Resumen
La transcripción del VIH-1 está regulada por CDK9 / ciclina T1, que, a diferencia de una quinasa típica dependiente del ciclo celular, está regulada por asociación con el pequeño complejo de proteína ribonuclear nuclear (snRNP) de 7SK. Si bien los componentes proteicos de este complejo están bien estudiados, el mecanismo de la formación del complejo aún no se comprende completamente. La asociación de CDK9 / ciclina T1 con 7SK snRNP está, en parte, regulada por una fosforilación reversible de CDK9. Aquí, presentamos una revisión exhaustiva de las quinasas y fosfatasas involucradas en la fosforilación de CDK9 y discutimos su papel en la regulación de la replicación del VIH-1 y el potencial de ser objetivo para el desarrollo de medicamentos. Proponemos una nueva vía de regulación de la transcripción del VIH-1 a través de la fosforilación de CDK9 Ser-90 por CDK2 y desfosforilación de CDK9 Ser-175 por la proteína fosfatasa-1.
1. Introducción
La erradicación completa de la infección por el VIH-1 requiere enfoques novedosos para inducir el provirus del VIH-1 integrado que no se ve afectado por los medicamentos antirretrovirales existentes y que se recupera al finalizar la terapia antirretroviral . La latencia del VIH-1 puede ser el resultado de varios factores, como la deficiencia de la proteína activadora transcripcional del VIH-1 (Tat) o activadores transcripcionales celulares, interferencia transcripcional con promotores celulares, sitio de integración desfavorable, epigenética y probablemente otros factores . Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos de activación de la transcripción del VIH-1 es importante para el diseño de nuevas terapias dirigidas a la inducción, así como a la inhibición de la transcripción del VIH-1. Aquí, revisamos las quinasas y fosfatasas involucradas en la activación de CDK9/ciclina T1 y discutimos cómo estas enzimas pueden usarse potencialmente para inhibir o activar el VIH-1 para el desarrollo de futuras intervenciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones por VIH-1.
2. Activación de la Transcripción del VIH-1 por P-TEFb
La transcripción del VIH-1 es activada por la proteína Tat del VIH-1 que se une al bulto de ARN de ALQUITRÁN, una estructura de bucle de horquilla ubicada en el extremo 5’de todas las transcripciones nacientes del VIH-1, y recluta CDK9/ciclina T1, un componente del factor de elongación de la transcripción positiva b (P-TEFb) al promotor del VIH-1 (revisado en detalle en ; ver también ilustración en la Figura 1). Durante el inicio de la transcripción, los fosforilatos CDK7/ciclina H asociados a TFIIH Ser-5 dentro de la secuencia de heptapéptidos 1YSPTSPS7 se repitieron 52 veces en el dominio C-terminal (CTD) de RNAPII . El RNAPII fosforilado Ser-5 se acumula a 20-40 nucleótidos (nt) aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción, en parte debido a las acciones del complejo del factor de elongación de acción negativa, NELF, y el complejo inductor de sensibilidad a DRB, DSIF . Recientemente se demostró que CDK7 asociado a TFIIH fosforila también residuos de CTD Ser-7, que pueden preparar la fosforilación de Ser-2 por P-TEFb . El reclutamiento de P-TEFb al promotor del VIH-1 ubicado dentro de la región U3-R-U5 del 5′ LTR es facilitado por Tat que se dirige a CDK9/ciclina T1 al ARN de ALQUITRÁN, donde la ciclina T1 se une al bucle rico en G del ARN de ALQUITRÁN . El reclutamiento de CDK9 / ciclina T1 promueve la elongación de la transcripción por la ARN polimerasa II (RNAPII), que de lo contrario se detiene después de la síntesis de ARN de ALQUITRÁN . La liberación de RNAPII de la pausa por el complejo P-TEFb se acompaña de tapado de ARNm y pérdida de NELF . P-TEFb desencadena el alargamiento de la transcripción de la ARN polimerasa II (RNAPII) fosforilando el factor de alargamiento negativo (NELF) y el complejo inductor de sensibilidad a DRB (DSIF/Spt4/Spt5), promoviendo así la liberación de NELF y también fosforilando residuos de Ser-2 en RNAPII CTD (revisado en ). Tras la disociación de NELF, el DSIF se convierte en un factor de elongación positivo y aumenta la procesividad RNAPII . Aunque el P-TEFb viaja con el complejo de elongación, su actividad de la quinasa CTD ya no es necesaria una vez que el complejo se libera de la pausa .
