Diseño del estudio

Estudio VX-765: ratones WT inyectados con vehículo de cinco meses de edad (vehículo WT+; n = 18) y ratones J20 (vehículo J20+: n = 14), y VX-765 inyectados Ratones J20 (J20 + VX-765: n = 13) los ratones se evaluaron longitudinalmente en cinco momentos diferentes: basal antes del tratamiento (los J20 no tratados basales se agruparon juntos; n = 19), después de tres inyecciones IP por semana de VX-765 o vehículo (Tratamiento 1), después de seis inyecciones adicionales durante 2 semanas (Tratamiento 2), después de un período de lavado de 4 semanas (WO) y después de tres inyecciones adicionales en 1 semana (Tratamiento 3) (Fig. 1a). Todos los animales analizados se incluyeron en los análisis a menos que (a) el animal muriera durante el experimento, o (b) el animal no respondiera de forma comportamental. Se utilizaron un total de 25 camadas, distribuidas en cuatro cohortes diferentes y analizadas en diferentes momentos. Tres de estas cohortes se sometieron a pruebas de campo abierto y NOR, mientras que la cohorte 4 se utilizó para Barnes maze. Después de que los animales se sometieron a pruebas de referencia para confirmar que los animales J20 presentaban déficit de comportamiento, los animales J20 se asignaron aleatoriamente al tratamiento con vehículo o con VX-765, independientemente de su comportamiento. De todos los animales utilizados, cuatro ratones J20 no mostraron déficits de comportamiento al comienzo del experimento y no se utilizaron. Dos ratones de vehículo J20 + no se movieron en absoluto durante el experimento y se excluyeron sus datos de comportamiento; sin embargo, estos animales se mantuvieron y se siguieron utilizando para análisis post mortem.

Estudio de validación de Casp1: Para validar los efectos específicos de Casp1 del VX-765, se generaron ratones J20 en un fondo Casp1 -/ -. Se utilizaron setenta y tres ratones (n = 12-13 por genotipo, seis genotipos diferentes), todos los cuales se criaron mediante fertilización in vitro (FIV) de 35 hembras donantes. Los detalles de la cría se describen en la sección de Estudios con animales a continuación. Se evaluó el comportamiento de todos los ratones entre los 7 y 8 meses de edad, y no se excluyó a ningún animal de este estudio.

Todos los ratones fueron sacrificados y procesados a los 8 meses de edad. La puntuación conductual fue ciega al genotipo y al tratamiento de ratones, y todos los animales se asignaron aleatoriamente para análisis bioquímicos o histológicos y se analizaron a ciegas.

VX-765, VRT-043198 Ensayos IC50 en caspasas recombinantes

Estudios en animales

Todos los procedimientos en animales siguieron las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill. La línea de ratones transgénicos J20 (JAX Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) expresa las mutaciones de aplicaciones humanas suecas (670/671KM→NL) e Indiana (717V→F) bajo el promotor PDGF-ß. Los ratones macho J20 se utilizaron como reproductores y su esperma se utilizó para la expansión de colonias de fecundación in vitro.Los genotipos se determinaron mediante biopsia de cola y RT-PCR. Los ratones fueron alojados en grupo (2-4 animales por jaula) en jaulas estándar de macrolon bajo un ciclo de luz/oscuridad inverso de 12 horas y condiciones ambientales controladas. La comida y el agua estaban disponibles ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) se disolvió en cremóforo al 20% en dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá) y se administró por vía intraperitoneal. Los ratones J20 y WT tratados con vehículos recibieron únicamente cremóforo.

Análisis de permeabilidad de la barrera hematoencefálica

Ratones J20 y WT de cinco meses de edad fueron anestesiados con isoflurano y se separó la arteria carótida derecha. Se realizó una pequeña incisión a lo largo de la pared carotídea y se insertó un micro-catéter en la entrada de la arteria carótida interna. El catéter se fijó en su lugar con hilo de sutura. VX-765 (50 mg kg−1) se perfundió a 50 µl min−1 (90-120 µl de volumen total). El micro-catéter se dejó 5 min adicionales para permitir la difusión, después de lo cual se recolectó sangre por punción intra-cardíaca. El ratón fue perfundido transcardialmente con solución salina helada y el hipocampo y la corteza fueron disecados. Las muestras se enviaron a la plataforma de Biofarmacia (Universidad de Montreal) para el análisis de cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem.

