Resultados y Discusión

Las HANC Se Originan en la Epidermis de la Cabeza y Requieren la Función del Gen lb. Estudios previos (5, 11, 17, 19) han descrito el papel de los genes lb en los procesos de especificación del destino celular. En Drosophila, los experimentos de ganancia y pérdida de función han revelado que los genes lb especifican la identidad de un subconjunto de células cardíacas y musculares y que esta función resulta de la expresión mesodérmica altamente restringida, específica del linaje de lb. Además, el análisis preciso del lbe (Fig. 1) y el patrón de expresión de lbl (datos no mostrados) al inicio de la fusión cardíaca reveló un grupo triangular de células lb positivas situadas justo antes de la punta del corazón (Fig. 1 A, punta de flecha). Para producir una descripción más precisa de la posición de estas células con respecto a los ganglios linfáticos y las glándulas anulares asociados al corazón, se etiquetaron dos veces los embriones para lb y marcadores específicos de glándulas (Fig. 1 B y C). Los precursores de las glándulas linfáticas revelados con anticuerpos anti-Serpiente flanquean a ambos lados de la punta del corazón (Fig. 1B) pero no se superpongan con el área marcada por lb. De manera similar, la doble tinción de la línea trampa del potenciador l(2)1857, que expresa específicamente LacZ en los primordios embrionarios de la glándula anular (15), demuestra que las células lb positivas están situadas inmediatamente delante de la glándula anular (Fig. 1C).

Para determinar el origen de las células lb positivas asociadas al corazón, se siguió la expresión de lb en la parte anterior de los embriones desde la etapa inicial en adelante. En las etapas embrionarias que preceden a la fusión cardíaca, no pudimos detectar la expresión de lb asociada con la parte anterior de dos primordios cardíacos. Este hallazgo sugirió que las células lb positivas no están especificadas originalmente en el área cardíaca y pueden representar células de origen diferente que se asocian con las células cardíacas en etapas posteriores. De hecho, al final de la etapa 11, un grupo de células lb positivas en la epidermis de la cabeza dorsal (Fig. 2A) puede detectarse. Estas células comienzan a invaginar un poco más tarde y forman la parte principal de la epidermis doblada (Fig. 2B). La posición y el momento de esta invaginación se asemejan a un plegamiento de la epidermis de la cabeza, dando lugar a la parte posterior de la bolsa dorsal llamada saco frontal (20). Para comprobar si las células que expresan lb corresponden a la punta del saco frontal, utilizamos la línea N516 de escargot-LacZ que expresa LacZ en células que forman bolsas dorsales (20). Tintes dobles de la etapa 14 (Fig. 2B) y el estadio 16 (Fig. 2C) N516 embriones que utilizan anticuerpos anti-Lbe y anti-β-galactosidasa demuestran claramente que lb y esg están coexpresados en la punta del saco frontal invaginante. Vista dorsal de la región de la cabeza embrionaria (Fig. 2D) confirma que estas células muestran la misma disposición triangular que las células lb positivas asociadas al corazón mostradas anteriormente (compare las Figs. 2D y 1).

Tomados en conjunto, estos datos indican que las células que expresan lb y que se encuentran inmediatamente delante del corazón se originan en la epidermis de la cabeza y migran hacia la punta del corazón durante la invaginación del saco frontal. Esta observación plantea una pregunta adicional con respecto al papel de los genes lb en la especificación de este grupo de células. Hemos demostrado previamente que los genes lb desempeñan un papel importante en la especificación de un subconjunto de precursores cardíacos y musculares (11, 19). El análisis funcional del gen Lbx1 del ortólogo lb de ratón (21, 22) también ha revelado su implicación en el control de la especificación y la migración dirigida de precursores del músculo apendicular. Además, los datos más recientes indican que Lbx1 en ratones especifica una subpoblación de células de la cresta neural cardíaca necesarias para el desarrollo normal del corazón (23).

Para probar si la Drosophila lb es necesaria para la especificación de células asociadas al corazón, hemos analizado la formación de bolsas dorsales en embriones deficientes para ambos genes lb (ver Materiales y Métodos). Usando la sonda de ARN esg como marcador, demostramos que en los embriones de icdd la expresión esg en la parte distal del saco frontal que contiene las células asociadas al corazón está ausente (comparar Fig. 2 E y G con F y H). Además, como se muestra en las vistas dorsolaterales de embriones en estadio 14 (Fig. 2 G y H), la distancia entre el saco vitelino y las células esg positivas más distales se agranda significativamente en embriones con deficiencia de lb. Este hallazgo, apoyado por la observación de la óptica de Nomarski que revela que la parte posterior del saco frontal ha alterado la morfología (datos no mostrados), indicó que los HANC no están especificados o no migran correctamente en embriones lbdef. Debido a que la deficiencia analizada también cubre los genes bap y C15 adyacentes, probamos la formación del saco frontal en embriones mutantes de bap y en embriones Arm-GAL4>UAS-RNAiC15. En embriones bap208 y RNAiC15, el saco frontal teñido con esg tenía una forma normal (no se muestran datos), por lo que se excluye la influencia de los genes bap y C15 en la diferenciación o migración de células asociadas al corazón. Estos datos sugieren fuertemente que el patrón anormal de células del saco frontal esg positivas distales en embriones lbdef resulta de la pérdida de la función lb.