representación Esquemática del VIH-1 en la regulación de la transcripción por CDK9 la fosforilación y desfosforilación. La figura representa una red de factores de células huésped que interactúan con Tat que afectan la fosforilación de CDK9. Las flechas indican fosforilación (violeta), desfosforilación (naranja) y transición de complejos P-TEF y complejos de transcripción (negro). CDK2 fosforila CDK9 Ser-90. Los quelantes de hierro reducen la actividad celular de CDK2 / ciclina E e inhiben la transcripción del VIH-1 (indicada por la línea roja). CDK7 fosforila CDK9 Thr-186. La desfosforilación de Thr-186 por PPM1A o PP1 facilita la disociación de CDK9/ciclina T1 del gran complejo P-TEFb y el reclutamiento de CDK9/ciclina T1 por Tat o BRD4. BRD4 se une preferentemente a CDK9 fosforilado con Ser-175. La desfosforilación de Ser-175 por PP1 activa la actividad de la quinasa CDK9 y activa la transcripción del VIH-1. El reclutamiento de CDK9 / ciclina T1 por Tat al ARN de ALQUITRÁN conduce a la fosforilación de NELF, que se disocia, y también a la fosforilación de residuos de DSIF y RNAPII CTD Ser-2, que se ve facilitada por la fosforilación de CTD Ser-7. CDK7 como parte de fosforilatos TFIIH CTD Ser-5 y posiblemente residuos Ser-7. CDK7 también fosforila CDK9 Thr-186 y mantiene la fosforilación CDK9 Thr-186 durante el alargamiento de la transcripción.
Debido a la importancia del P-TEFb, la regulación debe mantenerse para asegurar el funcionamiento adecuado. La fosforilación y desfosforilación de sitios específicos en CDK9 deben ocurrir a lo largo del proceso de transcripción y deben controlarse estrechamente. Esta revisión se centra en la regulación de CDK9 a través de modificaciones de fosforilación.
3. Composición de P-TEFb y Su Papel en la Activación de la Transcripción del VIH-1
P-TEFb es un heterodímero que consiste en la quinasa dependiente de ciclina 9 (CDK9) y una de las ciclinas de tipo C T1, T2a o T2b de las cuales la ciclina T1 es la compañera más abundante . La ciclina K, que originalmente se pensaba que era una ciclina menor de CDK9, ahora se reconoce como una compañera de ciclina para CDK12 y CDK13 . Solo la proteína T1 de ciclina forma eficientemente un complejo con Tat del VIH-1 unido al ARN de ALQUITRÁN . Esto se debe a la presencia de un residuo de cisteína en la ciclina T1 en la posición 261 en lugar de una asparagina que se encuentra en las proteínas T2a y T2b de la ciclina. La ciclina T1 con Cys-261 mutado se une al Tat pero es incapaz de reclutar Tat al ARN de ALQUITRÁN. La interacción del Tat con el ARN de ALQUITRÁN y la ciclina T1 depende de los iones de zinc, lo que nuevamente requiere la presencia de Cys-261 .
Hay dos isoformas funcionales de CDK9: una forma de 42 kDa expresada predominantemente en bazo, timo y testículo y una forma de 55 kDa que se expresa en varios tejidos pero a niveles significativamente más bajos que es la isoforma de 42 Kd . Todas las ciclinas se asocian con ambas isoformas de CDK9 y exhiben actividad quinasa hacia CTD en RNAPII . Aproximadamente la mitad del P-TEFb se encuentra en un complejo grande inactivo unido por el ARNsn 7SK y varias proteínas adicionales , incluida la proteína 1 inducible por bisacetamida hexametilénica (HEXIM1), la proteína LARP7 relacionada con La La y la enzima que capsula la metilfosfatasa MePCE . La forma de menor peso molecular de P-TEFb consiste en CDK9 y ciclina T1 y es enzimáticamente activa . El P-TEFb de alto peso molecular está inactivo debido a la HEXIM1 que introduce su secuencia inhibitoria de PYNT en el sitio activo de CDK9 .
