: Descubrimiento de Inhibidores de Canales de sodio dependientes de voltaje
Como una forma de ilustrar los problemas relacionados con el descubrimiento de fármacos de canales iónicos descritos anteriormente, el resto de este artículo describirá un estudio de caso centrado en la identificación de inhibidores de canales de sodio dependientes de voltaje para tratar el dolor neuropático crónico. El tratamiento del dolor es un problema médico grave y hay un gran esfuerzo en la industria farmacéutica para desarrollar nuevas terapias para esta afección. En particular, el tratamiento del dolor neuropático, definido como «dolor crónico que resulta de una lesión primaria o disfunción del sistema nervioso periférico» por la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP), sigue siendo una necesidad médica importante no satisfecha.
Está claro que los canales de sodio dependientes de voltaje (Nav1) juegan un papel clave en el origen y la propagación de los potenciales de acción de los nervios sensoriales necesarios para la señalización del dolor. Las aplicaciones locales de bloqueadores de canales de sodio no selectivos de subtipo, como la novocaína, proporcionan un alivio completo del dolor a través del bloqueo de conducción. Sin embargo, este enfoque para el alivio del dolor se limita a muy pocas aplicaciones, como los procedimientos dentales, ya que los canales de sodio también son vitales para la conducción en el corazón, el SNC, el músculo esquelético y las neuronas sensoriales no hematopoyéticas. La super familia Nav1 está compuesta por 10 miembros (Yu y Catterall, 2004). Siete de estos subtipos, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, y Nav1.9, están presentes en el sistema nervioso periférico (SNP). De estos, Nav1.7, Nav1.8 y Nav1.9 se expresan predominantemente en neuronas nociceptivas y Nav1.3 es predominantemente embrionaria, pero se regula al alza en el SNP adulto después de una lesión. Este patrón de expresión limitada hace que estos subtipos sean blancos atractivos para el desarrollo de nuevos analgésicos. Sin embargo, su contribución relativa a la señalización del dolor, y específicamente a la señalización del dolor neuropático, no está clara y puede variar con diferentes etiologías y cualidades sensoriales del dolor.
En ausencia de selectividad molecular para un subtipo Nav1, es posible apuntar específicamente a los canales Nav1 en un estado conformacional dado mientras se preserva la conducción de impulsos dependiente del canal de sodio. Este tipo de inhibición dependiente del estado es la base de la ventana terapéutica observada con anticonvulsivos y antiarrítmicos bloqueadores del canal de sodio, como lamotrigina y lidocaína. Estos fármacos tienen mayor afinidad por los canales en los estados abiertos y/o inactivados que por los canales cerrados en reposo. Este mecanismo de inhibición favorece la unión en tejidos de cocción rápida o parcialmente despolarizados. El dolor neuropático debe ser sensible a este mecanismo inhibitorio, ya que se cree que surge de áreas de despolarizaciones inducidas por lesiones, hipótesis que se apoya en la eficacia clínica de la lidocaína administrada sistémicamente en dosis subanestésicas. Además, el bloqueo no selectivo de subtipos y dependiente del estado puede ofrecer la mayor eficacia, ya que el nocaut individual de Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 o Nav1.9 no proporcionó evidencia convincente de un papel dominante de ninguno de estos canales en la señalización del dolor neuropático.
En base a esta lógica, se tomó la decisión de perseguir inicialmente inhibidores de Nav1 no selectivos de subtipo y dependientes del estado, mientras se monitorizaba la selectividad molecular mediante la prueba de compuestos de interés en Nav1.7, Nav1.5 (el canal primario de sodio cardíaco) y Nav1.8 en paralelo.
Se utilizó un ensayo basado en el potencial de membrana para detectar compounds 200,000 compuestos en Nav1.8 expresados de forma estable en una línea celular recombinante. Este ensayo de HTS se basó en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre dos miembros de un par de colorantes sensibles al potencial de membrana desarrollado por Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Los canales Nav1.8 se preincubaron con el compuesto de prueba y el agonista químico deltametrina en ausencia de sodio extracelular. La adición posterior de sodio dio lugar a la despolarización de la membrana y el bloqueo Nav1 se cuantificó como interferencia con ese proceso de despolarización celular.
