Resultados
Identificación de la Cadena α del receptor de IL-7 (CD127) como Marcador para las Células T de Memoria. Al buscar nuevos marcadores para definir subconjuntos de efectores y células T de memoria en el ratón, analizamos la expresión superficial de la cadena α/CD127 del receptor IL-7 (Fig. 1a). Durante las respuestas primarias al Ml, se pueden distinguir subpoblaciones distintas de poblaciones de células T esplénicas específicas de antígenos en función de los niveles de expresión de CD127. Las células de baja expresión de CD127 (CD127low) predominan durante la fase efectora aguda. Sin embargo, durante la transición a la fase de células T de memoria, las células CD127low desaparecen gradualmente, mientras que las poblaciones que expresan niveles altos (CD127high) permanecen notablemente estables en tamaño con el tiempo (Fig. 1 a y c). Estos valores cinéticos distintos sugieren fuertemente que la expresión de CD127 es una característica selectiva para las células T de memoria de larga duración. Durante la fase efectora, las células T CD8+ bajas CD127 migran preferentemente a órganos no linfoides, mientras que solo se detectan células T CD8+ altas CD127 en LN (Fig. 1b). El bazo representa un «órgano intermedio» donde se encuentran todas las subpoblaciones diferentes al principio de la inmunización (22, 23). Más tarde, durante la fase de memoria, las células T específicas de antígeno en todos los órganos se caracterizan por un fenotipo cd127 alto (Fig. 1 b y c). La comparación de las capacidades de las células T de antígeno específico CD127low y CD127high para proliferar en respuesta a la estimulación reveló diferencias sorprendentes entre los dos subconjuntos. Como se muestra en la Fig. las células T altas CD127 específicas de Listeria purificadas de 1d proliferan rápidamente después de la estimulación anti-CD3, mientras que las células T bajas CD127 proliferan poco. Es poco probable que estas diferencias en la proliferación reflejen una ventaja de las células CD127 positivas a través de la estimulación de IL-7R mediada por Ab, ya que diferentes clones de mAb con actividad de activación o bloqueo conocida de CD127 demostraron el mismo efecto en ensayos de estimulación in vitro a corto plazo (datos no mostrados).
Expresión superficial CD127 (IL-7R) como marcador de células T de memoria. a) Una cohorte de ratones BALB/c se infectó con una dosis subletal (≈0,1 × LD50) de peso Lm, seguida de una infección secundaria (≈10 × LD50) 5 semanas después. Se muestran gráficos de puntos representativos de esplenocitos (bloqueados en células T CD8+ vivas) teñidos con tetrámeros H2-Kd/ LLO91–99 (eje y) y para expresión de superficie CD127 (eje x) para los puntos de tiempo indicados durante las respuestas primarias (Superior) y de recuerdo (Inferior). b) Se aislaron linfocitos de diferentes órganos durante las fases del efector primario (7 días después de la infección) y de la memoria (35 días después de la infección). Los histogramas representativos están controlados en células CD8 + y H2-Kd/ LLO91–99 tetrámero positivo y muestran controles de tinción CD127 (abiertos) y sin teñir (rellenos). c) Cinética de los números absolutos (eje y) de células CD127 de expresión alta(rellenas) y baja (abiertas) CD8+ y H2-Kd/LLO91-99 tetrámeros positivos; seis ratones individuales por punto de tiempo. d) Las células CD127 de expresión alta y baja CD8+, H2 – Kd/LLO91-99 con varios multímetros positivos se clasificaron directamente ex vivo 10 días después de la infección por Listeria. La proliferación de células marcadas con éster succinimidílico de carboxi fluoresceína se analizó después de la estimulación anti-CD3; células CD127high (línea negrita) o CD127low (línea delgada).