El complejo P-TEFb de alto peso molecular sirve como fuente de CDK9 / ciclina T1 para el reclutamiento por Tat de VIH-1 . En las células inducidas por estrés, el complejo CDK9 / ciclina T1 se disocia de la proteína 7 SK ARN / HEXIM1 y luego se une a BRD4 y forma un pequeño complejo transcripcionalmente activo que se recluta a varios promotores celulares . A pesar de la inactividad del complejo grande de P-TEFb in vitro, el complejo grande, y no el complejo pequeño, es importante para la activación de la transcripción del VIH-1 como VIH-1. Tat compite con HEXIM1 para unirse a la ciclina T1 promoviendo la disociación de P-TEFb del complejo grande . También se demostró que la proteína Tat del VIH-1 reclutaba un complejo P-TEFb grande para convertirse en promotor del VIH-1, donde el ARN de ALQUITRÁN era capaz de desplazar el ARN 7 SK y activar el P-TEFb .
Tat también facilita la formación de complejo de superelongación (SEC) que contiene P-TEFb activo y factores de elongación adicionales y coactivadores de transcripción . Estos factores incluyen AFF4, ENL, AF9 y el factor de elongación ELL2 . La proteína AFF4 emerge como el andamio central que recluta otros factores a través de interacciones directas. AFF4 se une a la ciclina T1, ELL2 y ENL o AF9 actuando como un puente que une este complejo con P-TEFb . A través de las funciones de puente de Tat y AFF4, P-TEFb y ELL2 se combinan para formar un complejo de elongación bifuncional que activa en gran medida la transcripción del VIH-1 . Sin Tat, AFF4 puede mediar la interacción ELL2-P-TEFb, aunque de manera ineficiente. Tat supera esta limitación al llevar más ELL2 a P-TEFb y estabilizar ELL2 en un proceso que requiere P-TEFb activo .
4. Fosforilación CDK9
La actividad de la P-TEFb depende de la fosforilación de varios residuos de serina y treonina, y discutiremos esto a continuación y que se muestran en el modelo CDK9/ciclina T1/Tat en la Figura 2.
Estructura de CDK9/ciclina T1/Tat complejo (modelo basado en el PDB 3MIA). La representación troncal de los residuos de CDK9 presentes en la estructura original de PDB se muestra en color verde, ciclina T1 en violeta y Tat en rojo. Se indica la posición de los grupos Thr-29, Ser-175, Thr-186 y C-terminal Ser/Thr. También se muestran el sitio de unión a ATP y los iones Zn que facilitan la interacción Tat-ciclina T1.
4.1. Fosforilación C-Terminal de CDK9
Un grupo de residuos C-terminales de CDK9 (Ser-347, Ser-353 y Ser-357; Thr-350 y Thr-354) se autofosforila y esta fosforilación es importante para la unión de CDK9/ciclina T1 al ARN de ALQUITRÁN . Esto se evidenció por la incapacidad de CDK9 truncado C-terminal enzimáticamente activo para unirse al ARN de ALQUITRÁN . CDK9/ciclina T1 recombinante que fue autofosforilada in vitro fue desfosforilada eficientemente por la proteína fosfatasa 2A (PP2A), pero no por la proteína fosfatasa-1 (PP1) . También el tratamiento con PP2A impidió la unión de CDK9/ciclina T1 al Tat y ARN de ALQUITRÁN in vitro . Estas observaciones sugirieron que PP2A podría apuntar al C-terminal de CDK9 y potencialmente controlar la interacción de P-TEFb con el ARN de ALQUITRÁN. La autofosforilación de CDK9 asociada con el complejo de preiniciación in vitro fue inhibida por TFIIH . Más tarde se descubrió que el PP2A era esencial para la transcripción basal del VIH-1 in vitro, ya que el agotamiento del PP2A inhibía la transcripción basal del VIH-1 y el agregado de PP2A a los extractos agotados restauraba la transcripción . Se pensó que el objetivo de PP2A era Thr-29 (ver más adelante), pero esto no se demostró con certeza y el efecto no se reprodujo in vivo. En un estudio inicial, observamos una inducción leve de la transcripción del VIH-1 basal, pero no inducida por Tat, por bajas concentraciones de ácido okadaico inhibitorio de PP2A . También observamos inducción de la transcripción del VIH-1 activada por Tat basal y no por Tat con la sobreexpresión de la proteína LIS1, que encontramos que se une e inhibe la PP2A in vitro e interactúa con la proteína Tat del VIH-1 . Colectivamente, estos estudios indican que el PP2A puede regular la transcripción basal del VIH-1 y también controlar la interacción del P-TEFb con el ARN de alquitrán por defosforilación del C-terminal de CDK9.