Componentes Mesodérmicos y No Mesodérmicos Involucrados en el Patrón de la Región de Salida Cardíaca. Nuestros experimentos de inmunotinción mostraron que las células lb positivas que anclan el corazón se encuentran muy cerca de los cardioblastos que expresan lb (Fig. 1). Debido a que los cardioblastos más anteriores expresan tin (5), realizamos doble marcación de embriones con anticuerpos anti-Tin y anti-Lbe para visualizar las posiciones respectivas de la punta del corazón y la parte más distal del saco frontal. Sorprendentemente, estas dos estructuras se superponen en aproximadamente tres longitudes de célula cuando se observan desde el lado dorsal (Fig. 3A). Además, la vista confocal lateral de la región anterior del corazón (Fig. 3B) muestra claramente que la punta del saco frontal, que consiste en células no mesodérmicas que expresan lb, está directamente unida al corazón. Más precisamente, observamos que la parte anterior de la aorta (parcialmente superpuesta a las células lb asociadas al corazón) se dobla ventralmente, formando un área morfológicamente distinta que corresponde a la región del flujo de salida cardíaco. Esta morfología sugiere que podría haber un componente celular adicional que favorezca la flexión ventral del corazón. Decidimos buscar la presencia de un músculo ventral unido a la punta de la aorta. La vista lateral del embrión, de doble tinción para cadena pesada de miosina (Myo) y Lbe (Fig. 3C), muestra claramente que el flujo de salida del corazón está unido a un músculo de la cabeza, que proponemos llamar COM. Un análisis más preciso de las secciones confocales reveló que el primordio cardíaco está, de hecho, unido por dos COM que se extienden desde el esófago y se adhieren a ambos lados de la región de salida cardíaca (puntas de flecha abiertas en la Fig. 3D). Sorprendentemente, estos músculos de la cabeza embrionaria no se han descrito previamente hasta donde sabemos. La falta de documentación publicada para las COM se debe probablemente a que la morfología y el origen de los músculos somáticos de la cabeza en el embrión de Drosophila no se han analizado sistemáticamente. Usando la única descripción disponible de la musculatura de la cabeza en adultos hecha por Miller (24), no pudimos identificar los músculos de la cabeza en adultos que podrían corresponder a las COM embrionarias presentadas aquí.

Curiosamente, la tinción doble Myo/Lbe también reveló que los HANC no mesodérmicos están unidos a ambas células cardíacas (Fig. 3E) y las COM (Fig. 3D). Porque las HANC expresan lb y se asocian selectivamente con el par de células cardíacas con lb positivo más anterior (Figs. 3E y 4 D-F), se especula que el establecimiento de este contacto puede implicar interacciones celulares de tipo homofílico. Probar las moléculas de adhesión celular involucradas en la señalización intercelular entre células homotípicas (25, 26) ayudará a definir los mecanismos subyacentes al establecimiento de conectividad entre las HANC que expresan lb y las células cardíacas.

Para visualizar la disposición espacial de la punta de la aorta, las COM y las HANC que expresan lb, utilizamos análisis 3D asistido por computadora y reconstrucción de escaneos confocales. Este enfoque confirmó plenamente nuestras observaciones revelando que, además de las HANC, la región de salida del corazón está estrechamente unida a un par de COM (Fig. 3F). Estos músculos se superponen a la punta del corazón desde ambos lados y contribuyen a su flexión ventral.

Para comprender cómo se establece el contacto entre el corazón, las COM y las HANC durante el desarrollo, monitoreamos estas estructuras en embriones de etapa temprana y tardía 14 (Fig. 3 G y H). Nuestros datos indican que tanto las células cardíacas lb positivas como las HANC que expresan lb atraen COM extendidos.