Para demostrar de manera más directa que las células T de memoria de larga duración están presentes exclusivamente en el compartimento de alta expresión CD127 al principio del cebado in vivo, realizamos estudios de transferencia adoptiva utilizando una técnica de tinción multimer reversible MHC recientemente desarrollada (21) para aislar funcionalmente las células T específicas de antígeno directamente ex vivo. Después de la transferencia adoptiva de células T CD127 de alto LLO91–99 específicas de ratones infectados durante 10 días con Ml, las células transferidas aún eran detectables varias semanas después en el bazo de ratones receptores no tratados previamente (Fig. 2a), mientras que los números de células tras la transferencia de células CD127low estaban en el límite de detección. Esta observación no se debió a diferencias en la migración in vivo de células CD127 altas y CD127 bajas transferidas, ya que encontramos diferencias similares para el pulmón (Fig. 2a)y otros órganos (LN e hígado, no se muestran datos). Para apoyar aún más la interpretación de que los linfocitos T cd127 altos mantienen exclusivamente células de memoria específicas para antígenos, los ratones receptores fueron desafiados después de la transferencia adoptiva con infección por Listeria. De nuevo, solo en ratones que habían recibido células T cd127 altas antes de la infección se detectó una expansión rápida de células T específicas de LLO91–99 transferidas (Fig. 2b). De nuevo, este resultado no se debió a diferencias en la migración, ya que el mantenimiento o la expansión de las células T CD127low transferidas no fue detectable en ningún otro órgano (Fig. 2b y no se muestran los datos). Aunque estos resultados de estudios de transferencia adoptiva apoyan fuertemente la hipótesis de que las células T de memoria de larga duración están exclusivamente presentes en el compartimento de células T altas cd127, también observamos limitaciones sustanciales de este enfoque experimental. En particular, las células T de memoria con función efectora inmediata parecen ser bastante sensibles a los experimentos de transferencia adoptiva y mueren rápidamente después de la purificación y la aplicación intravenosa; aunque sobreviven durante meses o años si se dejan intactas in vivo (11). Por lo tanto, aunque nuestros resultados de la transferencia adoptiva se ajustan a la interpretación de que CD127 es un marcador de células T de memoria de larga duración, no podemos excluir que los problemas intrínsecos con respecto a la supervivencia de distintas subpoblaciones de células T también contribuyan al resultado de estos experimentos.
Los estudios de transferencia adoptiva indican que las células T de memoria de larga duración están exclusivamente presentes en el compartimento positivo para CD127. CD127 células CD8+ de alta y baja expresión, H2-Kd/LLO91–99 con varios multímetros positivos de BALB / c Thy1.1 ratón se clasificó directamente ex vivo 10 días después de la infección por listeria. Las células se transfirieron a ratones receptores de BALB/c (Thy1, 2) sin tratamiento previo, y se teñieron los bazos y pulmones 3 semanas después para detectar células donantes (CD8+ y Thy1, 1+). (a) Los gráficos de barras resumen los datos de números absolutos de células de Thy1, 1+ por órgano después de la transferencia de células T CD127 altas (abiertas) o CD127 bajas (llenas). b) La misma adquisición y presentación de datos que se describe en a, 5 días después de la infección con 103 Ml.
El mantenimiento de Poblaciones de Células T Específicas de Antígenos con CD127 y CD62L Permite la Discriminación Entre Subpoblaciones de Células T de Memoria. La caracterización adicional de la población de células T CD127high mostró que puede subdividirse en subpoblaciones que expresan niveles altos y bajos de CD62L (Fig. 3). El análisis funcional ex vivo directo (21) de células T purificadas (10-12 días después de la infección, cuando todas las subpoblaciones son detectables simultáneamente en el bazo) reveló diferencias funcionales adicionales. Mientras que los subconjuntos de células T CD62LOW muestran actividad citolítica ex vivo vigorosa e inmediata, las células T CD127high/ CD62Lhigh muestran una lisis muy pobre de las células diana recubiertas de péptidos (Fig. 3). La tinción intracelular de citoquinas de ordenados subpoblaciones reveló que CD127high/CD62Llow las células T, como la CD127low/CD62Llow subconjunto, producen las citocinas efectoras INF-gamma y factor de necrosis tumoral α; en contraste, el CD127high/CD62Lhigh subconjunto produce IL-2, pero no de IFN-gamma y factor de necrosis tumoral alfa. Así, la combinación de marcadores de CD127 y CD62L permite la identificación de subpoblaciones de células T con características muy similares a las descritas anteriormente en humanos. Los linfocitos T CD127low/ CD62LOW demuestran todas las características conocidas de una población real de linfocitos T efectores (TE, escasa actividad proliferativa, supervivencia in vivo limitada y función efectora inmediata). El subconjunto CD127high/ CD62Lhigh coincide con las características de la MTC, y las células T CD127high/Cd62low se ajustan a la descripción de la TEM.