4.2. Fosforilación N-Terminal de Thr-29
Se demostró que la fosforilación de Thr-29 de CDK9 fue inducida por la proteína del impuesto HTLV-1 . La CDK9 / ciclina T1 es reclutada para la LTR cromatinizada del VIH-1 y otros promotores por BRD4 . Este reclutamiento de BRD4 se relacionó con la fosforilación de CDK9 Thr-29 y el requisito de desfosforilación de PP2A por parte del grupo de John Brady . Sin embargo , el grupo de Qiang Zhou informó que es necesario fosforilar CDK9 en Ser-175 para unirse a BRD4, lo que fue confirmado recientemente por el grupo de Jonathan Karn (ver discusión detallada a continuación). El Thr – 29 de CDK9 es homólogo al Thr-15 de CDK2, en el que la fosforilación inhibe la actividad de CDK2 . De hecho, se demostró que la fosforilación de Thr-29 inhibe la actividad de CDK9 y la transcripción del VIH-1 . Sin embargo, no pudimos detectar la fosforilación de CDK9 Thr-29 en células tratadas con ácido okadaico que inhibía tanto PP2A como PP1 utilizando una combinación de electroforesis de capa delgada Hunter 2D y espectrometría de masas de alta resolución que solo mostraba fosforilación del C-terminal C del cúmulo Ser/Thr y Ser-175, de los cuales solo la fosforilación de Ser-175 fue inducida por el ácido okadaico . Por lo tanto, la fosforilación de CDK9 Thr-29 puede no ser controlada por PP2A y necesita ser validada para aclarar su papel durante la transcripción del VIH-1.
4.3. El bucle T de CDK9 Thr-186 Fosforilación
El bucle T de CDK9 contiene varios sitios de fosforilación, incluidos Ser-175 y Thr-186 (Figura 2). La fosforilación del Thr-186 conservado es necesaria para la actividad enzimática de CDK9 . También la asociación de CDK9/ciclina T1 con el ARN 7SK snRNP requiere la fosforilación Thr-186 de CDK9 . En las CDK, la fosforilación del bucle en T desencadena cambios conformacionales importantes que abren la bolsa de unión de ATP y un sitio de unión de sustrato, lo que hace que las CDK sean completamente activas como quinasa .
Recientemente, el análisis químico-genético utilizando inhibición química selectiva de CDK7 mostró que es el único responsable de la fosforilación de CDK9 Thr-186 y de la fosforilación CTD Ser-2 dependiente de P-TEFb y de la ubiquitilación de histonas H2B in vivo . Por lo tanto, CDK7/ciclina H, que fue identificada previamente como cinasa activadora de CDK (CAK) para las CDK involucradas en el ciclo celular, como CDK1, 2 y 4, también funciona como CAK para las CDK involucradas en la regulación de la transcripción que incluyen CDK8, 9, 12 y 13 (revisado en ). El análisis global de las quinasas que pueden fosforilar el bucle T de CDK9 utilizando ARNip identificó Ca (2+)/quinasa dependiente de calmodulina 1D (CaMK1D) derribada por ARNip disminuyó la fosforilación de Thr-186 . En consecuencia, la inhibición de moléculas pequeñas de la vía de señalización de Ca(2+) disminuyó la fosforilación de Thr-186 e inhibió la transcripción de VIH-1 inducida por Tat, pero no la transcripción de HTLV-1 mediada por impuestos . Debido a que la transcripción mediada por impuestos es impulsada por P-TEFb, queda por investigar más a fondo por qué solo la transcripción del VIH-1 se vio afectada.
