Resumen

Se ha desarrollado un método de inmunoabsorción enzimática quimioluminiscente directo y altamente específico (CL-ELISA) para monitorear el cloranfenicol (CAP) en cosméticos. El anticuerpo anticloranfenicol (mAb) adoptado en este trabajo para el inmunoensayo directo podría unirse específicamente al CAP, con reactividad cruzada insignificante (CR) (menos del 0,01%) con la mayoría de los análogos del CAP, incluidos el tianfenicol (TAP) y el florfenicol (FF) estructuralmente relacionados. El límite de detección (LOD), medido por IC10, fue de 0,0021 ng mL-1. El rango de detección (IC20-IC80) osciló entre 0,00979 y 0,12026 ng mL−1. En muestras de cosméticos enriquecidos, las recuperaciones medias oscilaron entre el 82,7% y el 99,6%, con variaciones intradiarias e intermedias inferiores al 9,8 y el 8,2%, respectivamente. Además, con la ayuda de mAb anti-CAP con etiqueta HRP, el método podría procesarse en modo de inmunorreacción directa rápida. Este método CL-ELISA podría aplicarse para la detección específica, rápida, semicuantitativa y cuantitativa de la TAPA en cosméticos, facilitando el control de calidad preciso de la contaminación de la TAPA.

1. Introducción

El cloranfenicol (CAP) es un miembro de la familia de agentes antibacterianos anfenicoles, producidos por estreptococos venezolanos (estructura mostrada en la Figura 1) . El cloranfenicol generalmente se realiza como un antibiótico de amplio espectro con actividad antimicrobiana efectiva. Por lo general, puede ser contra una variedad diseminada de bacterias Gram positivas y Gram negativas, incluidos los organismos anaeróbicos . Debido a la alta actividad, el cloranfenicol se aplica ampliamente en las industrias ganadera, acuícola y cosmética para la prevención y el tratamiento de infecciones bacterianas. En publicaciones recientes, se informó que el cloranfenicol se usaba para el tratamiento de la epifoliculitis, el acné y otras afecciones de la piel. El cloranfenicol también fue ampliamente adoptado en cosméticos como antiséptico para inhibir el crecimiento de microorganismos .

Figura 1.

Sin embargo, investigaciones recientes mostraron que los antibióticos anfenicólicos exhibían efectos adversos potenciales para la salud humana . Por lo tanto, las aplicaciones de cloranfenicol están prohibidas en muchos países, incluidos los miembros de la UE, Estados Unidos y China . Aunque existen regulaciones oficiales para estos antibióticos, el cloranfenicol todavía se agrega ilegalmente a los cosméticos, debido a su bajo costo y excelente efecto antibacteriano. Con el fin de garantizar la seguridad de los cosméticos y mantener la salud humana, es emergente desarrollar métodos sensibles, confiables y disponibles para la detección de cloranfenicol a niveles de rastreo en muestras de cosméticos.

Se notificaron numerosos métodos analíticos para la detección de NAC y antibióticos relacionados, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) . Sin embargo, estos métodos requieren principalmente instrumentos costosos, procedimientos complicados de pretratamiento y personal bien entrenado, y no eran adecuados para el cribado rápido de un gran número de muestras. Se adoptaron inmunoensayos basados principalmente en el reconocimiento específico de anticuerpos y antígenos para el cribado rápido y de alto rendimiento de los analitos diana. El sustrato quimioluminiscente con carácter de alta sensibilidad podría emplearse en una plataforma de ensayo inmunoabsortivo ligado a enzimas quimioluminiscentes directas (CL-ELISA). En comparación con los protocolos colorimétricos convencionales, la sensibilidad de los inmunoensayos podría mejorarse al menos de 2 a 3 veces con quimioluminiscente como sustrato.

