Huésped fúngico

Los hongos filamentosos pueden servir como huéspedes para una fábrica de células de ácido carmínico microbiano, ya que tienen la capacidad de proporcionar un amplio suministro de bloques de construcción de acetil-CoA y malonil-CoA para la síntesis de andamio de polietileno. También ofrecen la infraestructura celular necesaria para acomodar la C-glucosiltransferasa UGT28 unida a la membrana ER. Dado que A. nidulans posee una caja de herramientas de ingeniería genética bien desarrollada, elegimos esta especie como punto de partida para el desarrollo de una fábrica de células de ácido carmínico de hongos. Al igual que la mayoría de los hongos filamentosos, A. nidulans es capaz de producir una gran cantidad de metabolitos secundarios biosintéticamente diversos, incluyendo un número significativo de policétidos aromáticos. Chiang et al. han demostrado previamente que la deleción de los grupos de genes responsables de la formación de los principales productos endógenos de PKS en A. nidulans11, mejoró el potencial de A. nidulans como fábrica celular para la producción heteróloga de poliquétidos. De esta manera, se aumentan los grupos de bloques de construcción de acetil-CoA y malonil-CoA, y se simplifican los análisis químicos posteriores para la formación de nuevos productos. Como primer paso hacia una fábrica de células fúngicas para la producción de ácido carmínico, eliminamos las vías biosintéticas de los policétidos aromáticos dominantes que podrían interferir con la producción de ácido carmínico y complicar el análisis y la purificación posterior. Específicamente, se eliminaron los grupos de genes para la producción de aspertecina, monodictifenona y esterigmatocistina, así como los genes responsables de la formación de pigmentos de conidios verdes, wA y yA, en un fondo de A. nidulans no homólogo con deficiencia de unión final. Además de la falta esperada de pigmentos conidiales, la cepa resultante, NID2252, no mostró ningún efecto visible sobre la morfología y la aptitud (Archivo Suplementario, Fig. 1). Por lo tanto, utilizamos NID2252 como cepa de referencia y como base para la construcción de una fábrica de células fúngicas para la producción de ácido carmínico.

Diseño de una vía seminatural para la formación de antrona de ácido flavoquermésico

El obstáculo principal para la construcción de una fábrica de células de ácido carmínico microbiano fue la falta de un PKS natural que sintetizara antrona de ácido flavoquermésico, el primer supuesto intermedio en la vía. Para evitar esta limitación, seguimos una ruta biosintética alternativa para la producción de este poliquetido. La antrona de ácido flavoquermésico octacetídico, con su patrón de ciclización C7-C12, C5-C14 y C2-C15, en teoría podría formarse en un solo paso por un PKS iterativo de tipo I fúngico no reductor que posee un dominio de plantilla de producto adecuado (Fig. 1 izquierda). Sin embargo, todavía no se han descrito tales enzimas en la literatura. Un mecanismo alternativo para formar la antrona de ácido flavoquermésico es a través de una reacción de dos pasos donde un PKS sintetiza una cadena octacetídica lineal no reducida, que posteriormente se cicliza en la estructura deseada por ciclasas/aromatasas de acción trans (Fig. 1 derecha). Las reacciones de este tipo existen en la naturaleza, por ejemplo, en la vía de la actinorrodina (Act) en Streptomyces coelicolor12. En este caso, la columna vertebral de octacétido es sintetizada por un sistema PKS de múltiples subunidades bacterianas de tipo II, KSa, KSß y ACP (el act PKS mínimo), que es reducido por actKR en la posición C9 y posteriormente plegado por la aromatasa/ciclasa, actARO/CYC y ciclasa actCYC2, para producir el compuesto tricíclico 3,8-dihidroxi-1-metilantraquinona-2-ácido carboxílico (DMAC)7. DMAC muestra el mismo pliegue que la antrona de ácido flavoquermésico, pero se reduce en la posición C9.