Análisis de comportamiento

Campo abierto: la actividad locomotora se midió utilizando un sistema de seguimiento automatizado HVS2100 (HVS Image, Hamptom, Reino Unido). Los ratones se colocaron en la cámara de campo abierto (caja de Plexiglás de 40 × 40 cm, sin techo y piso blanco) y se les permitió explorar durante 5 minutos.

Reconocimiento de objetos novedosos (NOR): los ratones fueron preexpuestos a dos objetos idénticos en la cámara de campo abierto durante 5 minutos. Dos horas después de la preexposición, los ratones fueron colocados de nuevo en la cámara y expuestos a un objeto familiar y un objeto nuevo durante 5 minutos. Los ratones se expusieron a un objeto específico solo una vez en diferentes sesiones de prueba, y la colocación de objetos novedosos se compensó dentro de cada grupo de tratamiento. Se evaluaron el porcentaje de toques del objeto nuevo durante la fase de prueba y el índice de discriminación ((# toques novedosos − # toques familiares)/toques totales).

Laberinto Barnes: la plataforma Barnes maze (91 cm de diámetro, elevada a 90 cm del suelo) constaba de 20 agujeros (cada uno de 5 cm de diámetro). Todos los orificios estaban bloqueados, excepto un orificio de destino que conducía a una caja de escape empotrada. Se utilizaron señales espaciales, luz brillante y ruido blanco para motivar a los ratones a encontrar el escape durante cada sesión. Para la fase de adaptación, cada ratón exploró la plataforma durante 60 s. Cualquier ratón que no encontró la caja de escape fue guiado a ella y permaneció allí durante 90 s. Para la fase de adquisición, cada ensayo siguió el mismo protocolo, con el objetivo de entrenar a cada ratón para encontrar el objetivo y entrar en la caja de escape dentro de los 180 s. Los ratones permanecieron en la caja durante 60 s adicionales. Cuatro ensayos por día, con aproximadamente 15 minutos de separación, se realizaron durante 4 días consecutivos. En la prueba de sonda (día 5), cada ratón realizó un ensayo de 90 segundos. El objetivo seguía en la misma posición, pero la caja de escape estaba bloqueada. Se midieron la latencia y los errores para alcanzar el objetivo, además del número de pulsaciones del ratón en cada uno de los agujeros (preferencia de destino). El Laberinto en Y estaba compuesto por un laberinto simétrico en forma de Y con tres brazos a 120° uno del otro, designados A, B y C. Los animales se colocaron en el extremo distal del brazo A y se les permitió explorar el laberinto durante 5 minutos. Se registraron las entradas totales de los grupos y la alternancia espontánea, definida como entradas consecutivas en tres grupos diferentes. Se determinó la alternancia porcentual.

Procesamiento de tejidos

Para inmunohistoquímica, los ratones (n = 4-6 por grupo) fueron anestesiados con isofluorano y perfundidos transcardialmente con solución salina helada seguida de paraformaldehído al 4% helada (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) en solución salina tamponada con fosfato de 0,1 M. Los cerebros se fijaron en formalina neutra tamponada al 10% (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canadá) durante 16 h y se transfirieron a etanol al 70%. Los cerebros fueron embebidos en parafina y seccionados a 4 µm.

Para western blot y ELISA (n = 4-8 por grupo), los ratones anestesiados se dislocaron cervicalmente, el hipocampo y la corteza se diseccionaron e inmediatamente se congelaron en hielo seco. Las proteínas se extrajeron en 5× volumen / peso con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-desoxicolato, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 de Cóctel de Inhibidores de Proteasas (Sigma-Aldrich)) en hielo con un homogeneizador de tejidos (OMNI International, Kennesaw, GA, EE.UU.). Las muestras se centrifugaron (20.000 × g, 4 ° C) durante 20 min, se recuperó el sobrenadante y se cuantificó la proteína mediante el método BCA. El pellet insoluble en RIPA se extrajo en ácido fórmico al 70% en dH2O, se evaporó y se resolubilizó en Tris-HCl de 200 mM, pH 7,5.