La tinción doble CD127/CD62L distingue entre subconjuntos de células T CD8 + distintos; se pueden encontrar resultados similares en humanos. Tinción doble de células CD8+, H2-Kd/LLO91–99 multimeros positivos para la expresión superficial de CD62L (eje y) y CD127 (eje x) después de la infección con Ml; se indican porcentajes relativos de subpoblaciones en cuadrantes. Las subpoblaciones CD127low/Cd62low, CD127high/CD62Llow y CD127high/CD62Lhigh se clasificaron directamente ex vivo 12 días después de la infección por Listeria y se transfirieron a diferentes ensayos funcionales. La actividad citolítica se evaluó después de la incubación de células clasificadas en presencia de células diana y péptidos LLO91–99 (cuadrados) o sin péptidos (círculos). Se realizó tinción intracelular de citoquinas de subpoblaciones específicas de LLO91–99 clasificadas ex vivo (como se indicó anteriormente) para IL-2 (Superior), IFN-γ (Central) y factor de necrosis tumoral α (Inferior) después de una breve reestimulación in vitro con péptido LLO91–99 (áreas negras; áreas blancas representan controles no estimulados); se indican porcentajes de células positivas a citoquinas.
La Generación de Subpoblaciones de Células T de Memoria Distintas Depende de la Ayuda de Células T Mediada por CD40L. Debido a que sentimos que podría ser problemático basar exclusivamente la interpretación de que la expresión CD127 se puede usar como marcador para distinguir entre células T de memoria de larga duración y efectores en experimentos de transferencia de células adoptivas, decidimos analizar líneas mutantes de ratón con defectos en la generación de memoria de células T. Si CD127 es de hecho un marcador de células T de memoria» temprana», deberíamos ser capaces de identificar diferencias durante los puntos de tiempo temprano y tardío dentro de los subconjuntos CD127 positivos en ratones con defectos de memoria.
Debido a que estudios recientes demostraron la importancia de la ayuda de células T para la generación de respuestas de memoria de larga duración (2-4), decidimos determinar si la presencia o ausencia de ayuda de células T CD4+ durante el cebado de células T CD8+ conduce a diferencias en las composiciones de subconjuntos de células T antígenos específicos detectadas en la fase de posteffector inicial. Los ratones con deficiencia de MHC II, que carecen de células T CD4+ convencionales, tienen una respuesta de memoria CD8+ defectuosa y la calidad de protección disminuye con el tiempo (2-4). La tinción para subpoblaciones de células T 10 días después de la infección primaria reveló que el subconjunto CD127 Alto/CD62 bajo está casi completamente ausente en ratones MHC II–/– (Fig. 4a); las otras subpoblaciones están presentes a frecuencias similares a las de los ratones WT C57BL/6. Estos datos demuestran que la ausencia de ayuda de células T impide la generación eficiente de un subconjunto de células T con un fenotipo de memoria efectora, que parece ser crucial para la rápida expansión in vivo y la función efectora.