De especial interés para el presente estudio, son la ciclasa ZhuI y la aromatasa ZhuJ de Streptomyces sp. R1128, que cataliza dos reacciones de ciclización secuencial de policétidos lineales no reducidos en pliegues similares a los del ácido flavoquermésico y trona 13. Específicamente, la ciclasa ZhuI es responsable de cerrar el primer anillo, C7-C12, y la aromatasa ZhuJ para cerrar el segundo anillo, C5-C14. El tercer anillo, C2-C15, se forma espontáneamente. ZhuI y ZhuJ han sido previamente coexpresados en S. el celicolor con el tipo formador de octacetido II actúa como PKS mínimos, lo que resulta en la formación de ácido flavoquermésico, conocido como ácido 3,6,8-trihidroxi-1-metilantraquinona-2-carboxílico (TMAC) en la literatura bacterial14. Desafortunadamente, una estrategia idéntica puede ser difícil de implementar en A. nidulans, ya que los PKSs mínimos de tipo II no se han implementado con éxito en huéspedes heterólogos fuera del género Streptomyces a pesar de varios intentos15. Y de hecho, nuestros intentos de reconstituir los miniPKS act en A. nidulans y Saccharomyces cerevisiae resultaron igualmente infructuosos (datos no mostrados). Una forma alternativa de formar el octacetido no reducido requerido es confiar en enzimas PKS de tipo III, que se han expresado con éxito en levadura, por ejemplo, en relación con la biosíntesis de flavonoidos16. De especial interés es la octacetida sintasa de Aloe arborescens (OKS), que se ha descrito para producir octacetidos no reducidos que se pliegan espontáneamente en SEK4 y SEK4b en vitro17 (Fig. 2a). Sin embargo, en Aspergillus no se ha probado si los productos de las SCP de tipo III, que son enzimas independientes de ACP que liberan ácidos carboxílicos, pueden ser plegados por el tipo ZhuI de ciclasa que se ha descrito que actúa sobre sustratos unidos a ACP. Por lo tanto, en el presente estudio nos propusimos probar la compatibilidad de las plantas de tipo III OKS con las ciclasas/aromatasas de los sistemas bacterianos de tipo II PKS, con el objetivo de desarrollar una vía biosintética artificial de novo para la formación del precursor de la antrona del ácido flavoquermésico para la formación del ácido carmínico.

Producción de precursores de poliquetida para la producción de ácido carmínico en A. nidulans