Tinción inmunohistológica

Los epítopos se degradaron en citrato (Citrato Tris-Na de 10 mM, pH 6,0) o EDTA (Base Tris de 10 mM, EDTA de 1 mM, Interpolación-20 de 0,05%, pH 9.0) tampón de recuperación de antígenos, e inmunotenido con el procesador de diapositivas automatizado Dako Autostainer Plus y el sistema EnVision Flex (Dako, Burlington, ON, Canadá). Después de la desparafinización y rehidratación, las secciones fueron tratadas con peroxidasa, bloqueadas en un bloque de proteínas libres de suero e inmunotenadas con los siguientes anticuerpos diluidos en el diluyente de anticuerpos EnVision Flex: 1:2000 anti-Iba1 de conejo (Wako 019-19741, Richmond, VA, EE.UU.), 1:8000 anti-GFAP de conejo (Dako Z-0334), 1:2000 anti-Aß1-40 de conejo (F25276, desarrollado en laboratorio) y 1:1000 antisinaptofisina de ratón (Sigma-Aldrich S5768). Las secciones se trataron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP de ratón o conejo adecuado suministrado con el kit y se visualizaron con DAB. Las secciones eran de hematoxilina contra teñida, deshidratada y cubierta con Permount (Fisher Scientific). Las secciones se escanearon digitalmente con MIRAX SCAN para su análisis (Zeiss, Don Mills, ON, Canadá). Después de la desparafinización y rehidratación, los portaobjetos se teñieron con tioflavina acuosa filtrada al 1% (Sigma-Aldrich).

Análisis inmunohistológico cuantitativo

Se cuantificaron células Iba1 positivas en la corteza y la porción anterior de la región CA1 del hipocampo utilizando una versión modificada del marco de conteo areal48. Brevemente, se cuantificó cada quinta diapositiva (lo que resultó en cuatro secciones por cerebro). Se tomaron múltiples imágenes ×80 con el ESCANEO MIRAX dentro del área de interés y se contó manualmente el número de células Iba1 positivas. Se estimó la densidad numérica (número de células mm−3) en la región CA1 anterior y la corteza. Se necesitaba un número mínimo de 150 impactos por zona para hacer una estimación fiable. Las secciones adicionales se contaban si no podíamos alcanzar nuestro número mínimo. La cuantificación se realizó a ciegas para el tratamiento y el genotipo. Se utilizó el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.) para medir la acumulación de Aß, la GFAP y la tinción inmunopositiva sinaptofisina en la región CA1 y la corteza. Se analizaron cuatro secciones por cerebro y se tomaron múltiples imágenes dentro de cada sección para cubrir la región CA1 y la corteza. El umbral se ajustó por igual en todos los cerebros para resaltar el área teñida, y se analizaron las partículas para determinar el área total de tinción. Los resultados se expresan como área total teñida por área total analizada (µm2 mm-2). Las imágenes representativas solo se han recortado para ajustarse a las restricciones de tamaño y no se han postprocesado.