La fosforilación CDK9 Thr-186 también puede ser controlada por fosfatasas celulares. Nuestros estudios de la última década se centraron en PP1 que inicialmente observamos que estimulaba la transcripción del VIH-1 dependiente de Tat in vitro . Cuando sobreexpresamos una de las principales subunidades reguladoras nucleares de PP1, NIPP1 (inhibidor nuclear de PP1), observamos una inhibición específica de PP1 de la transcripción del VIH-1 y la replicación viral . Notamos que el Tat contiene una secuencia similar a un motivo RVxF de unión a PP1 conservado y demostramos que este motivo media la unión del Tat al PP1 in vitro e in vivo y que la mutación de residuos en el motivo de unión al PP1 (V36A y F38A) impidió que el Tat induciera la transcripción del VIH-1 . CDK9 que fue fosforilado en células cultivadas con ortofosfato (32P)y tratado con ácido okadaico fue desfosforilado eficientemente in vitro por PP1 pero no PP2A en contraste con el CDK9 autofosforilado in vitro que fue desfosforilado por PP2A y no por PP1 . Estos resultados sugirieron que el PP1 puede controlar la fosforilación de CDK9 durante la transcripción del VIH-1. De hecho, se demostró que la subunidad catalítica alfa de PP1, PP1a, actúa de forma cooperativa y secuencial con (Ca2+)-calmodulina-proteína fosfatasa 2B (PP2B) en células tratadas con radiación UV o bisacetamida de hexametileno (HMBA) en las que se libera P-TEFb del complejo 7SK snRNP . Mientras que el PP2B induce un cambio conformacional en el snRNP de 7SK, el PP1a defosforila el CDK9 Thr-186 y facilita las liberaciones de P-TEFb desde el snRNP de 7SK . CDK9 permaneció desfosforilado mientras estaba asociado con BRD4 y fue reclutado al complejo de preiniciación, donde puede ser reactivado por CDK7 asociado a TFIIH. De acuerdo con este estudio, observamos un aumento de la fosforilación de CDK9 Thr-186 en las células que expresaban de forma estable un péptido inhibidor de PP1, el dominio central de NIPP1, y también observamos un aumento de la asociación de CDK9/ciclina T1 con ARN 7SK . La expresión estable de cdNIPP1 interrumpió la interacción entre Tat y PP1 e inhibió la transcripción del VIH-1, lo que sugiere que se debe mantener un equilibrio entre la fosforilación y la desfosforilación de CDK9 Thr-186 y que cambiar este equilibrio hacia la fosforilación es inhibitorio para la transcripción del VIH-1. Expresión de cdNIPP1 de una manera fisiológicamente relevante como parte del genoma del VIH-1 en lugar de la replicación del VIH-1 con inhibición potente de la nef , lo que sugiere además que los inhibidores dirigidos a la PP1 pueden ser útiles como posibles terapias contra el VIH-1. Mientras que PP1 es un candidato para la desfosforilación de Thr-186, también encontramos que desfosforila CDK9 Ser-175 (ver más abajo). Se identificó una fosfatasa CDK9 Thr-186 adicional, proteína fosfatasa 1A dependiente de magnesio (Anteriormente 2C) (PPM1A) utilizando una biblioteca de expresión de fosfatasa y anticuerpos Thr-186-fosfoespecíficos . La sobreexpresión de PPM1A disminuyó la fosforilación de Thr-186 y el agotamiento mediado por siRNA lo aumentó, y P-TEFb y PPM1A también coprecipitaron juntos, lo que sugiere que CDK9 puede ser un sustrato fisiológico para PPM1A . Un estudio más reciente mostró que la fosforilación Thr-186 de CDK9 disminuye en las células T CD4(+) en reposo que no son permisivas para la replicación del VIH-1 y que esta disminución se correlaciona con la abundancia de PPM1A y el reclutamiento limitado de CDK9 al gran complejo P-TEFb . Este hallazgo apoya aún más la necesidad del complejo grande para la transcripción del VIH-1 y el papel crítico del PPM1A en la supresión del VIH-1 en las células T en reposo. Debido a que la expresión de PPM1A no se modificó tras la activación de las células T , sin embargo, factores reguladores desconocidos pueden estar involucrados en la regulación de la actividad de PPM1A.