Aunque la pantalla inicial en Nav1.8 produjo una variedad de impactos, solo un compuesto se consideró una ventaja viable para los esfuerzos de química medicinal. Antes de comprometer recursos para este plomo, el compuesto, una succinimida disustituida denominada succinimida BPBTS (N-{ metil }-N’-(2,2′-bithien-5-il metil), se examinó en detalle mediante una abrazadera manual de voltaje de celda completa. Se encontró que los BPBTS inhibían todos los subtipos Nav1 con potencia similar, y la inhibición dependía del potencial de membrana y la frecuencia de estimulación. Este mecanismo inhibitorio fue consistente con una mayor afinidad del compuesto por canales en el estado abierto e inactivado, en comparación con los canales en el estado de reposo. Además, los BPBT fueron dos órdenes de magnitud más potentes que los anticonvulsivos y antiarrítmicos bloqueadores Nav1 utilizados clínicamente, inhibiendo el estado inactivado de Nav1, 8, Nav1, 7, Nav1, 5 y Nav1, 2, con valores de Ki de 0,09, 0,15, 0,08 y 0,14 µM y el estado de reposo con valores de Kr de 1,5, 1,3, 0,3 y 1,2 µM, respectivamente (Priest et al., 2004).
Como tal, el BPBTS era una ventaja atractiva para la química medicinal; sus principales responsabilidades son un perfil farmacocinético deficiente. A lo largo de la elaboración de perfiles análogos de BPBT, así como de inhibidores Nav1 publicados, utilizando el ensayo de cribado fluorescente basado en el potencial de membrana, se observaron discrepancias basadas en la estructura entre potencias determinadas en el ensayo fluorescente y por electrofisiología para algunos compuestos. Estas discrepancias se rastrearon a una interacción entre estos compuestos y el agonista veratridina utilizado para abrir los canales Nav1.7. Posteriormente, se modificó el ensayo fluorescente de manera que los canales Nav1 se preincubaron con compuesto de prueba en concentraciones fisiológicas de sodio extracelular y se inició la despolarización dependiente de Nav1 mediante adición de agonistas (Fig. 1). Las potencias inhibidoras de canales medidas en este ensayo modificado se correlacionaron muy bien con la inhibición del estado inactivado determinada por electrofisiología en muchas clases estructurales de inhibidores Nav1 (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).
Un ensayo funcional basado en el potencial de membrana para canales Nav1. 7. En ausencia de otras conductancias iónicas que puedan hiperpolarizar la célula, la expresión heteróloga de los canales Nav1.7 proporciona un sistema donde en el potencial de membrana en reposo de la célula la mayoría de los canales residirán en el estado inactivado no conductor. La eliminación de la inactivación rápida mediante la adición de veratridina cambia el equilibrio del canal al estado abierto conductivo que permite la entrada de sodio que conduce a la despolarización celular. Los cambios de voltaje se pueden monitorear con un par de tintes detectores de voltaje de TRASTE, cumarina y oxonol. La despolarización celular altera la distribución del oxonol a través de la membrana, causando un cambio en la señal del TRASTE. En presencia de un inhibidor Nav1.7, el equilibrio del canal cambia hacia la conformación inactivada unida al fármaco, reduciendo el número de canales que estarán disponibles para la modificación de la veratridina y previniendo la señal de TRASTE inducida por agonistas. La curva dosis–respuesta para el cambio inducido por la veratridina en la señal del TRASTE es pronunciada, lo que sugiere que la modificación de un pequeño número de canales Nav1, 7 es suficiente para causar la despolarización celular.
Aunque los análogos de los BPBT no superaron la potencia inicial, la química medicinal logró mejorar el perfil farmacocinético, generando finalmente trans-N-{metil }-N-metil-N’-ciclopentano-1,2-dicarboxamida (CDA54) con una biodisponibilidad oral del 44%, una semivida de una hora y una tasa de aclaramiento de 14 ml/min / kg, que se perfiló ampliamente in vivo (Brochu et al., 2006). En dos modelos de dolor neuropático en ratas, el CDA54 (10 mg/kg, administrado por vía oral) redujo significativamente la hipersensibilidad conductual inducida por lesiones nerviosas en un 44-67%. La misma dosis / concentración plasmática de CDA54 no afectó la nocicepción aguda (ensayo de placa caliente de rata), la coordinación motora (ensayo de rotorod de rata) ni la conducción cardíaca (parámetros electrofisiológicos medidos en el perro cardiovascular). Estas propiedades contrastan con las de los actuales bloqueadores de los canales de sodio utilizados en la clínica, que causan problemas de coordinación motora en ratas y efectos secundarios en el SNC en el hombre a todas las dosis eficaces. Curiosamente, tras la administración oral, la relación cerebro-plasma para CDA54 fue de 0,03. En contraste, los bloqueadores Nav1 usados clínicamente se acumulan en el SNC, con una relación cerebro-plasma mayor de 10 para la mexiletina. Estos datos obtenidos con CDA54 sugieren claramente que la inhibición de los canales de sodio del SNP por sí sola es eficaz en modelos animales de dolor neuropático, y que limitar las exposiciones a los inhibidores de Nav1 en el SNC es un enfoque viable para desarrollar inhibidores de Nav1 con un índice terapéutico mejorado.