Western blotting

Se prepararon muestras de proteínas de ratón (25-100 µg) en Laemmli (5% 2-β-mercaptoetanol, 1 mm Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 de Cóctel de Inhibidores de Proteasas (Sigma-Aldrich)), hervidas durante 5 min y separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Las muestras se probaron con los siguientes anticuerpos primarios, diluidos en leche seca descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris y al 0,1% en tampón de bloqueo Tween-20 o PBS (Termocientífico): 1: 1000 Aß1-16 (6E10) antihumano de ratón (BioLegend 803001, San Diego, CA, EE. UU.), 1:terminal C antiaplicación de conejo 2000 (Sigma-Aldrich A8717), anti-neprilisina de conejo 1:1000 (Abcam ab79423), anti-IDE de conejo 1:500 (Abcam ab32216), anti-Caspasa-3 de conejo 1:1000 (Señalización celular 9665), Caspasa-8 antiactiva de ratón 1:1000 (Señalización Celular 8592), conejo 1:1000 anti-Caspasa-9 (Señalización celular 9504), y anti-β-actina de ratón 1:5000 (Sigma-Aldrich A5441). Se detectaron manchas con anticuerpos secundarios anti-ratón ligados a 1:5000 HRP (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) o 1: 5000 anti-conejo (Dako P0217) seguidos de ECL (GE Amersham). Se visualizaron bandas inmunorreactivas utilizando el sistema de imágenes ImageQuant LAS 4000 (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA) y se realizaron análisis densitométricos con el software de análisis de medidores de imagen (Fujifilm USA). El brillo y el contraste de las manchas raw se ajustaron por igual en toda la imagen con el software Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) para generar imágenes representativas. No se hizo ninguna modificación adicional. Se utilizó el software CanvasTM X (Acd system, Plantation, FL, EE. UU.) para crear las figuras finales. En la Figura complementaria 11 se encuentran disponibles los blots sin procesar para los western blots.

ELISA

Se determinaron las citocinas pro y antiinflamatorias y los niveles de Aß en el cerebro de ratón utilizando kits de análisis inmunológicos de electroquimioluminiscencia de Meso Scale Discovery (Rockville, MD, EE.UU.). Los estándares y las muestras se prepararon de acuerdo con los protocolos del fabricante y se ejecutaron por duplicado. Se utilizó el panel proinflamatorio de ratón de diez plexos para hipocampo y cortical de ratón y muestras. Se utilizó un único kit de Il-1β para medir el plasma de ratón. Se utilizó el panel proinflamatorio humano de cuatro plexos para las muestras de NPH (ver más abajo). El kit humano Aß 6E10 de cuatro paneles se utilizó para hipocampo y corteza de ratón, y muestras de HPN.

Extracción de ARN y síntesis de ADNc

El ARN total se extrajo del hipocampo y la corteza de ratón (n = 3 por grupo) con Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) seguido de homogeneización con una aguja de calibre 20. El mini kit miRNeasy, que incluye el paso de tratamiento de DNasa en columna, se utilizó para purificar el ARN total (Qiagen). La calidad y la cantidad de ARN se determinaron mediante un espectrofotómetro (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, EE.UU.). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Los productos se visualizaron en geles de agarosa teñidos al 2% de RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canadá). Se realizaron experimentos de PCR en tiempo real con SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, EE. UU.) en una máquina de sistema de PCR Rápido en Tiempo real Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). La amplificación génica se realizó con los siguientes cebadores: (18s) 5′-GTAACCCGTTGAACCCCAT-3′ y 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′-ACTAACCTGGTGGTGAAG – 3′ y 5′-GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilisina) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ y 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3′. Los resultados se expresan como valores de inducción de pliegues normalizados para los genes de referencia HPRT y 18S medios utilizando el método de Pfaffl.

Array PCR para perfilador de plasticidad sináptica de ratón RT2

El Array PCR para perfilador de plasticidad sináptica de ratón RT2 (PAMM-126Z, Qiagen) perfila la expresión de 84 genes implicados en alteraciones sinápticas durante el aprendizaje y la memoria y cinco genes de limpieza (β-actina; β-2-microglobulina; gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, GAPDH; β-glucuronidasa, Gusb; Proteína de choque térmico 90 alfa (citosólica), Hsp90ab1) con PCR en tiempo real. El ARN total (465 ng para cada muestra) se transcribió inversamente (que incluyó un paso de eliminación de ADN genómico) siguiendo el protocolo del fabricante (Kit de Síntesis de ADNc de primera hebra, Qiagen). La reacción de PCR en tiempo real se realizó en un ciclador en tiempo real ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) utilizando la RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen). Las condiciones de ciclo fueron las siguientes: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 °C, 40 ciclos, 15 s cada uno a 95 °C y 1 min a 60 °C. El umbral y la línea de base se establecieron manualmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se normalizaron a la media geométrica de los cinco genes de limpieza y se analizaron mediante el método comparativo de Tc (2-ΔCT).