4.4. Fosforilación del Bucle T de CDK9 Ser-175
Una vez que CDK9/ciclina T1 se disocia del gran complejo P-TEFb, CDK9 puede fosforilarse en el Ser-175. Mientras que la desfosforilación de Thr-186 inhibió totalmente la actividad de la quinasa CDK9/ciclina T1, David Price y sus colegas no encontraron diferencia en las actividades de la quinasa de los mutantes CDK9 S175A y CDK9 S175D . En contraste, Qiang Zhou y su grupo mostraron que el mutante CDK9 S175A estaba inactivo, mientras que el mutante CDK9 S175D estaba activo como quinasa . También mostraron que la fosforilación de Ser-175 promueve la unión de CDK9/ciclina T1 a Brd4 . Se sugirió que la fosforilación de Ser-175 puede causar un cambio conformacional en CDK9, permitiendo que BRD4 se una a la ciclina T1 . En nuestro estudio reciente, encontramos que la inhibición dinámica de PP1 condujo a una fosforilación exclusiva de CDK9 Ser-175 determinada por una combinación de mapeo de péptidos 2D de Hunter y análisis LC-MS in vivo . La inhibición de PP1 condujo a la inhibición de la actividad de CDK9 y a la reducción de la fosforilación de RNAPII in vitro e in vivo . Encontramos que el mutante CDK9 S175A era enzimáticamente activo e indujo la transcripción del VIH-1 . Curiosamente, mientras que el mutante CDK9 S175D fue menos activo como quinasa, formó más fácilmente un pequeño complejo de P-TEFb, especialmente cuando se inhibió PP1. Por lo tanto, concluimos que el PP1 activa la transcripción del VIH-1 al desfosforilar el residuo CDK9 Ser-175. También notamos que la actividad de fosforilación de Ser-175 era mucho más abundante que la actividad de Thr-186 en extractos celulares, lo que sugiere que la actividad de CDK9 puede suprimirse naturalmente a través de la sobrefosforilación de Ser-175. Un estudio reciente del grupo de Jonathan Karn mostró que la activación de las células T a través del receptor de células T (TCR) o el éster de forbol (PMA), que señaliza, induce fuertemente la fosforilación de la Ser-175 CDK9 . Basándose en el modelado molecular, propusieron que el Ser-175 fosforilado forma un enlace de hidrógeno con Tat Lys-14, fortaleciendo la unión del Tat a CDK9/ciclina T1 y promoviendo la activación de la transcripción del VIH-1 . También de acuerdo con las primeras observaciones, se encontró que la mutación CDK9 S175A abolía la unión a BRD4 . Además, de acuerdo con nuestras observaciones, se encontró que el mutante CDK9 S175A induce en gran medida la reactivación latente del VIH-1 dependiente de Tat, que Jonathan Karn y sus compañeros de trabajo atribuyeron a la incapacidad de este mutante para unirse a BRD4 mientras era capaz de unirse a Tat . También encontraron que CDK9 fosforilado en Ser-175 está excluido del complejo RNP de 7SK , lo que es paralelo a nuestra observación anterior de que el mutante fosfomimético CDK9 S175D se encontró en un pequeño complejo P-TEFb . Por lo tanto, este último estudio apunta a Ser-175 como un objetivo importante para la reactivación del VIH-1 y el desarrollo potencial de terapias de moléculas pequeñas.
Recientemente desarrollamos moléculas pequeñas dirigidas a PP1 que se modelaron para adaptarse a la cavidad de alojamiento de RVxF en PP1 . Examinamos prácticamente unos 300.000 compuestos y luego examinamos físicamente unos 1.000 compuestos e identificamos un compuesto hit, 1H4, que inhibía la transcripción y replicación del VIH-1 a concentraciones no citotóxicas . 1H4 impidió la desfosforilación mediada por PP1 de un péptido de sustrato que contenía una secuencia de RVxF in vitro, interrumpió la asociación de PP1 con Tat en células cultivadas e impidió la translocación de PP1 al núcleo . Actualmente estamos en el proceso de refinar el compuesto hit y también de desarrollar compuestos dirigidos a PP1 para la activación de provirus latente.
