Resumen
La carbendazima, como fungicida, se utilizó comúnmente para controlar enfermedades fúngicas en la agricultura, la silvicultura y los medicamentos veterinarios. En este estudio, se evaluó la toxicidad aguda y reproductiva de la carbendazima utilizando como modelo Caenorhabditis elegans (C. elegans) para evaluar preliminarmente los riesgos potenciales de este fungicida en la producción y aplicación agrícola. Los resultados mostraron que el crecimiento de C. elegans fue inhibido por 0,01 µg/L de carbendazima. El tratamiento de 0,1 µg/L de carbendazima causó una disminución significativa en el comportamiento de locomoción y un daño significativo al sistema reproductivo y antioxidante, lo que provocó una reducción drástica de la vida útil de los nematodos. Estos resultados proporcionan una mejor comprensión del riesgo ambiental de la carbendazima y plantean nuevas preocupaciones sobre la seguridad.
1. Introducción
Los pesticidas, un tipo de reactivos químicos o biológicos, se utilizan ampliamente en la agricultura para regular el crecimiento de las plantas y controlar enfermedades y plagas de insectos, lo que puede promover el crecimiento de los cultivos y mejorar el rendimiento de los cultivos . Sin embargo, el uso generalizado de plaguicidas dará lugar a diferentes grados de residuos en los cultivos o los alimentos y, por lo tanto, afectará a la salud humana . Los problemas de los residuos de plaguicidas no solo han atraído una gran atención de los consumidores, sino que también se han convertido en uno de los factores clave que afectan a la seguridad alimentaria .
La carbendazima, como fungicida de amplio espectro, se ha utilizado para controlar enfermedades fúngicas en la agricultura, la silvicultura y los medicamentos veterinarios . Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud clasifica la carbendazima en la categoría de productos químicos peligrosos y la Comisión Europea la ha clasificado en la lista prioritaria de productos químicos que alteran el sistema endocrino . En los últimos años, es obvio que el uso generalizado de carbendazima con exceso de rango y sobredosis y el hecho de que la carbendazima es difícil de degradar, ambos conducen al problema de los residuos de carbendazima en la agricultura . Aunque el efecto tóxico de la carbendazima se ha reportado desde la década de 1980, la toxicidad de la carbendazima se convierte en un tema candente debido a la creciente preocupación por los disruptores endocrinos ambientales . La carbendazima ha sido prohibida en varios países debido a sus impactos negativos en el medio ambiente y la salud, como alteraciones del desarrollo y la reproducción, toxicidad y mutagenicidad . Los efectos adversos de la carbendazima en los parámetros bioquímicos, histopatológicos y hematológicos en las glándulas hepáticas, renales y endocrinas y sus niveles hormonales se han ilustrado en ratas . Además, es necesario estudiar más a fondo la baja concentración debida a los residuos de carbendazima.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), como un importante modelo de investigación, es ampliamente utilizado para hacer alguna evaluación. Según Amrit et al. , C. elegans tiene muchas ventajas, como tamaño pequeño, tiempo de generación rápido, fácil cultivo en laboratorio y corta vida útil para adultos. En este estudio se eligió a C. elegans como organismo modelo para evaluar la toxicidad de bajas concentraciones de carbendazima, que puede considerarse como un valor de referencia para la aplicación de carbendazima en agricultura.
2. Materiales y Métodos
2.1. Productos químicos y cepas
Carbendazima (pureza ≥ 99%; Aladdin ® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, China) se disolvió en N, N-dimetilformamida (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, China) para producir 1 g/L de solución original de carbendazima. Las concentraciones de DMF fueron del 0,1% en las soluciones de exposición final(0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg/L). El grupo control fue el 0,1% de DMF sin carbendazima. C. elegans (N2 de tipo silvestre) se obtuvo originalmente del Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, Minnesota, EE.UU.). Los nematodos se cultivaron en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) que se sembraron con Escherichia coli OP50 a 20°C como se describe . La larva L1 de C. elegans se recolectó lavando los nematodos grávidos con una mezcla blanqueadora (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Letalidad
Las soluciones originales de carbendazima (1 g/L) se diluyeron con medio líquido S (1,12 g de K2HPO4, 5,92 g de KH2PO4 y 5,85 g de NaCl se diluyeron con 1 L de agua) para obtener las concentraciones finales de carbendazima de 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, y 1 mg / L, que contenía 0,1% de DMF. El medio líquido con DMF al 0,1% fue el grupo control. Se probaron 30 nematodos (L4) en placas de 96 pocillos para cada concentración. La supervivencia de los nematodos se contabilizó al microscopio después de un cultivo de 24 horas en la incubadora. El proceso de la prueba se basa en el método de Xiang et al. . Se necesitaron tres experimentos paralelos.