Las respuestas de memoria deterioradas en ratones MHC II – / – y CD40L–/ – se correlacionan con defectos tempranos en la generación de subconjuntos de células T distintos. a) Ratones WT C57BL / 6 (Izquierda) y con deficiencia de MHC II (Derecha) se infectaron con una dosis subletal de Ml que expresaba ovoalbúmina; se muestran gráficos de puntos de células T CD8+, H2-Kb/SIINFEKL positivas teñidas para CD62L (eje y) y CD127 (eje x) 10 días después de la infección primaria. b) Número de bacterias viables en el bazo 3 días después de la reinfección (≈10 × LD50; 5 semanas después de la infección primaria) con Listeria en CD40L–/– (lleno) y peso BALB/c (abierto); n = 3 por grupo. c) Cinética de linfocitos T específicos de LLO91–99 determinada por tinción de tetrámero H2-Kd / LLO91-99 en ratones CD40L/( • ) o WT BALB / c ( □ ) después de infección primaria (0,1 × LD50) y de recuerdo (2,5 × LD50; 5 semanas después de infección primaria) con Ml; tres ratones por punto de tiempo. d) Ratones con peso BALB/c y ratones CD40L / – recibieron BrdUrd por agua potable durante la infección de recuerdo con Lm (2,5 × LD50; 5 semanas después de la infección primaria) durante toda la fase de expansión (días 1-5); las gráficas de puntos muestran la incorporación de BrdUrd (eje x) en células T CD8+ teñidas con tetrámeros H2-Kd/LLO91–99 (eje y), la tinción se realizó el día 5. e) Tinción doble de células CD8+, H2-Kd/ LLO91–99 tetrámero positivo de un ratón CD40L-/– BALB/c para CD62L (eje y) y CD127 (eje x) 10 días después de la infección primaria (control de peso BALB/c ver Fig. 2c). f) Números absolutos de subconjuntos de células T ILO91–99 tetrámeros positivos en el bazo determinados 10 días después de la infección primaria mediante tinción para CD62L y CD127.
Debido a que los mecanismos importantes de la ayuda de células T CD4+ están mediados por la interacción de CD40 y CD40L (24-26), investigamos si los ratones CD40L–/– muestran un fenotipo similar al de los ratones MHC II–/–. De acuerdo con otros estudios recientes (27), los ratones CD40L–/– no muestran diferencias en la carga bacteriana o el aclaramiento bacteriano después de la infección por Listeria primaria (datos no mostrados) y tienen respuestas normales de linfocitos T CD8+ primarios a una dosis subletal de Ml (Fig. 4c). Sin embargo, su capacidad para eliminar rápidamente la reinfección con una dosis más alta de Ml (≈10 × LD50) se reduce (Fig. 4b), que se correlaciona con respuestas de células T de memoria CD8+ deterioradas (Fig. 4c) y un subconjunto CD127 alto/CD62 bajo muy reducido (Fig. 4 e y f) durante la fase inicial del sector posterior. Durante la reinfección con Listeria, la proliferación de células T que responden en ratones CD40L–/– es equivalente a la de las poblaciones de células en ratones WT, lo que indica que el fenotipo no se debe a un defecto general en la capacidad proliferativa de las células T de memoria (Fig. 4d), sino más bien a un número reducido de células T de memoria capaces de responder inmediatamente al reencuentro de antígenos. Este fenotipo se demostró mediante experimentos de etiquetado in vivo en los que se incorporó BrdUrd durante toda la fase de expansión (Fig. 4d) y mediante estudios de seguimiento de pulso de BrdUrd in vivo que monitoricen la pérdida de la etiqueta en la proliferación (datos no mostrados).
