Resultados
Primero evaluamos si la CD63 y la H,K-ATPasa residen en el mismo compartimento subcelular en las células parietales gástricas. Trabajos previos han demostrado que las células parietales de rata expresan altos niveles de CD63 (22). La microscopía de inmunofluorescencia en secciones congeladas del estómago de rata indica que CD63 está presente en la mayoría de las células del estómago de rata, incluidas las células parietales (Fig. 1A). CD63 se coloca parcialmente con el HKa en células parietales. Además, analizamos una preparación de TVE altamente purificada a partir de estómago de cerdo (un regalo amable de C. T. Okamoto). La H, K-ATPasa contribuye ≈50% del contenido de proteínas en preparaciones similares (23). El análisis de Western blot indica que el CD63 está presente en abundancia en esta preparación purificada de EVT (Fig. 1B).
Localización y asociación de CD63 y H,K-ATPasa en células parietales. A) Criosecciones de estómago de rata con anti-HKa pAb (verde) y anti-CD63 Mab (rojo). (La barra de escala es de 50 µm. B) Las muestras de TVE de las interfaces de sacarosa del 27% (6 µg) y del 32% (14 µg) (regalo amable de C. T. Okamoto) fueron inmunoblotadas con mAb anti-HKß o MAB anti-CD63 (35). C) Preparados purificados de TVes de cerdo (13,3 µg) secados con anti-HKß mAb o lectina de tomate biotinilada. D) EVT purificadas incubadas en un tampón de lisis Tritón X-100 (Tr) al 2% o al 1%. Las EVT se incubaron con perlas de estreptavidina que estaban (+ lectina) o no estaban (–lectina) preconjugadas con lectina de tomate biotinilada. El material precipitado fue inmunoblotado con anti-CD63 mAb. El carril etiquetado como lisado de TVE contiene 25 µg de lisado.
Para investigar una posible interacción in situ entre CD63 y la H,K-ATPasa, realizamos experimentos de extracción con lectina de tomate biotinilada. Estudios previos han demostrado que esta lectina se une específica y exclusivamente al HKß en preparaciones gástricas (24-27). Se secó un preparado de TVE con anti-HKß mAb y lectina de tomate biotinilada para confirmar que la lectina se asocia específicamente con el HKß glicosilado (Fig. 1C). Luego utilizamos lectina de tomate biotinilada para aislar proteínas que interactúan con el HKß en la preparación de TVE. El análisis de Western blot indica que CD63 es precipitado por la lectina de tomate (Fig. 1D), demostrando que CD63 y la H, K-ATPasa se asocian in situ y sugiriendo que esta asociación puede ser fisiológicamente relevante. El pretratamiento de la preparación de TVE con SDS al 4%, seguido de una dilución de 20 veces en tampón de lisis, redujo significativamente la cantidad de CD63 que se precipitó. La cantidad de HKß que se precipitó no fue alterada por este tratamiento (datos no mostrados). Estos datos sugieren que la presencia de CD63 en el pull-down es atribuible a su asociación con el HKß y no a una asociación directa entre CD63 y la lectina de tomate.
Para investigar la importancia funcional de la interacción entre CD63 y HKß, transfectamos células COS-7 con un ADNc que codifica HKß de conejo, ya sea individualmente o junto con un ADNc que codifica una construcción CD63 etiquetada con una BANDERA (CD63-FL). Hemos demostrado que el HKß no necesita ensamblarse con el HKa para alcanzar la superficie celular en células COS transfectadas (20). Usamos una construcción CD63 que lleva una etiqueta de epítopo de BANDERA en su extremo N porque el extremo C de CD63 contiene un motivo basado en tirosina que se requiere para el tráfico intracelular de esta tetraspanina (13).
