Resultados y discusión

En sistemas de mamíferos, se ha demostrado que la actividad de Cdc42 es importante para regular la diferenciación de células madre/progenitoras de la piel en células de folículo piloso, controlar la polaridad madre/progenitora neuroepitelial y la bifurcación hemisférica cerebral, y regular el número y el crecimiento de células durante el período de desarrollo perinatal (6-9). Curiosamente, un examen de la actividad de Cdc42 en ratones adultos con peso corporal de varias edades revela que el nivel relativo de Cdc42-GTP de animales mayores es significativamente mayor que el de los más jóvenes en diversos tejidos, incluidos el corazón, el cerebro, los pulmones, el hígado, la médula ósea, el bazo y el riñón (Fig. 1 A y datos no mostrados), lo que plantea la posibilidad de que el aumento de la actividad de Cdc42 esté involucrado en el proceso de envejecimiento normal.

Para determinar si el aumento de la actividad de Cdc42 asociado con el envejecimiento natural puede tener relevancia fisiológica, examinamos el regulador negativo de Cdc42, Cdc42GAP, en ratones dirigidos a genes después de que hayan alcanzado la edad adulta. Estudios previos de ratones knockout homocigotos Cdc42GAP durante el período perinatal indicaron que varios tejidos / células contenían un Cdc42-GTP elevado, y los embriones / crías recién nacidas del genotipo Cdc42GAP mostraron un tamaño reducido de órgano / organismo que se relaciona con un aumento de la apoptosis espontánea en varios tipos de células (6). En ratones adultos Cdc42GAP−/−, la actividad de Cdc42 fue constitutivamente mayor en múltiples tipos de tejidos / células que la de los ratones WT coincidentes, mientras que el nivel de RhoA-GTP o Rac1-GTP se mantuvo similar al de WT (Fig. 1 B; datos no mostrados), lo que sugiere una ganancia específica de actividad de Cdc42 en los animales adultos similar a la del período perinatal. La mayoría de los ratones Cdc42GAP−/− murieron durante el período neonatal debido a su tamaño más pequeño y a su físico débil (6). Sin embargo, una proporción de ellos (≈7%) podría sobrevivir al período neonatal bajo cuidado de crianza por mujeres no emparentadas. A pesar de la ingesta regular de leche y las concentraciones séricas normales de glucosa e insulina encontradas en los ratones homocigotos en el período postnatal , el aumento de peso de los ratones Cdc42GAP−/− comenzó a desacelerarse a ≈3 meses de edad en comparación con ≈5 meses de edad para ratones con peso corporal o heterocigotos, y los homocigotos maduros disminuyeron ≈30% en peso corporal debido a una disminución en la celularidad general (Fig. 1 C y no se muestran los datos). La mediana de vida de los ratones Cdc42GAP −/− fue ≈12 meses, mientras que los ratones control (peso o heterocigotos) permanecieron vitales hasta una mediana de edad de ≈27 meses (Fig. 1 D). La curva de supervivencia de los ratones homocigotos es algo diferente de la curva típica de Gompertz, pero es similar a las reportadas para los animales transgénicos BubR1 (un regulador de puntos de control mitótico) (10) o p44 (una isoforma corta del supresor tumoral p53) (11). La cifosis y la falta de vigor en ratones Cdc42GAP−/− se hicieron evidentes a la edad de ≈12 meses (Fig. 1 E). Los ratones con piel Cdc42GAP−/− a los 15 meses de edad mostraron una clara reducción de la masa corporal, una pérdida sustancial de tejido adiposo subdérmico, lordocifosis grave y atrofia muscular (datos no mostrados). Una radiografía mostró un fenotipo de cifosis significativo y una densidad mineral ósea (DMO) reducida en ratones Cdc42GAP−/− a la edad de 15 meses (Fig. 1 F). La cuantificación adicional de los huesos diseccionados de ratones Cdc42GAP−/− reveló reducciones de 3 y 2,6 veces de la DMO en la tibia y el fémur, respectivamente (SI Fig. 7). Además, los ratones Cdc42GAP−/− machos y hembras perdieron fertilidad a una edad más temprana en comparación con la de WT. En el apareamiento entre Cdc42GAP – / – hembras y machos con peso corporal, los homocigotos se volvieron infértiles a las 26 semanas de edad en comparación con las 48 semanas de edad para el PESO corporal (Fig. 1 G). Estas observaciones indican que la deficiencia de Cdc42GAP resulta en un nivel constitutivamente elevado de Cdc42-GTP, tamaño corporal reducido, cifosis temprana, DMO reducida, período de fertilidad reducido y esperanza de vida reducida en ratones adultos.