Las publicaciones anteriores sobre la detección de inmunoensayos de NAC no pueden distinguir a NAC de sus análogos de la familia de los anfenicoles (Figura 1), incluidos el tianfenicol (TAP) y el florfenicol (FF), debido a los anticuerpos específicos de gran amplitud . En estas investigaciones, es difícil determinar si la TAPA de contaminación, sus análogos, o la suma de ellos cuando un resultado positivo. En esta investigación, empleamos un anticuerpo monoclonal anti-CAP de alta especificidad (mAb) que puede unirse a la especificidad de la CAP y valores insignificantes de RC para la mayoría de los análogos probados. Sobre la base de este mismo mAb, se desarrolló un método CL-ELISA altamente específico y directo para la determinación de trazas de GORRO en cosméticos. Este protocolo desarrollado no necesita una compleja reacción de conjugación indirecta con un anticuerpo secundario marcado con HRP. Con sustrato quimioluminiscente, la sensibilidad podría mejorarse significativamente (diagrama esquemático que se muestra en la Figura 2). Con el uso de mAb anti-CAP marcado con HRP, el ensayo se realizó en modo de inmunorreacción directa rápida sin procedimientos complejos de inmunorreacción. Este método CL-ELISA se puede aplicar para la detección específica, rápida, semicuantitativa y cuantitativa de GORRO en cosméticos, y este trabajo contribuirá al control de calidad y la regulación de GORRO.

Figura 2

2. Materiales y Métodos

2.1. Los productos químicos y reactivos

Cloranfenicol (CAP), ciprofloxacina (CIP), florfenicol, (FF), penicilina (PEN), ractopamina (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiazina (SUL) y tianfenicol (TAP) se compraron a Sigma Aldrich (99% de pureza, St.Louis, MO, EE. UU.). El antígeno conjugado con CAP y el anticuerpo NAC marcado con HRP se obtuvieron de ZeYang Co. (Beijing, China). La solución de sustrato de quimioluminiscencia supersignal se compró a Thermo Fisher (EE.UU.). El sistema de síntesis Milli-Q se obtuvo de Millipore (Bedford, MA, EE. UU.) para la purificación de agua. Otros reactivos (de grado analítico) se compraron a Beijing Reagent Corp. (Beijing, China).

2.2. Equipo e instrumentación

Placas de microtitulación de poliestireno blanco opaco de 96 pocillos (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) se utilizaron en este trabajo. El lector de microplacas SpectraMax M5 se obtuvo de Dispositivos Moleculares (CA, EE. UU.). La centrífuga MIKRO 22R se obtuvo de Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Alemania).

2.3. Tampones y soluciones

Para este ensayo CL-ELISA desarrollado, se prepararon diferentes tampones y soluciones para el inmunoensayo.

Solución salina tampón fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4): se disolvieron 8,0 g de NaCl, 2,9 g de Na2HPO4, 0,2 g de KH2PO4 y 0,2 g de KCl en 1 L de agua desionizada.

Tampón de bloqueo (pH 7,4): 0,5% de caseína en 0,01 M PBS.

Tampón de revestimiento (pH 9,6): 1,59 g de Na2CO3 y 2,93 g de NaHCO3 se disolvieron en 1 L de agua desionizada.

Tampón de dilución enzimática (pH 7,4): suero fetal bovino al 5% en 0,01 M PBS.

Tampón de lavado (PBST): 0,01% Interpolación-20 en 0,01 M PBS.

2.4. Procedimiento ELISA quimioluminiscente competitivo (CL-ELISA)

Se adoptaron placas de microtiter de poliestireno blanco opaco de 96 pocillos para la reacción de inmunoensayo. Se disolvieron 100 µL de antígeno conjugado con TAPA en tampón de revestimiento a una concentración final de 0,00042 ng mL-1 que se añadió e incubó a 4°C durante 20 h para revestimiento. Después del lavado con tampón de lavado tres veces, se añadió tampón de bloqueo (150 µL por pocillo) a cada pocillo y se incubó para ocupar el exceso de sitios activos a 37°C durante 1,5 h. Las placas recubiertas se almacenaron a 4°C antes de su uso.