Las células COS cotransfectadas con el HKß y el CD63-FL se sometieron a inmunoprecipitación utilizando un pAb anti-FLAG. El análisis de Western blot del material inmunoprecipitado indica que el HKß coprecipita con CD63 (Fig. 2, HKß + CD63-FL). Las proteínas CD63-FL y HKß coinmunoprecipitan en una variedad de detergentes, incluidos 2% CHAPS, 1% Brij 96 y 1% Triton X-100. La asociación entre CD63 y el HKß constituye uno de los pocos complejos de tetraspanina descritos que sobrevive a la solubilización en Tritón X-100 y, por lo tanto, es probable que represente una interacción directa (28). La subunidad β tiene dos formas: ßm (madura), que se modifica con carbohidratos complejos, y ßc (núcleo), que se modifica con carbohidratos con alto contenido de manosa (29). Ambas formas coprecipitan con CD63, aunque la proporción de ßc a ßm en el precipitado varía en función de las condiciones de solubilización.
El HKß coprecipita con CD63. Las células COS se transfectaron con HKß solo, CD63-FL solo, o HKß y CD63-FL (HKß + CD63-FL). Se lisaron células en CAPS al 2%, Brij 96 (Br) al 1% o Tritón X-100 (Tr) al 1% y se inmunoprecipitaron con pAb anti-BANDERA. El segundo carril fue inmunoprecipitado a partir de una mezcla de lisados celulares de células transfectadas por separado con CD63-FL y HKß. Las proteínas precipitadas se secaron con anti-HKß mAb o anti-Lámpara-1 mAb.
El HKß no se detectó en las inmunoprecipitaciones de FLAG realizadas en células transfectadas con el HKß solo, lo que demuestra que el FLAG pAb no interactúa con la subunidad β (Fig. 2, HKß). El HKß no coinmunoprecipita con FLAG pAb a partir de una mezcla (50:50, vol/vol) de lisados preparados a partir de células transfectadas individualmente con CD63-FL y la subunidad β, confirmando que la interacción ocurre in vivo (Fig. 2, segundo carril). Las muestras incubadas con la BANDERA pAb no precipitan la proteína lisosómica Lamp-1, lo que indica que la interacción entre CD63-FL y el HKß es específica y no un artefacto de solubilización incompleta del compartimento CD63 (Fig. 2).
A continuación, examinamos si la interacción entre el HKß y el CD63 afecta a la localización subcelular de la subunidad β. El HKß está presente en la superficie celular en células COS transfectadas transitoriamente (Fig. 3 A–C). Hay una redistribución pronunciada de la subunidad β a vesículas intracelulares que contienen CD63 cuando las células COS se cotransfectan con el HKß y el CD63-FL (Fig. 3 D a F). Para descartar la posibilidad de que esta localización alterada pudiera ser un efecto inespecífico de la sobreexpresión de CD63, investigamos el efecto de la expresión de CD63 en la distribución de AQP4. AQP4 es un canal de agua que está presente en las membranas plasmáticas basolaterales de las células parietales. No se somete a endocitosis y exocitosis reguladas con la H, K-ATPasa (30, 31). Este canal no coinmunoprecipita con CD63-FL en un lisado Tritón X-100 de células COS cotransfectadas (Fig. 4A). Cuando las células cotransfectadas se visualizan mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia, AQP4 no está presente en el compartimento que contiene CD63 (Fig. 4B), lo que indica que la redistribución inducida por CD63 a las vesículas intracelulares es específica para las proteínas que interactúan con esta tetraspanina.
La colocalización en vesículas intracelulares es específica para proteínas que interactúan con CD63. A) Las células COS se transfectaron con AQP4 solo o se cotransfectaron con AQP4 y CD63-FL (AQP4 + CD63-FL). Las células se lisaron en Tritón X-100 al 1% e inmunoprecipitaron con mAb anti-BANDERA. El material inmunoprecipitado y los lisados celulares se probaron con pAb anti-AQP4. B) Las células COS se transfectaron con AQP4 (verde) o AQP4 y CD63-FL (rojo). Se detectó AQP4 con pAb anti-AQP4 y CD63 con mAb anti-FLAG. (La barra de escala es de 10 µm.)