2.3. Comportamiento de locomoción
Al menos 10 C. elegans (L4) se seleccionaron aleatoriamente de cada concentración para determinar el comportamiento de la locomotora, que se registró tanto por la frecuencia de movimiento de la cabeza como por los tiempos de curvatura del cuerpo . El número de frecuencia de movimiento de cabeza se contabilizó por los cambios en la dirección de flexión en el cuerpo medio de C. elegans en 1 min. La medición de la curva corporal se definió como los tiempos de los cambios de dirección de la parte de los nematodos cultivados en NGM sin E. coli OP50 en los 30 s.
2.4. Se analizaron los ensayos de crecimiento y desarrollo
C. elegans expuesto a carbendazima durante 24 h. La longitud corporal de los nematodos expuestos a la carbendazima fue evaluada por el software Image J. La descendencia de cada C. los elegans desde larvas L4 hasta el día 1 se registraron en la etapa L3 después de transferirlos individualmente a una nueva placa todos los días hasta que cesó la reproducción . Se realizaron al menos tres pruebas paralelas.
2.5. Análisis de vida útil
Todos los C. elegans probados para vida útil se cultivaron en las mismas condiciones a 20°C. Los C. elegans sincronizados se cultivaron en placas NGM con diferentes concentraciones de carbendazima hasta el día 4. Los nematodos probados se transferirían a nuevas placas NGM cada 2 días. Sobreviviente y muerto C. elegans se registraron diariamente (a partir del primer día de la edad adulta) hasta que todos los nematodos para cada concentración había muerto . Se realizaron al menos tres pruebas paralelas.
2.6. La determinación del Daño Oxidativo
El ROS intracelular se midió con diacetato de diclorodihidrofluorosceína 2′,7′(H2DCFH-DA), que es la sonda de detección de oxígeno reactivo más común y sensible. El tipo salvaje N2 C. elegans se lavó en tampón M9 y luego se interrumpió por ultrasonidos. El sobrenadante se analizó el nivel de ROS siguiendo las instrucciones del kit ROS. La concentración de trabajo final de H2DCHE-DA fue de 10 μΜ . Las longitudes de onda de excitación y absorción de emisiones fueron de 485 nm y 535 nm, respectivamente. Se realizaron al menos tres pruebas paralelas.
Se determinó la superóxido dismutasa total intracelular (T-SOD) de acuerdo con las instrucciones del kit T-SOD comprado al Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng. Después de lavarse con M9 tres veces, los nematodos examinados se interrumpieron por ultrasonidos y reaccionaron con un kit T-SOD. La longitud de onda de absorbancia era de 550 nm. Además, se utilizó el sobrenadante para detectar el nivel de proteína para cada concentración, en la que la longitud de onda de absorbancia era de 595 nm. Se realizaron al menos tres pruebas paralelas.
2.7. Análisis de datos
Todos los datos se dieron como media ± error estándar de la media (SEM) mediante el uso de ANOVA unidireccional. Los gráficos se presentaron con Origin 8.5 y GraphPad Primer 7, y el análisis estadístico se realizó con el software SPSS 19.0. El nivel de significación estadística se realizó utilizando y .
3. Resultados
3.1. Determinación del Comportamiento de Locomoción de C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
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Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans tras exposiciones agudas a carbendazima mediante el análisis de los datos sobre la frecuencia de movimiento de la cabeza y los tiempos de flexión corporal de los nematodos (Figuras 1(a) y 1(b)). Ambos mostraron disminuciones significativas en las concentraciones de carbendazima que oscilaban entre 0,01 µg / L y 100 µg/L (). Además, los golpes de cabeza de los nematodos expuestos a 100 µg/L disminuyeron a 68,27%. Para la prueba de curvas corporales, cuando las concentraciones de carbendazima fueron de 10 µg/L y 100 µg/L, tuvo un efecto inhibitorio significativo en las curvas corporales de C. elegans en un 36,77% y un 35,48% en comparación con la prueba de control, respectivamente.