Para el análisis de la TAPA, las placas de microtitulación recubiertas se preacondicionaron a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, se añadieron sucesivamente a cada pocillo 30 µL de muestras procesadas o patrón de TAPA y 70 µL de anticuerpo anti-TAPA marcado con HRP (2,46 ng mL-1) diluido por tampón de dilución enzimática. Las placas se incubaron a 37°C durante 30 minutos para una reacción competitiva directa. Después de lavar la placa con tampón de lavado cinco veces, se añadió una solución de sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal (100 µL/pocillo) y se midió la intensidad de quimioluminiscencia de cada pocillo con un lector de microplacas SpectraMax M5.

2.5. Curva estándar

Se probaron diez niveles de concentración diferentes para la evaluación de las curvas de calibración. La concentración más alta fue de 1000 ng mL-1, y las siguientes concentraciones se diluyeron en serie en un tercio de la anterior. Cada concentración se realizó en tres veces de acuerdo con el protocolo CL-ELISA.

B / B0 se define para la relación de quimioluminiscencia de los resultados. Aquí, B representa la intensidad de quimioluminiscencia de diferentes concentraciones estándar de la TAPA, y B0 representa la intensidad de quimioluminiscencia sin la TAPA estándar en cada prueba.

Las curvas estándar se evaluaron trazando B / B0 a diferentes concentraciones estándar de la TAPA y ajustando los datos a la siguiente ecuación logística de cuatro parámetros utilizando Origin (versión 7.5, OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.): En esta ecuación, A significa la asíntota superior (relación de quimioluminiscencia B/B0 sin estándar de la TAPA). B es la pendiente de la curva en el punto de inflexión. C, que representa el 50% de la absorbancia máxima, es el valor X en el punto de inflexión. Y D es la asíntota inferior (señal de fondo).

2.6. Preparación de muestras para Análisis CL-ELISA

Las muestras de cosméticos (2,00 g ± 0,02 g) se pesaron con precisión y se transfirieron a tubos centrífugos de polipropileno de 50 ml. Luego, se agregaron 20 ml de PBS y se vortearon durante 30 s, y luego ultra sonicación durante 3 minutos para la extracción de la TAPA. Cada muestra se centrifugó a 12000 g durante 10 min a 4°C, y el sobrenadante se recogió y filtró a través de una membrana de 0,22 µm. Se añadieron treinta alícuotas de microlitros del sobrenadante de cada muestra a una placa recubierta de 96 pocillos para su análisis de acuerdo con el procedimiento CL-ELISA desarrollado.

2.7. Precisión y Precisión

Las muestras de cosméticos de loción de imprimación negativa fueron confirmadas previamente por análisis UPLC-MS / MS. Luego, cada muestra fue enriquecida con TAPA estándar en tres concentraciones diferentes de 5, 20 y 100 ng L−1. El análisis se procesó de acuerdo con el protocolo CL-ELISA desarrollado con cinco réplicas cada una (n = 5). Las concentraciones de las muestras se calcularon de acuerdo con la curva de calibración, y la exactitud y precisión se evaluaron sobre la base de las recuperaciones de todas las muestras.

3. Resultados y Discusión

3.1. Especificidad del ensayo

La especificidad del método se evaluó mediante la evaluación del grado de reactividad cruzada (RC) con compuestos estructuralmente relacionados de CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL y TAP. Los valores de RC se evaluaron con la siguiente ecuación:En esta ecuación, IC50 es la concentración inhibitoria media máxima de una sustancia. Los resultados de especificidad del aBm anti-CAP se muestran en la Tabla 1. A partir de los resultados, se obtuvieron valores insignificantes de RC (menos del 0,01%) para todos los análogos investigados en esta investigación, incluidos los TAP y FF más relacionados con la estructura. Se puede concluir que este ensayo CL-ELISA desarrollado podría aplicarse para la detección específica de CAP.