4.5. Fosforilación Ser-90 de CDK9
Nosotros y otros hemos demostrado anteriormente que la transcripción del VIH-1 se activa por Tat en la fase G1, pero no en la fase G2 . Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el Tat podría involucrar una cinasa reguladora del ciclo celular, que demostramos que era CDK2/ciclina E. El VIH-1 se inhibe en las células de destrucción de CDK2 y también en la diferenciación de macrófagos de células madre pluripotentes inducidas con destrucción de CDK2 , lo que sugiere además que la CDK2 es importante para la transcripción y replicación del VIH-1. El vínculo funcional entre CDK2 y CDK9 se encontró cuando analizamos la inhibición del VIH-1 por quelantes de hierro. La transcripción del VIH-1 se inhibió en células T tratadas con quelantes de hierro 311 e ICL670, que también inhibieron la actividad celular de CDK2 y CDK9 . Los quelantes de hierro tridentados a base de tiosemicarbazona y di-2-piridilcetona más potentes inhibieron la transcripción del VIH-1 y la replicación del virus a concentraciones mucho más bajas que 311 o ILC670 y también inhibieron la actividad de CDK2 y CDK9 . Si bien el mecanismo de inhibición de CDK2 aún no está clarificado, es probable que incluya la inducción de p21 a través de la regulación ascendente del factor 1 inducido por hipoxia (HIF-1), ya que la depleción de hierro elimina el hierro de la prolil hidroxilasa y aumenta los niveles de proteínas HIF-1 e HIF-2 imitando el efecto de la hipoxia . Analizamos la fosforilación de CDK9 por CDK2 in vitro e identificamos un motivo (90SPYNR94) que representaba un sitio de fosforilación de CDK2 consensuado y que fue fosforilado de manera eficiente . La fosforilación de CDK9 en el Ser-90 se detectó con anticuerpos fosfoespecíficos y se redujo después de la caída de CDK2. Se redujo la asociación de mutantes CDK9 S90A con el gran complejo P-TEFb y su sobreexpresión inhibió la transcripción del VIH-1. En contraste, el mutante CDK9 S90D mostró asociación inalterada con complejos P-TEFb grandes y pequeños y transcripción inducida del VIH-1 dependiente de Tat. Sin embargo, el fosfomimético S90 mostró una disminución general en la expresión de CDK9, lo que sugiere que se debe mantener un equilibrio fosforilación/desfosforilación para formar complejos P-TEFb grandes y pequeños. El modelado molecular mostró que el Ser-90 de CDK9 estaba ubicado en un bucle flexible expuesto al disolvente, lo que sugiere que podría estar experimentando fosforilación (también se ve en la Figura 2). Por lo tanto, nuestros estudios recientes identificaron un nuevo sitio de fosforilación reguladora en CDK9 que puede estar dirigido a la activación o inhibición de la transcripción del VIH-1.
5. Conclusión
La fosforilación y desfosforilación de sitios específicos en CDK9 ocurre a lo largo del proceso de transcripción y debe controlarse estrictamente. Las modificaciones en ciertos residuos de treonina/serina determinan si CDK9 se asocia con complejos grandes de P-TEFb para estar disponibles para el reclutamiento y si la disociación del complejo grande ocurrirá de manera eficiente. La fosforilación de Thr-186 en el bucle T de CDK9 y Ser-90 que se encuentra fuera del bucle T determina si CDK9 permanece secuestrado en el complejo inactivo grande y también si la quinasa es enzimáticamente activa una vez que se disocia de 7SK snRNP. La desfosforilación en cualquiera de estos sitios conduce a la desestabilización del complejo grande y a la liberación de CDK9/Ciclina T1, restringiendo así el reclutamiento de Tat a la LTR del VIH-1. Las modificaciones en el C-terminal del CDK9 permiten la unión de ciclina T1: el alquitrán y la desfosforilación en estos sitios impiden la unión del ARN toTAR. En contraste, la fosforilación en los residuos de Thr-29 o Ser-175 inhibe la CDK9. Por lo tanto, la imagen emergente de la regulación de CDK9 a través de la fosforilación parece ser compleja y en parte paralela a lo que se conoce para otros CDK. Las quinasas, CDK7, CDK2 y fosfatasas, PP1 y PPM1A dirigidas a CDK9, recientemente identificadas, probablemente surgirán como objetivos novedosos para la terapia contra el VIH-1 y el cáncer.
Conflicto de Intereses
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este documento.
Agradecimientos
Este proyecto fue apoyado por el Centro de Desarrollo para la Investigación del SIDA del Distrito de Columbia (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 del Programa de Centros de Investigación en Instituciones Minoritarias (RCMI) (División de Infraestructura de Investigación, Centro Nacional de Recursos de Investigación, NIH), la Fundación Rusa para la Investigación Básica (no. 12-04-91444-NIZ) y el Ministerio de Educación y Ciencia de Rusia (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). Los autores también desean agradecer a los miembros del laboratorio Nekhai sus sugerencias y disculparse por aquellos cuyo trabajo no fue citado debido a la falta de espacio.