El contacto entre COM y HANC parece preceder ligeramente a la unión de COM a la punta de la aorta y se observa al comienzo de la etapa 14 (Fig. 3G). En ese momento, los fillopodia de COM se extienden en la dirección de las células cardíacas lb positivas (Fig. 3G) y se adhieren definitivamente a estas células en la etapa 14 tardía al inicio de la fusión cardíaca (Fig. 3H). Debido a que las COM entran en contacto con las células cardíacas y las HANC antes de que las HANC se adhieran al corazón, especulamos que las COM, además de doblar la punta del corazón, facilitan su contacto con las HANC. El establecimiento de contacto entre los músculos somáticos y sus sitios de unión epidérmica (células tendinosas) ha sido ampliamente estudiado (27), revelando el papel clave de la banda del factor de transcripción del dedo de zinc (28) y de una proteína de unión al ARN (29). Hemos utilizado ambos marcadores para probar si las células cardiacas y las HANC a las que se unen las COM muestran propiedades de células similares a los tendones. El doble etiquetado realizado en embriones WT con anti-Lbe/anti-Raya y en embriones how-LacZ con anticuerpos anti-Lbe/anti-LacZ reveló que los HANC y las células cardíacas en contacto con el COM no expresan marcadores de células tendinosas (no se muestran los datos). Este hallazgo indica que las células lb positivas atraen COMs mediante el uso de un mecanismo diferente al utilizado por las células tendinosas. Los candidatos más interesantes para guiar a las COMs son la Ranura de proteína secretada que posee los motivos de unión a proteínas múltiples y sus receptores Robo y Robo2 (30). La hendidura y el Robo surgieron recientemente como componentes fundamentales que controlan los procesos de atracción y repulsión durante la morfogénesis de los músculos somáticos (31), lo que sugiere que también podrían estar implicados en la atracción de COM.

Las Células Cardíacas que Expresan lb Más Anteriores Desempeñan un Papel Central en el Patrón de la Región de Salida Cardíaca. La observación de que tanto COMs como HANC optaron por unirse a las células cardíacas lb positivas más anteriores nos llevó a probar si la desregulación de la expresión de lb dentro del corazón podría influir en el patrón de la región de salida cardíaca. Para realizar esta prueba, utilizamos el sistema de expresión dirigido a Gal4/UAS (16). Se utilizaron dos líneas efectoras de GAL4 diferentes, 24B-GAL4 y Tin-GAL4 (Fig. 4 A y C). La línea 24B-GAL4 permite la expresión dirigida en todas las células cardíacas y musculares (Fig. 4A) con un nivel de expresión uniforme y alto en las células cardíacas más anteriores (flecha en la Fig. 4A). La línea Tin-GAL4 (amablemente proporcionada por R. Bodmer) induce la expresión transgénica de UAS de forma selectiva en cuatro cardioblastos de cada uno de los hemisferios (entre ellos, las células lb positivas), pero el nivel de inducción en las células cardíacas más anteriores es menor (flecha en la Fig. 4C) que la de la línea 24B-GAL4. Para expandir la expresión cardíaca de lb, ambas líneas efectoras de GAL4 se han cruzado con la línea UAS-lbe. La expresión cardíaca ectópica de lb impulsada por la línea Tin-GAL4 fue más débil que la expresión endógena de lb dentro del corazón, y no se han observado alteraciones obvias inducidas por ganancia de función en el patrón de la región de salida cardíaca (datos no mostrados). En contraste, los embriones 24B-GAL4>UAS-lbe mostraron una expansión marcada de la expresión de lb dentro del corazón (Fig. 4G), lo que lleva al contacto anormal de las COM con la punta del corazón. Más precisamente, encontramos que las COM se adhieren directamente a las células cardíacas más anteriores que forman el flujo de salida cardíaco (asterisco en la Fig. 4G) y no al segundo par de células cardíacas como en el peso (Fig. 4D). La conexión alterada de COMs es probablemente el resultado de las señales atractivas ectópicas generadas por la expresión cardíaca agrandada de lb. Como consecuencia, la flexión ventral de la parte más anterior del corazón fue más pronunciada (Fig. 4 D y G). También hemos observado una morfología alterada de COMs (punta de flecha abierta en la Fig. 4 D y G), que podrían resultar de la expresión muscular ectópica de lb impulsada por 24B-GAL4. El contacto entre las células cardiacas y las HANC no se vio afectado por las condiciones de expresión errónea experimentales. Para probar si la expresión cardíaca de lb es necesaria para la atracción de COMs, aprovechamos la influencia reguladora negativa descrita anteriormente de eve, que es capaz de reprimir específicamente lb en las células cardíacas (5). Una vez más, las líneas efectoras 24B-GAL4 y Tin-GAL4 se usaron para impulsar la expresión de eva dentro del corazón. Encontramos que ambos conductores cruzados con la línea UAS-eve (Estaño-GAL4 con menor penetrancia) conducen a la represión de la actividad de lb dentro del corazón (Fig. 4 H e I). A pesar de los defectos de falta de especificación, los primordios cardíacos se forman normalmente en embriones de ganancia de función UAS-eve (ref. 5 y Fig. 4B), lo que nos permite monitorear COMs y HANCs en un contexto en el que la expresión cardíaca de lb está agotada. Nuestros datos muestran que en tales embriones agotados de lb (ver la ausencia de expresión cardíaca de lb en la Fig. 4 H e I) las COM no se adhieren a la punta del corazón. Observamos que las COM se extendían anteriormente y se unían a HANC invaginantes (Fig. 4 H e I), que ya no pueden anclar correctamente la punta del corazón. La rama COM principal que normalmente se une a la región de salida cardíaca (comparar Fig. 4 E y F con H e I) estaban ausentes o fusionadas con la rama de fijación de HANC. Por lo tanto, creemos que la forma anormal de la COM y la pérdida completa de su contacto con la punta del corazón son causadas por el agotamiento de la lb cardíaca. Esta suposición está respaldada por el hecho de que se observaron los mismos fenotipos en embriones con expresión cardíaca ectópica (impulsada por Tin-GAL4) y cardíaca más muscular (impulsada por 24B-GAL4) de eve (comparar Fig. 4 H e I). El contacto y el posicionamiento alterados de las COM aparecieron en embriones en estadio 14 tardío cuando la cadena pesada de miosina aún no es detectable en cardioblastos (Fig. 4 E y H). El análisis de embriones en estadio 15 reveló además que la pérdida de la expresión cardíaca de lb se acompaña de la regulación descendente de la β3-tubulina (comparar Fig. 4 F e I) en la región de salida cardíaca, lo que indica que la expresión de lb dentro del corazón tiene un impacto importante en la morfogénesis cardíaca final. Estos datos complementan informes recientes que describen las funciones morfogenéticas de un miembro de la familia de receptores COUP-TF, SEVEN-up, expresado en el par posterior de cardioblastos en cada segmento y requerido para la formación de ostias en los segmentos abdominales A5–A7 (32, 33). En este contexto, la demostración del papel de la lb en el patrón de la región de salida cardíaca plantea la posibilidad de que en los segmentos abdominales la lb desempeñe un papel similar en el establecimiento de contacto entre las células cardíacas y los músculos alarios ancladores del corazón. Esta hipótesis queda por investigar.