Las secciones teñidas de H&E a través del cuerpo vertebral de ratón hembra de 8 meses de edad mostraron que los ratones Cdc42GAP- / -tenían una corteza más delgada y arqueada y trabéculas más delgadas en comparación con los ratones con peso (Fig. 2 A). De manera similar, las secciones de longitud del fémur de los ratones homocigotos mostraron una reducción del grosor óseo cortical en comparación con el de los ratones WT (datos no mostrados). Estas observaciones concuerdan con la apariencia macroscópica y las características clínicas de la osteoporosis. El bazo, el hígado y los riñones de los ratones adultos Cdc42GAP/− se redujeron en masa debido a una disminución de la celularidad general, que fue evidente en las secciones teñidas con E del bazo H&, y las regiones pulpar blancas que contienen células T y B de los ratones Cdc42GAP/− bazo de 12 meses de edad se redujeron notablemente en comparación con las de los ratones con PESO de la misma edad (Fig. 2 B y datos no mostrados), lo que sugiere una atrofia linfoide pronunciada en los homocigotos. Consistente con la aparente reducción del tejido adiposo subdérmico, el análisis histológico de las secciones transversales de la piel dorsal reveló una ausencia casi completa de células adiposas s. c. en ratones Cdc42GAP- / -de 9 meses de edad (Fig. 2 C). La pérdida de masa muscular y la atrofia muscular también se confirmaron mediante el examen de secciones de músculo esquelético teñidas con H&de ratones Cdc42GAP-/-de 12 meses de edad y ratones WT de la misma edad (Fig. 2 C). Los ratones Cdc42GAP – / – también mostraron una marcada reducción en la regeneración del vello después de la eliminación del vello dorsal mediante el afeitado, mientras que el PESO de edad y sexo emparejado mostró un crecimiento robusto del vello (SI Fig. 8). La capacidad de tolerar tensiones, como la cicatrización de heridas, una actividad asociada al envejecimiento (12) de los ratones Cdc42GAP -/−, se redujo significativamente en comparación con la del peso corporal (Fig. 2 D). El análisis histopatológico de las secciones de la herida mostró poca reepitelización en el borde de la herida de los ratones Cdc42GAP−/−, mientras que la reepitelización completa de los ratones WT fue evidente 4 días después de la introducción de la herida (Fig. 2 E). Además de estas observaciones, varios fenotipos hematopoyéticos de ratones homocigotos, como la anemia, la reducción de las celularidades del bazo y la médula ósea, los defectos del injerto de células madre hematopoyéticas en la médula ósea y el aumento de la sensibilidad de las células madre hematopoyéticas a la movilización inducida (13, 14), fueron consistentes con el envejecimiento temprano en el sistema hematopoyético. Es importante destacar que un examen de ratones homocigotos jóvenes (< de 4 meses de edad) antes de la manifestación de fenotipos obvios no reveló anomalías importantes en el hueso, la piel y el bazo (SI Fig. 9 A y B y datos no mostrados), lo que sugiere que los fenotipos similares al envejecimiento de los ratones Cdc42GAP-/− no se deben a un trastorno del desarrollo temprano. Además, varios fenotipos de los ratones homocigotos, incluyendo la reducción del grosor del hueso cortical, cifosis y pérdida de masa muscular y tejidos epidérmicos, se pudieron encontrar en los ratones WT viejos (>de 2,5 años de edad) (SI Fig. 9 C y D y no se muestran los datos). Como se resume en la Tabla 1 del SI, en conjunto, estos resultados proporcionan pruebas sólidas de que la deficiencia de Cdc42GAP causa fenotipos prematuros similares al envejecimiento en los animales.