Para probar el rendimiento in vivo de OKS en un huésped fúngico, insertamos OKS controlados por el promotor gpdA de A. nidulans como una sola copia en un locus definido (sitio de integración 5, IS5) en A. genoma nidulans18. Se construyeron dos cepas, una que expresaba la secuencia de codificación nativa de OKS y otra que expresaba una versión optimizada de codón para expresión en A. nidulans. Después de siete días de incubación en medios de crecimiento sólidos, consulte la sección Métodos para obtener más detalles, ambas cepas mostraron una fuerte coloración marrón rojiza del micelio (Fig. 2b). El perfil metabólico por HPLC-HRMS de las cepas no reveló ningún rastro de un octacetido no reducido, sino más bien el SEK4 y SEK4b esperados junto con ácido flavoquermésico y otros tres compuestos abundantes de identidad desconocida (Fig. 2c), que no estaban presentes en la cepa de referencia NID2252. SEK4 y SEK4b se identificaron en base a un análisis exhaustivo de HPLC-HRMS / MS (Archivo Suplementario, Fig. 2) y estuvo de acuerdo con valores previamente reportados 19, mientras que el ácido flavoquermésico se comparó con una referencia auténtica aislada de D. coccus9 (Archivo Suplementario, Fig. 3). El metabolito se libera a los 13,0 min. tenía un ion pseudomolecular + de m / z 303.0867, correspondiente a una fórmula molecular de C16H14O6, consistente con el conocido producto de derivación de octacetida, mutactina, descrito previamente en experimentos basados en Streptomyces con el cluster7 del gen Act. Esta identificación se confirmó a través de un análisis detallado del espectro UV, respaldado por el tiempo de retención relativo a SEK4 y SEK4b (Archivo Suplementario, Fig. 4). Los dos metabolitos adicionales con fórmulas moleculares de C16H12O6 (- m/z 299.0566) indicaron productos de octacetida, pero, sin embargo, no correspondían a un producto de derivación común (Archivo suplementario, Fig. 5). Por lo tanto, los metabolitos se aislaron y la elucidación de la estructura basada en experimentos de RMN 1D y 2D los identificó como dehidro-SEK4 (también conocido como B26 en la literatura bacteriana) y dehidro-SEK4b20 (Archivo complementario, Figs 6-11). La formación de los seis nuevos poliétidos observados en la cepa OKS puede explicarse por tres reacciones espontáneas de primer cierre de anillo diferentes: C7-C12 (SEK4, dehidro-SEK4 y ácido flavoquermésico), C10-C15 (SEK4b y dehidro-SEK4b) y C7-C12 después de la reducción de cetonas C9 (mutactina) (Fig. 2a y Expediente Complementario, Fig. 12). De estos, solo el primer tipo de cierre de anillo (C7-C12) permite la formación posterior de la antrona de ácido flavoquermésico deseada a través de un segundo cierre de anillo C5-C14 y un tercer cierre de anillo C2-C15. Se ha notificado previamente que SEK4 y SEK4b se deshidratan espontáneamente para formar dehidro-SEK4 y dehidro-SEK4b, respectivamente, mientras que la formación de mutactina depende de la reducción enzimática de la posición C9 de la cadena poliquetídica antes de la plegada21. La formación de ácido flavoquermésico, un intermediario conocido en la vía del ácido carmínico (Fig. 1), fue inesperado, ya que no se ha notificado que este metabolito se forme espontáneamente a partir de cadenas de octacetidos no reducidas. Esto sugiere que A. nidulans produce naturalmente una serie de ciclasas / aromatasas que promueven el patrón de plegado deseado. El perfil de metabolitos de las dos cepas de expresión de OKS no mostró diferencias sustanciales en los niveles de producción y decidimos centrarnos en la cepa que expresaba la versión nativa de OKS como base para futuros desarrollos de una fábrica de células fúngicas para la producción de ácido carmínico.

Ingeniería de la vía de plegado de octacétidos no reducidos

El plegado promiscuo del octacétido no reducido reduce el rendimiento de ácido flavoquermésico deseable. Por lo tanto, imaginamos que la producción de ácido flavoquermésico podría aumentarse al simplificar el proceso de plegado en la dirección deseada al expresar versiones optimizadas de codones de ZhuI y ZhuJ. Para examinar si ZhuI y ZhuJ interfieren con el metabolismo nativo de A. nidulans, primero construimos cepas que expresan ZhuI y ZhuJ individualmente y en combinación a partir de loci genómicos definidos (IS6 e IS7) en la A. nidulans NID2252 cepa de referencia. El perfil metabólico por HPLC-EMR de las tres cepas no reveló diferencias metabólicas detectables (Fig. 3b). Luego construimos una deformación coexpresora de OKS con ZhuI, que codifica las ciclasas que catalizan la formación del primer cierre de anillo C7-C12 (Fig. 3a). En comparación con la cepa que expresaba solo OKS, esta cepa mostró aumentos de 2,5, 2,2 y 2,1 veces en los niveles de ácido flavoquermésico, SEK4 y dehidro-SEK4, respectivamente. De acuerdo con el plegado de guía ZhuI en la dirección deseada, estos cambios metabólicos se acompañaron de niveles reducidos de metabolitos que contenían los pliegues del primer anillo no deseados (Fig. 3b y cuadro 1). Una cepa coexpresora de OKS y ZhuJ, que codifica las aromatasas que catalizan el segundo cierre de anillo C5-C14 (Fig. 3a), produjo un aumento de 2,7 veces en los niveles de ácido flavoquermésico. Este aumento se acompañó de una reducción de los niveles de metabolitos con un primer pliegue de C7-C12 (SEK4 y dehidro-SEK4), mientras que, como era de esperar, el nivel de metabolitos con el primer pliegue de C10-C15 no deseado (SEK4b y dehidro-SEK4b) no se vio afectado (Fig. 3b y cuadro 1). Finalmente, el análisis de la cepa que expresaba ZhuI, ZhuJ y OKS mostró un aumento de 4,1 veces en la producción de ácido flavoquermésico en comparación con cuando OKS se expresaba solo. Además, este aumento es un 60% mayor que el observado con las cepas que expresan OKS en combinación con ZhuI o ZhuJ, respectivamente (Tabla 1). Este resultado indica que la ciclasa y la aromatasa, de forma aditiva, son capaces de aumentar el flujo en la vía artificial de novo hacia el producto deseado, el ácido flavoquermésico (Fig. 3b).