3.2. Optimización del procedimiento CL-ELISA

La relación antígeno / anticuerpo en un sistema de reacción competitivo influye significativamente en la inmunorreacción. En este protocolo CL-ELISA, se evaluó y optimizó la relación antígeno / anticuerpo. Antígeno anticuerpo ratios de 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, y 30:70 fueron investigados. Los resultados se optimizaron de acuerdo con IC50 y RLUmax (unidades de luz relativa máxima) y se muestran en la Tabla 2. El valor de CI50 aumentó significativamente con el aumento de la proporción de anticuerpos. Cuando la relación antígeno / anticuerpo fue de 70:30, se obtuvo el resultado más sensible con el valor CI50 más bajo. Además, una alta proporción de anticuerpos condujo a un alto valor de RLUmax. Sin embargo, para las relaciones antígeno / anticuerpo analizadas, todos los valores de ULR fueron adecuados para la detección de NAC. Debido a la alta sensibilidad del sustrato quimioluminiscente, no hubo diferencia aparente del valor de RLUmax. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. La sensibilidad

IC50, LOD (medido por IC10) y el rango de detección (IC20−IC80) se obtuvieron a partir de la curva de calibración sigmoidal para evaluar la sensibilidad del protocolo CL-ELISA propuesto (Figura 3). En esta investigación, LOD fue 0.0021 ng mL−1, mientras que el valor de IC50 se 0.016 ng mL−1 para la TAPA. El rango de detección de este método fue de 0,00979 a 0,12026 ng mL-1. En comparación con los inmunoensayos establecidos, este método mostró una mayor sensibilidad y un menor LOD para NAC .

Figura 3

3.4. Exactitud y precisión

Para la investigación de exactitud y precisión, se calcularon primero las recuperaciones de NAC en muestras fortificadas. Y la exactitud y precisión se evaluaron con cinco réplicas cada una en tres días de validación. En tres niveles fortificados de 5, 20 y 100 ng L−1, las recuperaciones medias de la TAPA en muestras de cosméticos con loción de imprimación con púas oscilaron entre el 82,7% y el 99,6%. La variación intradiaria e intradiaria fue inferior al 9,8% y al 8,2%, respectivamente (los resultados se muestran en la Tabla 3).

4. Conclusiones

En esta investigación, se desarrolló un novedoso y altamente sensible método CL-ELISA para la detección de capuchones en cosméticos. El mAb utilizado en el ensayo mostró una alta especificidad a CAP con valores de RC insignificantes para sus análogos, especialmente para la mayoría de los TAP y FF relacionados con la estructura. Sobre la base de este mismo mAb, el método CL-ELISA propuesto podría aplicarse específicamente para la detección de CAP en lugar de mezclas de CAP y otros análogos. Este es el primer informe de un CL-ELISA para la determinación de la TAPA en cosméticos. El LOD del método fue de 0,0021 ng mL-1, la CI50 fue de 0,016 ng mL−1 y el rango de detección fue de 0,00979 a 0,12026 ng mL−1. En muestras de cosméticos enriquecidos, las recuperaciones medias oscilaron entre el 82,7% y el 99,6%, con variaciones intradiarias e intermedias inferiores al 9,8% y el 8,2%, respectivamente. El ensayo ofrece las ventajas de una alta especificidad, simplicidad, tiempos de análisis rápidos y rentabilidad. Con respecto a su sensibilidad y especificidad, el método CL-ELISA desarrollado es superior a la mayoría de los inmunoensayos notificados para la detección de NAC. Se puede concluir que este método CL-ELISA desarrollado podría aplicarse para la detección específica, rápida, semicuantitativa y cuantitativa de la NAC en cosméticos.

Disponibilidad de los datos

Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio están disponibles a solicitud del autor correspondiente.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a LetPub (www.letpub.com) para proporcionar asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Programa Clave Nacional R&D de China (n. o 2017YFE0110800), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. o 31871718) y la acción de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la UE (n. o 727864-EU-China-Safe).