La tinción de tejidos de adultos de 9 meses de edad, incluidos el hígado, el riñón y el bazo, para detectar la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) reveló una fuerte actividad de este marcador de senescencia en ratones homocigotos que no se detectó en los tejidos de ratones con PESO emparejados por edad y sexo (Fig. 3 A y SI Fig. 10), lo que indica que los tejidos Cdc42GAP−/− adultos pueden sufrir senescencia prematura. Curiosamente, el aumento de la apoptosis de los tejidos homocigotos observado durante el período perinatal estaba ausente en los homocigotos adultos cuando la actividad elevada de SA-β-gal era evidente (ref. 6 y no se muestran los datos). Las células de fibroblastos embrionarios (MEF) Cdc42GAP/ ratón, que contienen ≈3 veces más Cdc42− GTP pero un contenido normal de Rac1− GTP o RhoA-GTP en comparación con las células MEF en peso (6), mostraron un aumento significativo de la actividad de SA-β-gal y acumularon una morfología senescente aplanada y agrandada a partir del pasaje 6 cuando las células MEF en PESO fueron negativas para la actividad de SA-β-gal y fueron contractuales en morfología (Figs. 3 B y SI Fig. 11). Las células Cdc42GAP−/− MEF comenzaron a desacelerarse en el crecimiento en los pasajes 5-7 cuando las células WT MEF coincidentes crecían exponencialmente (Fig. 3 C) (6), y se sometieron a senescencia replicativa masiva después del paso 7, mientras que la mayoría de las células WT MEF no alcanzaron la senescencia hasta el paso 13 (SI Fig. 11 y no se muestran los datos). Además, un porcentaje significativamente mayor de células Cdc42GAP / MEF en el paso 7 formaron focos más grandes en el núcleo que las células WT (SI Fig. 12). Estos resultados indican que la deficiencia de Cdc42GAP induce la senescencia temprana de tejidos / células.

Un factor bien reconocido que contribuye al envejecimiento prematuro de los mamíferos y a la senescencia celular es el aumento de la inestabilidad genómica (15). El análisis de diseminación de metafase mostró que >el 30% de los esplenocitos primarios de ratones homocigotos de 8 meses de edad eran aneuploides, mientras que los esplenocitos de PESO emparejados por edad y sexo no tenían aneuploidía detectable (Fig. 3 D), indicando que el tejido Cdc42GAP−/− sufrió inestabilidad genómica. En apoyo de este hallazgo, las células Cdc42GAP/ MEF mostraron un aumento significativo de células de doble núcleo bajo tinción DAPI en comparación con las células WT en el paso 7 (SI Fig. 12). El análisis cariotipo de los pasajes posteriores de las células MEF (pasaje 6-7) reveló además que, aunque la mayoría de los cromosomas de las células WT (≈80%) permanecieron intactos, el 42% de las células Cdc42GAP−/− contenían al menos una aberración cromosómica, el 20% contenía dos o más aberraciones y el 14% contenía tres o más aberraciones (Fig. 3 E). El porcentaje y el grado de aneuploidía también aumentaron significativamente en las células Cdc42GAP−/− MEF, con >el 32% de las células presentaban números cromosómicos anormales que oscilaban entre 72 y 102, mientras que la mayoría de las células WT eran diploides (Fig. 3 E y SI Fig. 13). El análisis cariotipo de los daños cromosómicos indica que las aberraciones de las células homocigotas MEF fueron diversas, incluyendo rotura de cromátidas, separación prematura de cromátidas hermanas (un sello distintivo de un punto de control de ensamblaje de huso defectuoso), translocación, rotura de cromosomas, cromosoma dicéntrico y fragmentación de cromosomas (Fig. 3 F y SI Tabla 2), lo que sugiere que la maquinaria de reparación de daños en el ADN está comprometida en las células Cdc42GAP -/ -. La tinción inmunofluorescente de fosfoh2 AX en el núcleo celular, un marcador de respuesta al daño del ADN (16), muestra que, aunque el 10% de las células Cdc42GAP−/− MEF del pasaje 7 fueron positivas para el marcador de daño del ADN, <el 1% de las células WT fueron positivas (Fig. 3 G). La correlación entre el inicio y la progresión de los fenotipos similares al envejecimiento de los ratones Cdc42GAP/-y el grado y la gravedad observados de las aberraciones genómicas en las células Cdc42GAP / − apoya un papel de Cdc42 en el desarrollo de las características progeroides.