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(b)
(c)
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(b)
(c)
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3.2. Determinación del Crecimiento y Desarrollo de C. elegans después de Exposiciones agudas a Carbendazima
En comparación con el grupo de control (Figuras 1(c) y 1(d)), la longitud corporal y el área de superficie corporal se redujeron significativamente () en los grupos de exposición de 0,01 µg/L a 100 µg/L. Ambos disminuyeron en un 19,16% y un 22,15% con el tratamiento de 0,01 µg/L en comparación con el grupo de control, respectivamente. La concentración de 10 µg/L presentó los impactos más negativos, y la longitud corporal y el área de superficie corporal de C. elegans disminuyeron en un 35,21% y 65,22% en comparación con el grupo control, respectivamente.
3.3. Determinación de los Tamaños de Cría de C. elegans Después de Exposiciones Agudas a Carbendazima
De acuerdo con la Figura 2, los tamaños de cría de nematodos tuvieron una disminución significativa () en los grupos de tratamiento de 0,1 µg/L a 100 µg/L. Los tamaños de cría de C. elegans disminuyeron más significativamente, que disminuyeron a 43,71% con el tratamiento de 10 µg/L en comparación con el grupo de control.
3.4. Determinación de la vida Útil de C. elegans después de Exposiciones Agudas a Carbendazima
La vida útil de C. elegans se inhibió significativamente de 0,01 µg/L a 100 µg/L de carbendazima de acuerdo con la curva de vida útil mostrada en la Figura 3. Los resultados mostraron que la esperanza de vida de C. elegans disminuyó de 24 a 20 días con el tratamiento de 0,01 µg/L de carbendazima. La vida útil de los nematodos tratados con 0,01 µg/L de carbendazima se redujo en un 20,00%. Cuando la concentración de exposición a carbendazima fue de 100 µg / L, la vida útil de C. elegans fue la que más se redujo en un 45,83%.
3.5. Efectos de la Exposición Aguda a la Carbendazima sobre el Sistema Antioxidante de C. elegans
Los niveles de ROS de control y C. elegans tratada a la exposición a carbendazima de diferentes concentraciones se muestran en la Figura 4 (a). Se indicó que el nivel de ROS intracelulares aumentó significativamente () en rangos de 0,01 µg/L a 100 µg/L de carbendazima. En comparación con el control, el nivel de ROS aumentó como máximo en un 70,60% con el tratamiento de 10 µg/L. De acuerdo con los resultados de los niveles de SOD intracelulares, tuvo un aumento en el tratamiento de 0.carbendazima de 01 µg/L a 100 µg/L (Figura 4 b)). El nivel de SOD aumentó en un 10,70% a 0,1 µg/L de carbendazima en comparación con el grupo control.
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Discusión
La carbendazima, como fungicidas, es ampliamente utilizada en la agricultura para inhibir el crecimiento de hongos. Se ha prohibido el uso de la carbendazima en Australia, la mayor parte de la Unión Europea y los Estados Unidos debido a su toxicología severa y su naturaleza persistente . Para este estudio, fue la primera vez que se utilizó C. elegans como organismos modelo para evaluar los efectos de la carbendazima en el comportamiento de la locomotora, el crecimiento y el desarrollo, la reproducción, la vida útil y los sistemas antioxidantes. Además, los resultados mostraron que tuvo una influencia negativa en C. elegans.
De acuerdo con la CL50 de 24 h, la concentración de toxicidad aguda de C. elegans expuesta a diferentes concentraciones de carbendazima es de 0,867 mg/L. La CL50 de 96 h de carbendazima en respuesta al pez cebra se ha ilustrado como 1,75 mg/L . Los huevos de la carpa prusiana Carassius gibelio han mostrado efectos tóxicos a una concentración de 0,036 mg / L . Los estudios presentaron que el crecimiento y desarrollo de Navicula sp. es inhibida por la carbendazima con un valor de 24 h-EC50 de 2,18 mg/L. Aunque la tasa de crecimiento de algas se recupera después de una exposición de 72 h, el contenido de clorofila-a permanece significativamente disminuido cuando el tratamiento de la carbendazima fue superior a 0,5 mg/L . En este presente, se seleccionó a C. elegans expuesta a una baja concentración de carbendazima para evaluar sus efectos dependiendo de la concentración real de exposición diaria humana. Las bajas concentraciones de carbendazima no significan que sea segura. La carbendazima muestra impactos biológicos negativos a dosis mucho más bajas en algunos estudios.
