Discusión
En el presente estudio, se buscó evaluar si la EC de ratones podría tener una tasa de fracaso que se tradujera en un problema de bienestar animal. Usamos el tiempo de parada respiratoria como nuestro marcador sustituto para el criterio de AVMA de «tiempo requerido para inducir la pérdida de conciencia».»1 Reconocimos que la ruptura limpia de la columna vertebral cervical alta por encima de C2 podría inducir un paro respiratorio sin inconsciencia, pero el trauma macroscópico de los diversos métodos de EC parecía poco probable que resultara en este resultado.
Establecimos un tiempo de parada respiratoria igual a 0 s como punto de corte para definir la eutanasia exitosa. Creemos que cualquier método de eutanasia después del cual los ratones puedan continuar respirando (independientemente de cuánto tiempo) requiere precaución. Si se realiza en ratones no anestesiados, la eutanasia incompleta deja a un ratón potencialmente consciente experimentando una lesión traumática grave hasta que el operador pueda repetir el procedimiento o cambiar a otro método de eutanasia. La ruptura completa del SNC medio torácico puede dejar el analgésico corporal caudal, pero el tejido lesionado que rodea y craneal a la lesión aún puede ser doloroso.17,25 Animales que tienen suficiente inervación motora para continuar la respiración probablemente tendrían suficiente inervación aferente para que ocurriera dolor.
En nuestro trabajo piloto, algunos ratones continuaron respirando hasta 15 minutos antes de practicarles la eutanasia con pentobarbital sódico; es probable que estos ratones hubieran continuado respirando incluso más tiempo. Si hubieran sido retirados de la anestesia y recobrado el conocimiento, con múltiples lesiones en la columna vertebral, su sufrimiento podría haber sido grave. Incluso como complemento de los agentes de eutanasia inhalantes o inyectables, si un ratón se recuperara (posiblemente dentro de un congelador de cadáveres) de una técnica de dislocación mal realizada, el potencial de dolor o angustia se agravaría. Es esencial que cualquier método de EC cumpla con el requisito de que esencialmente el 100% de los animales dejen de respirar de forma permanente de inmediato.
Nuestro porcentaje de fracaso del 21% para los métodos de EC, basado en el tiempo hasta la parada respiratoria, fue similar al porcentaje de fracaso en los informes de ratones que se sometieron a EC pero carecían de lesiones de la columna cervical radiográficamente evidentes.7,14 Los autores de esos estudios anteriores7, 14 no detallan sus métodos radiográficos. Debido a que no se notificaron eventos de eutanasia fracasada7,14,los autores pueden haber malinterpretado ratones que tenían lesiones cervicales y torácicas, pero distracción insuficiente durante la radiografía, ya que solo tenían lesiones torácicas.
A la luz de los hallazgos anteriores7,14,postulamos que una tensión suficientemente fuerte aplicada en cualquier parte de la médula espinal podría inducir inconsciencia y parada respiratoria, incluso cuando el trauma esquelético fuera caudal a la región cervicouterina alta recomendada. Nuestra tasa de fracaso del 100% para el grupo de dislocación torácica no apoya esta hipótesis. Utilizamos la dislocación torácica en ratones anestesiados para modelar la técnica incorrecta que un operador mal entrenado podría realizar, y hemos verificado que la técnica correcta es necesaria para la eutanasia exitosa de ratones.
Las directrices de la AVMA han tratado la EC en general, sin una descripción específica del procedimiento, lo que refleja una escasez de evaluaciones comparativas de diferentes técnicas de EC. Varias publicaciones describen técnicas variadas para realizar la dislocación cervical.8,13,14,16,22 Otros, incluyendo la AVMA Panel de informes, no distinguir entre diversos CD técnicas.3,10,12,24 Además de los 3 métodos que elegimos, los autores han especificado que la ECM debe realizarse tirando hacia arriba en un ángulo de 30°, con la esperanza de que el proceso odontoide de la vértebra C2 dañe la médula espinal y, por lo tanto, aumente la eficacia de la técnica.7 Es poco probable que la fractura de este pequeño proceso óseo en un ratón sea visible radiográficamente. Además, algunos operadores describen tirones hasta que se siente que el cráneo está completamente suelto a la columna vertebral, y este es el método que enseñamos en nuestra institución. Esta práctica es razonable cuando se usa EC después de otras técnicas de eutanasia (por ejemplo, sobredosis de anestésico), pero este procedimiento más largo y lento puede causar dolor adicional en un animal que aún no está inconsciente.
La radiografía postmortem podría desempeñar un papel en la evaluación del éxito de la eutanasia después del evento, pero esta técnica es intensiva en mano de obra y debe interpretarse con cautela. Nos preocupaba que, sin suficiente distracción, los ligamentos intactos pudieran mantener el cráneo lo suficientemente cerca de la columna vertebral para enmascarar la luxación exitosa en algunos casos. Encontramos las radiografías postmortem más fáciles de interpretar cuando se aplicó tensión para estirar la carcasa, pero al hacerlo, se creó un espacio sospechoso entre los cuerpos vertebrales C2 y C3 que requirió una evaluación cuidadosa. Los controles negativos de solo CO2 (Figura 2) fueron útiles para distinguir las lesiones de las normales. Cuando establecimos el tiempo de parada respiratoria como nuestro «estándar de oro», la radiografía cervical tuvo un valor predictivo positivo de solo el 71%. Por lo tanto, cuando la radiografía se utiliza como una herramienta de control de calidad o evaluación de habilidades, se perderán algunos casos de eutanasia fallida.