Para investigar los mecanismos de la redistribución del HKß mediada por CD63, aprovechamos trabajos recientes que han caracterizado el tráfico intracelular de CD63. Rous et al. (13) demostró que el motivo a base de tirosina presente en el extremo C terminal de CD63 interactúa con las subunidades del adaptador μ2 y μ3. La proteína μ2 es un miembro del complejo heterotetramérico AP-2. Este complejo está presente en la membrana plasmática y une las proteínas de carga con la capa de clatrina, mediando su endocitosis (14). La proteína μ3 es un miembro del complejo heterotetramérico AP-3. Este complejo participa en la orientación lisosómica y se encuentra tanto en la red trans-Golgi como en un compartimento vesicular que se coloca parcialmente con los endosomas (12). Cuando el motivo de CD63 basado en tirosina YEVM se transforma en AEVM, CD63 es incapaz de interactuar con μ2 o μ3 y se expresa principalmente en la superficie celular (13). Cuando el HKß se coexpresa con la construcción CD63 – AEVM marcada con una BANDERA, tanto el CD63-AEVM como la subunidad β se distribuyen en la superficie celular (Fig. 3 G-I). Por lo tanto, la distribución intracelular del HKß se ve afectada por señales de tráfico incrustadas en la cola citoplasmática CD63.
Cuando la secuencia YEVM en la cola de CD63 se transforma en YEVI, el motivo modificado continúa interactuando con μ3 pero ya no se asocia con μ2 (13). CD63-YEVI se localiza principalmente en el compartimento endosomal-lisosomal tardío, muy probablemente porque la proteína tetraspanina alterada se mueve directamente a este compartimento después de su paso biosintético inicial a través del Golgi (13). La pequeña población de CD63-YEVI que llega a la membrana plasmática presenta una internalización deteriorada porque ya no puede interactuar con μ2 (13). Cuando el HKß y un constructo CD63-YEVI marcado con una BANDERA se coexpresan en las células COS, gran parte del CD63-YEVI se localiza en el compartimento endosómico–lisosómico tardío; sin embargo, la subunidad β permanece en la superficie celular y no se redistribuye a un compartimento intracelular (Fig. 3 J-L). El análisis de coinmunoprecipitación confirma que el HKß puede asociarse con CD63-YEVI y CD63-AEVM (datos no mostrados). Estos datos sugieren que para que el HKß se distribuya a un compartimento intracelular CD63 positivo, estas proteínas deben interactuar en la superficie celular y ser endocitosadas como un complejo.
Para determinar si el HKß detectado en las vesículas intracelulares corresponde a la proteína endocitosada de la superficie de la célula, observamos la internalización de la subunidad β en presencia y ausencia de expresión exógena de CD63. Las células COS se cotransfectaron con el HKß y el CD63-FL. Las células se enfriaron a 4°C para detener la endocitosis y se marcaron en la superficie con el HKß mAb. Las células marcadas se incubaron a 37°C durante 40 minutos para permitir que se reanudara la endocitosis. Después de la incubación, las células se enfriaron a 4°C y la superficie se etiquetó con IgG anti-ratón de cabra conjugada Cy5. Las células se fijaron e incubaron con pAb anti-BANDERA y luego se etiquetaron con IgG anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína e IgG anti-conejo de cabra conjugada con rodamina. Por lo tanto, el HKß que permaneció en la superficie se visualizó en el canal Cy5, el HKß internalizado se visualizó en el canal de isotiocianato de fluoresceína, y el CD63-FL se visualizó en el canal de rodamina. Este análisis demostró que la subunidad β internalizada se coloca con CD63, lo que sugiere que el conjunto de HKß que se coloca con CD63 se deriva a través de la endocitosis de la membrana celular (Fig. 5 E-H). Las células que no sobreexpresan CD63 exhiben una subunidad β mucho menos internalizada después de una incubación de 40 minutos (Fig. 5 A–D).
