intereses
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este documento.
Reconocimiento
El trabajo ha sido apoyado por subvenciones de la Agencia Eslovena de Investigación (P1-0140 y J1-3602) a Boris Turk.