Para determinar el posible mecanismo de los daños acumulados en el ADN de las células Cdc42GAP−/−, comparamos el nivel de especies reactivas endógenas de oxígeno (ROS) de las células homocigotas con el de las células WT, porque Rac1 y Rac2, dos GTPasas Rho estrechamente relacionadas, son reguladores conocidos de las ROS celulares (17). SI Fig. 14 muestra que las células Cdc42GAP−/− mostraron una actividad ROS similar a la de las células WT, lo que indica que Cdc42GAP regula la estabilidad genómica a través de un mecanismo endógeno independiente de ROS. Debido a las similitudes de múltiples fenotipos Cdc42GAP−/− de ratón con los de una serie de modelos de ratones dirigidos a genes de moléculas de reparación de daños en el ADN, incluidos los modelos de ratones Brca1−/−p53+/−, Ku80−/− y Mtr−/−Wrn (12, 18, 19), investigamos más a fondo la capacidad de respuesta de las células Cdc42GAP−/− pasadas tempranas a varios agentes de daño en el ADN. En el ensayo de crecimiento de respuesta al daño del ADN, las células con deficiencia de Cdc42GAP mostraron un amplio defecto en la actividad de reparación del daño del ADN (Fig. 4), que se manifestó como porcentajes significativamente más altos de muerte celular entre las células homocigotas en comparación con las células WT después del tratamiento mediante el aumento de dosis de H 2O2, irradiación ionizante, camptotecina, sulfonato de metil-metano o mitomicina C. Por lo tanto, las diversas anomalías genómicas acumuladas encontradas en los pasajes posteriores de las células Cdc42GAP−/− pueden atribuirse, al menos en parte, a las actividades de reparación de daños al ADN deterioradas.

Una consecuencia del daño genómico sostenido en las células es la inducción de múltiples genes de respuesta al daño del ADN y/o de senescencia (20, 21). Las expresiones de p53, p21Cip1, p16INK4a y phospho-p53 (Ser-15) en células Cdc42GAP−/− MEF fueron significativamente más altas que las de células WT MEF después de pasajes similares, mientras que p19ARF en las células homocigotas mostró una tendencia similar de aumento con pasajes, como las células WT (Fig. 5 A). Los niveles de proteína de p53, p21Cip1, p16INK4a, phospho-p53 (Ser-15) y el marcador de daño del ADN phospho− H2 AX en tejidos Cdc42GAP−/-de ratones de 8 meses de edad también fueron significativamente más altos que los de los tejidos correspondientes de ratones con PESO compatible (Fig. 5 B). Estos resultados proporcionan evidencia de que la activación de la vía regulada por p53, p21Cip1 y p16INK4a en particular, está asociada con la senescencia temprana inducida por deficiencia de Cdc42GAP. Para examinar la cuestión de si la actividad elevada de Cdc42 en las células con deficiencia de Cdc42GAP es suficiente para explicar el fenotipo de senescencia temprana, expresamos un mutante activador de Cdc42, Cdc42F28L, en células MEF de peso primario y analizamos la actividad SA-β-gal de las células en comparación con la de células que expresan EGFP coincidentes en diferentes pasajes. La expresión de Cdc42F28L causó un aumento significativo en la población de células SA-β-gal positivas (35% en células Cdc42F28L en comparación con 7% en células que expresan EGFP) en células MEF pasadas tempranas (Fig. 5 C), indicando que la activación de Cdc42 es suficiente para la inducción de la senescencia celular temprana.