Generación Reducida de Subconjuntos de Células T con un Fenotipo de Memoria Efectora Temprano Después De que el Cebado Se Transmite al Grupo de Células T de Memoria Tardía. Nuestros datos muestran que en ausencia de células T CD4+ o CD40L, el subconjunto de células T CD127high/CD62Llow se reduce significativamente al principio del cebado. Además, nosotros (Fig. 4b) y otros (3-5) demostraron que el deterioro de la ayuda de las células T durante el cebado de células T conduce a cambios en la calidad de la inmunidad protectora hacia la reinfección con Ml o el virus de la coriomeningitis linfocítica. Para vincular más claramente el defecto observado en la generación temprana de células T CD127high/ CD62Llow con la calidad de la memoria de células T posterior en estos ratones, analizamos con más detalle las poblaciones de células T específicas de antígenos durante la fase de memoria (5 semanas después de la infección primaria por Listeria). En este momento, el análisis de las células T específicas de antígenos debe realizarse en células derivadas de diferentes tejidos debido a su comportamiento migratorio distinto. Además del bazo, elegimos el LN como tejido representativo de los órganos linfoides y el pulmón como compartimento periférico no linfoide típico. En este momento, las células T específicas de antígeno en estos órganos son casi todas cd127 de altura (Fig. 1b); las células en el pulmón son CD62 Llow (datos no mostrados), mientras que la mayoría de las células T de memoria de antígeno específico en el LN son CD62Lhigh (Fig. 5b). Para determinar el número de células T de memoria específicas de antígeno con función efectora inmediata clara en los diferentes órganos, se realizó tinción de citoquinas intracelulares para IFN-γ. Como se muestra en la Fig. los ratones 5a, CD40L–/– se caracterizan por un número sustancialmente menor de células T de memoria de antígeno específico con función efectora inmediata en comparación con los ratones WT. Este resultado es cierto en el nivel de frecuencias (porcentaje) dentro del compartimento de células T CD8+ y en números absolutos (Fig. 5a). Sin embargo, la tinción de tetrámeros MHC de linfocitos derivados de LN (Fig. 5b) reveló números casi idénticos de células T específicas de antígenos con un fenotipo CD62L alto. Algunas células T específicas de antígeno CD62Llow también son detectables en LNs de ratones WT, correlacionándose con las frecuencias de las células productoras de IFN-γ (Fig. 5a). Esta población está básicamente ausente en LNs de ratones CD40L–/–; todo el subconjunto CD8+/ CD62Llow se reduce en ratones CD40L–/–, lo que sugiere un defecto general en la generación de este subconjunto de células T. En resumen, nuestros datos muestran que la ausencia de ayuda de células T CD4+ dependientes de CD40L durante el período de cebado da lugar a diferencias cuantitativas en subpoblaciones de células T CD8+ específicas de antígenos, con un número muy reducido de células que exhiben un fenotipo de memoria efectora (CD127high/CD62Llow). Estas diferencias cuantitativas en células con función efectora temprana inmediata se transmiten a la fase de memoria y afectan la calidad de la inmunidad protectora.
Los cambios dependientes de CD40L en los subconjuntos de células T poco después del cebado de células T se transmiten al grupo de células T de memoria posterior. a) Se aislaron linfocitos de pulmones, bazos y LN derivados de ratones WT BALB/c o CD40L–/– 35 días después de la infección primaria con Lm (0,1 × LD50). La tinción intracelular de IFN-γ se realizó después de una breve reestimulación in vitro en presencia de péptido LLO91–99 para identificar células T con función efectora inmediata. Los gráficos de puntos muestran resultados representativos para diferentes órganos (como se indica); los números indican las frecuencias generales de las células productoras de IFN-γ. La primera fila de gráficos de barras resume los datos de frecuencias de células T específicas LLO91–99 productoras de IFN-γ dentro del compartimento CD8+; la fila de gráficos de barras a la derecha resume los datos de números absolutos de células T específicas LLO91-99 productoras de IFN-γ en diferentes órganos . b) Se tomaron células LN 35 días después de la infección primaria, como se describe en a; se detectaron células T específicas de LLO91–99 mediante tinción multimer MHC (gráfico de puntos, eje y) junto con el contenido de costos para la expresión de la superficie de CD8 y CD62L (gráfico de puntos, eje x). Se muestran gráficos de puntos representativos para células cerradas en células T CD8 + ; se indican las frecuencias dentro de cada cuadrante. El gráfico de barras a la izquierda resume los datos de las frecuencias de las células T multimercadas y CD62L positivas de MHCS dentro del compartimento CD8+; la fila del gráfico de barras a la derecha resume los datos de los números absolutos de células T multimercadas positivas de LLO91–99/H2-Kd en LN (CD40L-/– (rellenas) y WT BALB/c (abiertas); n = 3 por grupo).