Una campaña de UHTS, utilizando el ensayo basado en el potencial de membrana descrito para detectar inhibidores de Nav1.7, descubrió los nuevos inhibidores de canal 1–benzazepina-2-un (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Esta clase de inhibidores demostró una relación estructura–actividad definida y, cuando se evaluó in vivo, los miembros de esta serie fueron eficaces por vía oral en modelos de dolor neuropático y epilepsia en roedores. Es importante destacar que algunos miembros de esta clase mostraron selectividad molecular para los canales Nav1.7 (Williams et al., 2007). Por ejemplo, el compuesto 2 de la Fig. 2 era altamente dependiente del estado y selective 10 veces selectivo para Nav1.7 sobre Nav1.8 y Nav1.5. El miembro más potente, aunque no selectivo de subtipos, de esta clase de inhibidores Nav1.7 (compuesto 1, BNZA; Fig. 2) fue tritiada. BNZA se une con alta afinidad (Kd de 1,6 nM) a los canales Nav1, 7 recombinantes. Esta es la primera demostración de unión de ligandos de alta afinidad a Nav1.7 y proporciona una valiosa herramienta de detección con la que buscar compuestos selectivos de Nav1.7. Los datos obtenidos con la serie estructural de 1-benzazepina-2-uno sugieren que Nav1.7-se pueden identificar análogos selectivos, y con las propiedades farmacocinéticas y metabólicas apropiadas, tales compuestos podrían desarrollarse como analgésicos, mostrando potencialmente una mejor tolerabilidad sobre los medicamentos existentes utilizados para tratar el dolor neuropático. El apoyo a la viabilidad de desarrollar inhibidores selectivos de los canales de sodio subtipos como nuevos analgésicos proviene del reciente informe de un agente selectivo Nav1.8 de alta afinidad, que administrado por vía intraperitoneal fue eficaz en una amplia gama de modelos de dolor en roedores (Jarvis et al., 2007).
1-Benzazepin-2-uno Nav1 inhibidores. Las estructuras de dos inhibidores Nav1 de 1-benzazepina-2-uno se ilustran junto con sus potencias para los canales hNav1.5, hNav1.7 y hNav1.8, según lo determinado en los ensayos basados en TRASTE de potencial de membrana funcional. También se presentan las potencias estimadas de estos compuestos para el estado inactivado de los canales hNav1.5 y hNav1.7, determinadas a partir de registros electrofisiológicos. Tenga en cuenta que solo el compuesto 2 muestra selectividad para el canal hNav1.7. Ambos compuestos son inhibidores más débiles del canal hNav1.8.
Un posible enfoque alternativo para buscar inhibidores de canales de sodio selectivos de subtipos sería detectar compuestos que se dirigen a los mecanismos de apertura de canales. Se ha demostrado previamente que varios péptidos modifican la apertura de los canales de sodio, pero se han descrito pocas moléculas pequeñas, especialmente inhibidores, que funcionan de esta manera. Uno de estos agentes es ProTx-II, un péptido de 30 aminoácidos purificado a partir de veneno de tarántula; este péptido bloquea los canales de sodio y muestra selectividad para Nav1. 7 (Smith et al., 2007). ProTx-II se une al estado de reposo de los canales de sodio y cambia la dependencia de voltaje de la activación del canal a potenciales más despolarizados. Las despolarizaciones fuertes superan la inhibición del canal, que es un sello distintivo de este tipo de péptido modificador de compuerta. Una estrategia posible para identificar miméticos de moléculas pequeñas de un péptido modificador de compuerta es radiomarcar ProTx-II en forma biológicamente activa, y desarrollar un ensayo de unión con canales Nav1. 7 expresados heterológicamente en una línea celular. La detección de moléculas pequeñas que modulan la unión a ProTx-II podría revelar nuevas clases de inhibidores de canales que se dividen en la membrana e interfieren con el movimiento de la paleta de compuerta, evitando así la apertura del canal. Una ventaja adicional de este tipo de UHTS es que se podrían emplear altas concentraciones de compuestos de prueba, una situación que se excluye en el cribado a base de colorantes debido a la interferencia de fluorescencia que generalmente ocurre con altas concentraciones de muchas moléculas orgánicas pequeñas. Dado que algunos péptidos modificadores de compuerta se unen a regiones que son exclusivas de canales específicos dentro de una superfamilia, los inhibidores selectivos de subtipos podrían identificarse utilizando dicha estrategia.