Además, los fenotipos presentados (Fig. 4) sugieren que la expresión de lb agotada experimentalmente dentro del corazón influye en la emisión o recepción de señales atractivas por parte de las células cardíacas y, en consecuencia, conduce a la interrupción del contacto con las COM. Es probable que el mismo o similar atrayente muscular sea producido o recibido por HANCs lb positivos, lo que sugiere que lb regula la expresión de genes involucrados en el contacto celular-celular. Curiosamente, en el homólogo lb de ratón, se encontró que el gen Lbx1 era necesario para la migración dirigida de un subconjunto de precursores musculares (21, 22), lo que indica que los mecanismos de movimiento celular conservados podrían existir y estar controlados por los genes lb.

Tomados en conjunto, a través del análisis de embriones en los que la expresión cardíaca de lb se expandió o se agotó experimentalmente, hemos demostrado que el lb es necesario para la correcta fijación de HANC y COM y, en consecuencia, para el patrón adecuado de la región de salida cardíaca. Este hallazgo proporciona información sobre el significado funcional de la diversificación anteroposterior de los precursores cardíacos dentro de cada segmento del corazón de Drosophila.

¿Las HANC Pueden Representar un Prototipo de Drosophila de Células de la Cresta Neural? La morfogénesis del corazón de vertebrados involucra dos tipos de células diferentes, los primordios mesodérmicos del corazón y una subpoblación de células de la cresta neural que migran desde la región de la cabeza. En este artículo, hemos demostrado que en Drosophila un grupo de células no mesodérmicas originarias de la epidermis de la cabeza (que hemos llamado HANCs) contribuye a la morfogénesis final del corazón. Al igual que en las células de la cresta neural de los vertebrados, las HANC se someten a movimientos dirigidos, entran en contacto con las células cardíacas y participan en el patrón de la región de salida cardíaca. Hemos demostrado que los genes homeobox lb que se sabe participan en la diversificación de precursores cardíacos (5, 11) se expresan en HANC y son necesarios para su especificación. De manera similar, recientemente se encontró que el ortólogo de lb, el gen Lbx1, era necesario para la especificación de un subconjunto de células de la cresta neural cardíaca en ratones (23), lo que indica que los genes lb/Lbx1 desempeñan un papel conservado en la especificación de los componentes no mesodérmicos del corazón. En este punto de vista, los HANC podrían compararse con las células de la cresta neural de los vertebrados. Sin embargo, nuestros datos indican también que las HANC muestran al menos dos características que son específicas para Drosophila solamente: (i) se mueven como parte del ectodermo de cabeza plegada y no como células de la cresta neural deslaminadas; y (ii) forman un complejo funcional con COM, que no tienen estructuras homólogas en los vertebrados. Por lo tanto, se requieren análisis adicionales para dilucidar el papel exacto de las HANC y sus funciones potenciales similares a las de las células de la cresta neural.