Para explorar más a fondo la posibilidad de que el fenotipo senescente de las células Cdc42GAP−/− pudiera ser rescatado por un defecto p53, generamos ratones Cdc42GAP+/−p53+/− e intentamos preparar células MEF del mestizaje. De 44 embriones, se obtuvieron seis con el genotipo Cdc42GAP−/−p53+/− y ninguno de los genotipos Cdc42GAP−/−p53−/−. Las células Cdc42GAP−/−p53+/− MEF crecieron a una velocidad entre la de las células p53+/− y las células WT y mostraron una población senescente basal comparable con la de las células p53+/− o WT en el paso 7, mientras que las células p53−/− y Cdc42GAP−/− MEF proliferaron con una curva lineal y una curva de duplicación de la población de flexión y fueron resistentes a la senescencia y propensas a la senescencia en pasajes similares, respectivamente (Fig. 5 D y E). Estos resultados indican que la senescencia prematura inducida por activación de Cdc42 depende de p53.

La vida útil limitada de las células y los animales puede ser el resultado de la senescencia replicativa en respuesta a diversas tensiones, incluidos el daño al ADN (22), la erosión de los telómeros (23), ROS (24) y/o oncogenes activados inadecuadamente (25). Los ratones Cdc42GAP−/− presentan un modelo animal de ganancia de actividad de Cdc42 que imita la activación mitogénica de Cdc42 inducida por señal (6) y permite evaluar los posibles efectos de la activación de Cdc42 en la fisiología animal y celular. Demostramos que la deficiencia de Cdc42GAP causa el inicio temprano de la senescencia en las células y fenotipos prematuros similares al envejecimiento en el animal. En particular, la focalización del gen Cdc42GAP induce un aumento global de la actividad de Cdc42 y promueve la inestabilidad genómica celular con una capacidad reducida de reparación del daño del ADN, que a su vez puede activar p53 y p16 Ink4a, lo que conduce a una senescencia temprana (Fig. 5 F). Anteriormente, se ha encontrado que el Cdc42 se activaba en células senescentes para modular el ajuste morfológico (26). También se ha propuesto que esté involucrado en el cambio morfológico celular regulado por p53, la apoptosis y la proliferación (27-29) y en la apoptosis controlada por cinasa N-terminal c-Jun (30, 31), eventos que se han asociado con la senescencia celular y el envejecimiento animal (32, 33). Nuestros hallazgos de que la activación de Cdc42 está asociada con el envejecimiento natural y que la deficiencia de Cdc42GAP causa un defecto de reparación de daños en el ADN para permitir que las células acumulen anomalías genómicas que conducen a la senescencia temprana sugieren un vínculo funcional entre la actividad de Cdc42 y el envejecimiento de los mamíferos.

Se ha demostrado que la activación de la vía p53 o la interrupción de genes involucrados en la reparación de daños en el ADN o la regulación de la estabilidad genómica inducen el envejecimiento temprano en ratones (11, 12, 33, 34). De acuerdo con observaciones previas de que Cdc42 puede no estar involucrado en la regulación de las actividades de superóxido celular (17), encontramos que el daño acumulado del ADN en las células Cdc42GAP−/− no está asociado con la actividad de ROS porque las células homocigotas no muestran un aumento de la actividad de ROS. La deleción de Cdc42GAP causa una marcada reducción de la capacidad de reparación del daño del ADN en un amplio espectro, incluidas las respuestas al agente de reticulación del ADN y al inductor de rotura de doble cadena o de una sola cadena, lo que sugiere que la activación prolongada del Cdc42 puede amortiguar la capacidad de reparación del daño del ADN. La diversidad del daño genómico que se encuentra en las células Cdc42GAP−/− también es consistente con el impacto de un defecto de reparación del daño global del ADN. Las preguntas importantes que quedan por abordar incluyen qué determinantes moleculares específicos están involucrados en la reparación del daño del ADN regulado por Cdc42GAP y qué señales ascendentes causan un aumento de Cdc42-GTP durante el proceso normal de envejecimiento.