Cultivo de células neuronales y ensayo de degeneración axonal

Tejido cortical fetal de doce a dieciséis semanas de edad se obtuvo del Laboratorio de Investigación de Defectos de Nacimiento (Universidad de Washington, Seattle, EE.UU.) de acuerdo con un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional de McGill. Las NPH se cultivaron a partir de cerebros disociados con tripsina, tratados con desoxirribonucleasa I y filtrados a través de malla de nailon de 130, 70 y 30 µm21. Las células disociadas se centrifugaron durante 10 min a 300 × g y se resuspendieron en medio esencial mínimo (MEM) con sales de Earle, y se suplementaron con BCS descomplementados al 5%, 1× Penicilina-Estreptomicina, piruvato de sodio de 1 mM y l-glutamina de 2 mm (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se sembraron células a una densidad de 3×106 células ml-1 en placas de cultivo de tejido de seis pocillos recubiertas de poli−l-lisina de 5 µg mL-1 (Sigma-Aldrich). El medio MEM se cambió cada 2 días y la proliferación de astrocitos se limitó con tratamiento antimitótico de fluorodeoxiuridince (FdU) (1 mM, Sigma) durante los primeros 4 días. Los cultivos neuronales se cultivaron 7-10 días antes de realizar los experimentos. Se probaron cuatro preparaciones de neuronas diferentes en momentos diferentes. Una de las preparaciones neuronales no era estable y el cultivo, incluido el Suero + control que no recibió ningún fármaco, murió en medio del experimento. Por lo tanto, se utilizaron tres preparaciones de neuronas diferentes de tres donantes genéticamente diferentes.

Se evaluó la toxicidad del VX-765 con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Las neuronas se trataron con 25-200 µM VX-765 o 0,1% de DMSO (concentración de DMSO más alta utilizada) durante 72 h. Luego, las neuronas se incubaron con 0,5 µg ml−1 MTT (Sigma-Aldrich) durante 4 h a 37 °C (5% de CO2). Los cristales de formazán se disolvieron en 100 µl DMSO durante 30 min. La absorbancia se midió a 560 y 670 nm utilizando el lector de placas Synergy H4.

La degeneración axonal fue inducida por transfección de TPAP o estrés de privación sérica. El VX-765 se administró como estrategia de pretratamiento (1 h antes del factor estresante) o como estrategia de tratamiento post-tratamiento (48 h después del factor estresante). Las neuronas fueron transfectadas por Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canadá) con perlas de oro recubiertas con pBudCE41-eGFP para visualización de fluorescencia. Las neuronas que estaban estresadas por el APPWT se transfectaron con pBudCE41-eGFP / APPWT. Brevemente, las neuronas fueron tratadas con medio suplementado con 25 o 50 µM VX-765, inhibidor de Casp1 de 5 µM Z-YVAD-fmk, o DMSO. Se tomaron imágenes de fluorescencia cada 24 h (hasta 72 h después del tratamiento) con un microscopio Nikon Eclipse Ti (Nikon, Mississauga, ON, CA) y una cámara CCD fotométrica coolSNAP HQ2 (Photometrics, Tucson, AZ, EE.UU.) utilizando el software NIS Elements AR 3.10 (Nikon). El porcentaje de abalorios neuronales se midió contando el número de neuronas eGFP-positivas con cuentas sobre el número total de neuronas eGFP-positivas en cada momento. Se contó un mínimo de 150 neuronas eGFP positivas para cada condición. Se muestreó el medio acondicionado (complementado con Na3VO4 de 1 mM, NaF de 1 mM, PMSF de 1 mM, cóctel de Inhibidores de Proteasas de 10 µl ml−1 (Sigma-Aldrich)) y se recolectaron neuronas en tampón de lisis celular (HEPES de 50 mM, CAPS de 0,1%, EDTA de 0,1 mM) para el análisis.

Análisis estadísticos

El número de animales o experimentos independientes, y el análisis estadístico utilizado (ANOVA y comparaciones post hoc) se indican en las leyendas de las figuras. Todos los valores se expresan como la media ± s. e. m., con valores F y p indicados en las leyendas de las figuras. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 7 (Software GraphPad, La Jolla, CA, EE.UU.).