Se evaluó el comportamiento locomotor para evaluar la neurotoxicidad de C. elegans (larva L4) después de 24 horas de exposición a carbendazima. Los resultados mostraron que la carbendazima podría tener efectos negativos en el comportamiento de la locomotora a través de la detección de golpes en la cabeza y flexión del cuerpo de C. elegans, que eran más sensibles en el grupo de mayor exposición. El comportamiento locomotor de embriones de pez cebra expuestos a la carbendazima es sensible . Estudios previos han demostrado que los peces tienen un comportamiento anormal cuando las concentraciones subletales de carbendazima son de 0,22 a 0,43 mg/L .
Las malformaciones del desarrollo también podrían ser una de las razones de la locomoción anormal . En nuestro estudio se evaluó el crecimiento y desarrollo de C. elegans. Los resultados mostraron que la longitud corporal y el área corporal de C. elegans se redujeron significativamente en el tratamiento superior a 0,01 µg/L de carbendazima. El crecimiento normal de los vertebrados está relacionado con la homeostasis metabólica de la hormona tiroidea . Williams et al. han indicado que la carbendazima podría causar pérdida de esperma después de la implantación, malformación fetal y crecimiento y desarrollo lentos.
La toxicidad reproductiva de la carbendazima se ha demostrado que la carbendazima podría inhibir la polimerización de microtúbulos de células fúngicas y de mamíferos, causando la interrupción del ensamblaje de microtúbulos al actuar con β-tubulina, lo que resulta en un deterioro de la segregación de cromosomas en el proceso de división celular . La formación de microtúbulos por uniones no covalentes de tubulina α y β es responsable de la segregación cromosómica en el proceso de mitosis y meiosis . El tamaño de la cría de C. elegans disminuye significativamente a una concentración de carbendazima de 0,1 µg/L. Se ha encontrado que la carbendazima afecta los sistemas de reproducción en codornices y hámsters japoneses . Se concluyó que la esperanza de vida de C. elegans disminuyó significativamente con una concentración de carbendazima ≥0,01 µg/L según nuestro estudio. Los estudios han demostrado que la carbendazima ha provocado infertilidad y toxicidad para el desarrollo y manifiesta toxicidad embrionaria, apoptosis de células germinales y teratogénesis en diferentes especies de mamíferos .
La apoptosis es una muerte celular programada compleja, que es un fenómeno altamente regulado caracterizado por una serie de procesos celulares . Muchos estudios han presentado que la producción de ROS inducida por estrés oxidativo está relacionada con la muerte celular apoptótica . Nuestro estudio encontró que la carbendazima podría inducir un aumento significativo en el nivel de los valores de ROS y un pequeño aumento en el nivel de los valores de SOD. El estrés oxidativo causado por la contaminación ambiental induce una mayor expresión de ROS y, posteriormente, daña el sistema de defensa antioxidante . SOD es responsable de la desintoxicación de los radicales libres tóxicos y sus actividades, que se utiliza para evaluar el nivel de estrés oxidativo y el estado antioxidante celular . La metaloenzima SOD acelera la transformación de radicales superóxido citotóxicos endógenos en H2O2, y el aumento de los niveles de expresión de SOD puede contribuir a mejorar las actividades enzimáticas para eliminar los radicales superóxido inducidos por la carbendazima y prevenir la aparición de disfunción celular durante la exposición a la carbendazima . Concentraciones de exposición más altas de carbendazima podrían causar estrés oxidativo severo, que posteriormente destruye el equilibrio de la homeostasis celular y promueve la apoptosis . Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados, la carbendazima en bajas concentraciones todavía podría dañar significativamente el sistema reproductor.
5. Conclusión
Por lo que sabemos, el presente estudio evaluó la seguridad de la carbendazima expuesta a C. elegans por primera vez. Demostró que la carbendazima podría tener un efecto dañino en el comportamiento locomotor, el desarrollo y crecimiento, la reproducción, la vida útil y el sistema antioxidante de C. elegans. Espero que necesite prestar más atención a la aplicación de carbendazima en función de los resultados. Además, es necesario evaluar más a fondo la seguridad de la carbendazima para su uso, especialmente la toxicidad por bioacumulación y los posibles efectos genotóxicos.
Disponibilidad de datos
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31501569).