Sorprendentemente, y muy alentador, un análisis metabólico adicional de la cepa coexpresora de OKS, ZhuI y ZhuJ reveló que el aumento de la formación de ácido flavoquermésico estaba acompañado por la producción de ácido kermésico (Fig. 4). Por lo tanto, A. nidulans proporciona la monooxigenasa necesaria para convertir el ácido flavoquermésico en ácido kermésico, que puede servir como el intermedio final en la vía del ácido carmínico (Fig. 1).

Producción de ácido carmínico en A. nidulans

El último paso en la formación de ácido carmínico implica la C-glucosilación del ácido kermésico (Fig. 5a). La enzima responsable de este paso en la vía biosintética del ácido carmínico se ha identificado previamente en D. coccus y se caracteriza por la expresión heteróloga en S. cerevisiae8. Por lo tanto, insertamos el gen codificador UGT2, optimizado para la expresión en A. nidulans, en el locus IS4 de la cepa de referencia NID2252, y para completar la vía biosintética del ácido carmínico seminatural en A. nidulans, en el mismo locus de la cepa que expresa ZhuI, ZhuJ y OKS. La expresión de UGT2 sola en la cepa de referencia no afectó la apariencia del color del medio de crecimiento ni el perfil metabólico de A. nidulans en comparación con la cepa de referencia NID2252 (Fig. 5b, c). En contraste, la coexpresión de OKS, ZhuI, ZhuJ y UGT2 dio lugar a una coloración roja del medio, lo que sugiere que se formó un colorante más soluble en agua(Fig. 5b). El análisis de MS-LC dirigido de esta cepa confirmó la formación de ácido carmínico22 (Archivo Suplementario, Fig. 13), junto con dcII9, 23 y un isómero dcII (Archivo Suplementario, Fig. 14), mostrando que UGT2 era funcional en A. nidulans y podría completar con éxito la ruta biosintética (Fig. 5c). La identificación positiva del ácido carmínico y el dcII se basó en tiempos de retención similares, espectros UV, patrones de fragmentación MS y MS/MS para patrones puros de los dos compuestos. Tres isómeros del ácido carmínico han sido descritos en la literatura (ácido carmínico, DCIV y DCVII) por Stathopoulou et al.23, los tres muestran diferentes tiempos de retención en el análisis basado en LC-MS/MS. En nuestro análisis, solo detectamos ácido carmínico y no DCIV y DCVII en función del tiempo de retención y el patrón de fragmentación del estándar de ácido carmínico auténtico aislado de D. coccus (Archivo suplementario, Fig. 13). Juntos, nuestros datos demuestran firmemente que es posible producir ácido carmínico en A. nidulans a partir de una vía seminatural.