Para cuantificar la internalización del HKß y verificar además que el HKß y el CD63 se asocian en la superficie de la célula, realizamos experimentos de biotinilación de la superficie celular. En el primer experimento, las células COS se transfectaron con la subunidad β sola y se biotinilaron con éster de biotina-SS-N-hidroxisuccinimida a 4°C. Luego, se incubaron muestras duplicadas a 37°C durante varios períodos de tiempo para permitir que se reanudara la endocitosis. Las células se devolvieron a 4°C, y una placa de cada punto de tiempo se despojó de la biotina restante de la superficie celular por exposición al agente reductor de membrana impermeable MesNa. Las células fueron lisadas e incubadas con perlas de estreptavidina. Las proteínas asociadas con las perlas de estreptavidina se separaron por SDS/PAGE, y las membranas se probaron con el HKß mAb (Fig. 6A). La fracción de subunidad β en la superficie celular no cambia apreciablemente a medida que avanza la internalización de 37°C. Después de los primeros 10 minutos, una pequeña fracción de la superficie etiquetada HKß se secuestra dentro de la célula, y la proporción de superficie a HKß internalizado permanece alta. Estos datos sugieren que la subunidad β no asociada con CD63 se internaliza muy lentamente o se internaliza, pero se recicla rápidamente de vuelta a la superficie, al igual que el receptor de transferrina.
La internalización del HKß se ve reforzada por su asociación con CD63. A) Las células COS transfectadas con el HKß solo se biotinilaron con éster de biotina-N-hidroxisuccinimida y se incubaron a 37°C para permitir su internalización. Las placas se enfriaron a 4°C, y un plato de cada punto de tiempo (en minutos) se sometió a una tira de MesNa. Se recolectó material biotinilado con perlas de agarosa conjugadas con estreptavidina. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado. B) Las células COS cotransfectadas con el HKß y el CD63-FL se biotinilaron con o sin la tira de MesNa, como se ha descrito anteriormente. Todas las células se lisaron en CAPS al 2% e inmunoprecipitaron con pAb anti-FLAG. El inmunoprecipitado se eluyó e incubó con perlas de agarosa conjugadas con estreptavidina. Se realizaron cuatro experimentos independientes. La muestra de cada punto de tiempo fue analizada por SDS / PAGE e inmunoblotting con anti-HKß mAb. (Derecha) La intensidad de la señal de cada banda se cuantificó mediante densitometría.
el próximo tratado de caracterizar el comportamiento de la HKß que se asocia con CD63. Las células COS se cotransfectaron con el HKß y el CD63-FL. Las células fueron biotiniladas y despojadas como se describió anteriormente. Para aislar la población de HKß que está asociada con CD63, el lisado celular se incubó con BANDERA pAb y perlas de agarosa conjugadas con proteína A. El material inmunoprecipitado se eluyó con una pequeña cantidad de tampón que contenía un 3% de SDS, se diluyó 30 veces con un 1% de Tritón X-100 y se incubó con perlas de estreptavidina. Las proteínas asociadas con las perlas de estreptavidina se separaron por SDS/PAGE y se probaron con el HKß mAb (Fig. 6B). Para las células que no fueron sometidas a un protocolo de extracción, la señal detectada en este Western blot representa el conjunto total de subunidades β marcadas en la superficie asociadas con CD63, incluidos los complejos que aún estaban en la membrana plasmática y los complejos que habían sido internalizados en vesículas. Para las células que se sometieron a un protocolo de extracción, la señal representa la población de subunidad β asociada con CD63 que estaba presente en la superficie celular durante la biotinilación y posteriormente fue internalizada y protegida de la tira de MesNa.
En el punto de tiempo de 0 minutos, el HKß biotinilado se detecta fácilmente en inmunoprecipitados anti-FLAG de células no fragmentadas, lo que demuestra que el HKß y el CD63 son capaces de asociarse en la superficie celular. Todo el HKß biotinilado recuperado en el punto de tiempo de 0 minutos es sensible a la franja de MesNa. La cantidad de subunidad β biotinilada asociada a CD63 protegida del reactivo MesNa aumenta a medida que se permite que las células incuben a 37°C. De hecho, la cantidad de HKß que está presente en la superficie y asociada con CD63 a 0 min es aproximadamente la misma que la cantidad de HKß que está asociada con CD63 y protegida de la extracción a 45 min. Estos hallazgos sugieren que la subunidad β asociada con CD63 está internalizada y no regresa a la superficie celular.