Mientras que todas las eutanasias fallidas tenían lesiones torácicas o lumbares (o ambas), también lo hicieron 50 de las 64 eutanasias exitosas. Concluimos que la presencia de lesiones torácicas o lumbares no es un diagnóstico de mala técnica. Además, ninguno de los 11 animales de EC que fueron a la variable 180-s presentaba lesiones cervicales observables. En contraste, 63 de 64 casos exitosos de EC lo hicieron, y el ratón que carecía de una lesión cervical observable (Figura 3) podría reflejar un diagnóstico erróneo de una lesión sutil o servir como evidencia de que un trauma distal de la médula espinal suficientemente severo puede causar un paro respiratorio; de hecho, 2 ratones en el grupo de dislocación torácica lograron finalmente un paro respiratorio antes de que se pudiera aplicar otra técnica. Además, 6 ratones con EC se sometieron a eutanasia sin éxito, pero murieron antes de la variable 180-s, a pesar de que la radiografía reveló lesiones cervicales en 5 de estos ratones. El diagnóstico erróneo radiográfico es posible, al igual que la posibilidad de que las lesiones intermedias, aunque evidentes radiográficamente, puedan ser mortales en última instancia, pero sean demasiado prolongadas para calificar el resultado como una «buena muerte».»
Reconocemos algunas limitaciones de nuestro estudio. No realizamos todas las variaciones descritas o posibles de EC en ratones. No intentamos usar ondas cerebrales u otras mediciones para analizar la función cerebral intacta después de la dislocación. No eliminamos a los animales que respiraban de la máscara de anestesia para evaluar el potencial de retorno a la conciencia. La presencia de un tiempo de parada respiratoria superior a 0 s sugiere al menos una función cerebral intacta mínima, un estado que parece inconsistente con una «buena muerte»; no presentamos datos sobre la calidad de la muerte cuando el tiempo de parada respiratoria es de 0 s.
El efecto de operador que observamos requiere una exploración adicional. Con solo 2 operadores, el efecto no se podía atribuir a diferencias en la edad, el entrenamiento, la fuerza o cualquier otro factor del operador. Muy posiblemente, otros operadores diferirían en sus tasas de éxito. El estudio de seguimiento para examinar más a fondo el efecto del operador debe tener en cuenta el conocimiento de varios operadores de que se les estaba calificando y el efecto que este conocimiento podría tener en su rendimiento. El hecho de que el operador más exitoso todavía no haya tenido éxito en el 8,1% de los casos es motivo de preocupación.
Además, el diagnóstico radiográfico podría estar sujeto a un efecto intérprete. Sin un «estándar de oro» para un diagnóstico radiográfico correcto (por ejemplo, la ausencia de una lesión visible en una eutanasia exitosa podría significar que la fractura espinal o la luxación en ese sitio no son necesarias para una muerte rápida, o que el radiógrafo no detectó la lesión), no podríamos explorar la posibilidad de un efecto intérprete. El trabajo piloto con radiografías de película simple reveló un modesto desacuerdo en el diagnóstico entre varios veterinarios que leyeron las radiografías.
Finalmente, todos los ratones fueron dislocados bajo anestesia con isoflurano por razones humanitarias, porque sabíamos que mantendríamos vivos y respirando los casos fallidos durante varios minutos en lugar de repetir el procedimiento inmediatamente. Debido a que el anestésico abolió el tono muscular, este método puede modelar la EC postmortem mejor que la EC como el único método de eutanasia. Debido a que es un depresor respiratorio, el isoflurano puede haber acelerado el paro respiratorio en algunos casos intermedios. Como agente neuroprotector, el isoflurano puede haber retrasado la muerte. De cualquier manera, el uso de isoflurano nos impidió evaluar la conciencia potencial en los casos fallidos de respiración inmóvil, porque nunca los destetamos del anestésico para hacer esa evaluación.
Concluimos que 3 métodos de EC pueden resultar en eutanasia fallida en la que los ratones continúan respirando después del intento de dislocación. No podemos afirmar si la conciencia o la percepción del dolor acompañan este resultado. La práctica en ratones anestesiados podría ser un método de entrenamiento útil, con el tiempo hasta la parada respiratoria establecido como la medida del éxito del aprendiz. La radiografía es una herramienta de evaluación de habilidades que requiere mucha mano de obra y que parece no ser más informativa que la observación de la práctica en ratones anestesiados. Si estudios adicionales replican nuestros hallazgos, las prácticas recomendadas tendrán que cambiar, ya sea para rechazar la EC de ratones no anestesiados, identificar un método de EC con una tasa de éxito más alta, o enfatizar que los ratones deben ser vigilados de cerca después de la EC, y si aún respiran (lo que puede ser difícil de determinar dada la descarga motora que a menudo sigue a la EC), inmediatamente tratados a través del mismo método de eutanasia o un método alternativo.
