Cuando se trata de solubilizar y desnaturalizar proteínas antes del enfoque isoeléctrico y la electroforesis en gel 2-D, la mayoría de los investigadores eligen la urea. Esto no es sorprendente, ya que este suave agente caotrópico puede interrumpir completamente las interacciones entre las moléculas de proteínas y aumentar la eficiencia de la actividad de la proteasa en la digestión de proteínas, al tiempo que evita eficazmente que las proteínas se agreguen y/o precipiten. Además, la urea también se utiliza para renaturalizar proteínas de muestras desnaturalizadas previamente.

A pesar de su popularidad como desnaturalizador de proteínas efectivo, el uso de solución de urea en la digestión de proteínas conlleva un desafío particular: aumenta el riesgo de carbamilación. ¿Por qué debería preocuparle esto? Aquí hay algunas razones por las que la carbamilación puede ser perjudicial para su experimento y por qué debe evitarse a toda costa.

1. Además de bloquear los extremos N-terminales de las moléculas de proteínas, la carbamilación interfiere con la caracterización de proteínas y hace que no estén disponibles para su uso posterior.
2. Ataca agresivamente las cadenas laterales de residuos de arginina y lisina y hace que la proteína no sea adecuada para digestiones enzimáticas.
3. Dificulta la digestión enzimática de proteínas y afecta negativamente a la identificación y cuantificación de proteínas en el análisis de EM.
4. Confunde los resultados obtenidos a partir de péptidos con tiempos de retención inesperados y aumenta la complejidad de la muestra.
5. Reduce la eficiencia de ionización y afecta negativamente la intensidad de la señal de los picos detectados.
6. Induce un cambio en el punto isoeléctrico de las proteínas y conduce a resultados artificiales.
7. Puede afectar a los resultados de los estudios de carbamilación in vivo.

¿Qué causa la Carbamilación?

Por definición, la carbamilación se refiere a la modificación postraduccional que altera las propiedades estructurales y funcionales de las proteínas. Esto es provocado por la reacción no enzimática entre el ácido isociánico y los grupos amino libres.

En soluciones acuosas, la urea existe en equilibrio con cianato de amonio. Es importante tener en cuenta que (1) la urea en solución se disocia espontáneamente produciendo cianato e iones de amonio, (2) se degrada a ácido isociánico (CNOH), la forma que reacciona activamente con los grupos amino proteicos e induce la carbamilación, y (3) la velocidad a la que la urea se disocia y el grado de carbamilación depende de la temperatura, el pH y el tiempo de incubación.

Prevención de la carbamilación: Algunos Consejos útiles para Considerar

Nada puede cambiar el hecho de que la urea en presencia de calor y proteínas siempre conducirá a la carbamilación. Puede usar la urea de mayor grado disponible y aun así correr el riesgo de carbamilación.

Afortunadamente, hay varias maneras de proteger los péptidos de la carbamilación. Aquí hay algunas estrategias efectivas que se pueden usar para lograr este objetivo.

• Utilice siempre reactivos a base de urea recién preparados al realizar procedimientos proteómicos. Utilice tampones pre-mezclados y listos para usar a base de urea seca de alta calidad de fuentes creíbles y tenga mucho cuidado al preparar sus muestras. Nota: Almacene el material sólido a temperatura ambiente y reduzca al mínimo la manipulación.
• Eliminar la urea de la muestra de proteína antes de la digestión mediante diálisis y/o cromatografía de fase inversa rápida o mediante columnas de centrifugado.
• Mantener la muestra a una temperatura relativamente baja para disminuir la velocidad a la que la urea se descompone. Evite calentar tampones que contengan urea por encima de 37oC para reducir el riesgo de carbamilación.
• Desionizar la solución de urea utilizando una resina de intercambio iónico para reducir la concentración de cianato.Solución de urea acidificada (HCl de 100 mm) para dificultar la formación de ácido isociánico.
• Use reactivos como etanolamina, etilendiamina, metilamina y Tris-HCl para minimizar la carbamilación de proteínas/péptidos. Estos reactivos ayudan al eliminar las moléculas de cianato, lo que las hace inaccesibles para los péptidos.

Es cierto que estas estrategias tienen sus propias desventajas (p.ej., requieren un tiempo de manipulación prolongado, inducen la precipitación de proteínas fácilmente desnaturalizadas y pueden no ser adecuadas para numerosas técnicas de digestión enzimática), pero dado que los digestiones enzimáticos se realizan a temperaturas elevadas durante un largo período de tiempo, no tiene otra opción que eliminar la urea de la mezcla digerida. De lo contrario, siempre correrás el riesgo de carbamilación. Es un riesgo que no querrías correr.