Utilización de análogos de ATP por CDK diseñados
Generamos CDK mutantes ‘Shokat’ que contienen intercambios de aminoácidos en un residuo voluminoso conservado en sus bolsas de unión de ATP. En el caso de CDK2 y CDK3, este fue un intercambio de fenilalanina a alanina en la posición 80, designada CDK2 (F80A). También sintetizamos 12 análogos de ATP para determinar si los CDK diseñados pueden usar estos análogos para fosforilar la proteína de Retinoblastoma recombinante (Rb) in vitro, y encontramos que utilizaron N6-(2-feniletil)-ATP (PE-ATP) de la manera más eficiente (Figura 1a, y no se muestran datos). Aunque tanto el tipo salvaje como la ciclina E-CDK2 (F80A) usaban ATP normal para fosforilar la proteína glutatión-S-transferasa (GST)-Rb, solo la quinasa F80A podía usar PE-ATP. Se obtuvieron resultados similares con la ciclina E-CDK3, pero en este caso el mutante F80A ya no podía usar ATP normal, aunque la base estructural para esta observación no está clara (Figura 1a). Estos estudios confirmaron que las quinasas de tipo silvestre y de ingeniería exhiben las especificidades deseadas de ATP.
la Caracterización de la ingeniería de las CDKs. a) Los complejos de ciclina E-CDK2/3, o sus homólogos diseñados con F80A (indicados con asteriscos), se inmunoprecipitaron a partir de lisados de células U2OS transfectados a través de la etiqueta HA en la subunidad CDK y se sometieron a ensayos de quinasas in vitro con 10 µM de ATP normal o análogo de PE-ATP. La fosforilación de GST-Rb se monitorizó mediante inmunoblot con un anticuerpo fosfoespecífico anti-pS780-Rb (New England Biolabs). Las quinasas de tipo salvaje no pueden usar PE-ATP. b) Cromatografía de capa delgada: el análisis revela hidrólisis de ATP en el lisado celular y transferencia a nucleótidos aceptores (izquierda). Se indican las posiciones del fosfato libre y del ATP. Por el contrario, el ATP-γ-S no se hidroliza en lisados celulares (derecha). c) Se realizaron ensayos de quinasa utilizando complejos de tipo natural y ciclina A-CDK2 (F80A) purificados de E. coli y GST-Rb en presencia de 200 µM de ATP, ATP-γ-S y PE-ATP-γ-S a temperatura ambiente durante 2 h. Las reacciones de quinasa se analizaron mediante electroforesis en gel SDS y se visualizaron mediante tinción de Coomassie. La extensión de la fosforilación de GST-Rb fue monitoreada por el desplazamiento de electromovilidad de GST-Rb.
Mientras que los CDK mutantes utilizaron eficientemente PE-ATP para fosforilar Rb in vitro, experimentos similares que utilizaron PE-ATP radiomarcado en lisados celulares fracasaron porque el fosfato marcado fue escindido de PE-ATP por una actividad ATPasa en los lisados (datos no mostrados). Por lo tanto, cambiamos a la forma de tiofosfato del análogo de ATP (PE-ATP-γ-S), que no fue hidrolizado por lisados (Figura 1b). Aunque las quinasas a menudo usan ATP-γ-S de manera menos eficiente que el ATP normal, la tiofosforilación tiene varias ventajas en este contexto. En primer lugar, los tiofosfatos son más estables y resistentes a las fosfatasas . En segundo lugar, dado que no hay eventos de tiofosforilación preexistentes en las células, el etiquetado de tiofosfato proporciona marcadores únicos para las proteínas fosforiladas por la quinasa mutante. Finalmente, el grupo tiofosfato tiene propiedades químicas similares a las del grupo sulfhidrilo y es susceptible de modificaciones químicas. Expresamos y purificamos complejos solubles de tipo salvaje y ciclina A-CDK2 (F80A) de bacterias y llevamos a cabo un ensayo de quinasa Rb similar para probar su capacidad de usar PE-ATP-γ-S. Como se muestra en la Figura 1c, aunque ambas quinasas pueden usar ATP o ATP-γ-S para fosforilar la proteína GST-Rb (como lo indica su cambio de electromovilidad), solo el mutante F80A puede usar PE-ATP-γ-S. Por lo tanto, usamos PE-ATP-γ-S para todos nuestros estudios posteriores.
Purificación en un solo paso de péptidos tiofosforilados
El uso de análogos de CDK y ATP diseñados facilita la fosforilación de sustratos altamente específicos: el siguiente desafío es cómo identificarlos dentro de un lisado complejo. Buscamos utilizar las etiquetas de tiofosfato para capturar y enriquecer covalentemente los péptidos tiofosforilados después de la fosforilación y digestión de los lisados. Sin embargo, un problema clave fue distinguir químicamente los tiofosfopéptidos y los péptidos que contienen cisteína. Aunque se ha descrito un método quimioselectivo para enriquecer tiofosfopéptidos, la abrumadora abundancia de residuos de cisteína en una mezcla compleja de proteínas dificulta este enfoque . Utilizamos un método simple de captura y liberación para aislar selectivamente péptidos tiofosforilados dentro de lisados celulares tripsinizados (Figura 2a). Las proteínas dentro del lisado se fosforilaron in vitro con ciclina A-CDK2 (F80A) y PE-ATP-γ-S. La mezcla de proteínas se digirió posteriormente y los péptidos resultantes se mezclaron con Tiopropil Sepharosa 6B , una resina de disulfuro activada que captura tanto péptidos que contienen cisteína como tiofosfopéptidos a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Debido a que la elución tradicional de ditiotreitol (TDT) libera ambos tipos de péptidos unidos, utilizamos las diferencias cualitativas entre los péptidos de tiofosfato unidos a resina y los péptidos que contienen cisteína en el enlace de sulfuro de fosforotiolato y el enlace de sulfuro de alquilo, respectivamente. A valores de pH altos, el enlace del sulfuro de fosforotiolato se hidroliza y el sulfuro alquilo permanece intacto . El tratamiento de la resina con una base fuerte (como el hidróxido de sodio) libera específicamente tiofosfopéptidos (y también los convierte en fosfopéptidos normales), pero no los péptidos que contienen cisteína, hidrolizando el enlace fosforotiolato sulfuro (Figura 2b). Debido a que los péptidos unidos a través de cisteína no se elutan en el paso final, no podemos recuperar los tiofosfopéptidos que contienen cisteína. Además, la elución da lugar a la pérdida de la firma de tiofosfato al convertir el tiofosfopéptido en fosfopéptido. Nuestro método de aislamiento de tiofosfopéptidos difiere modestamente del de Blethrow et al. en el sentido de que capturamos los tiofosfopéptidos utilizando química de intercambio de disulfuro (resina de disulfuro) en lugar de alquilación (resina de yodoacetamida), y los elutamos selectivamente con hidrólisis de base en lugar de oxidación.
un Solo paso de purificación de thiophosphopeptides. a) Esquema general para el aislamiento de tiofosfospéptidos. Las proteínas fueron etiquetadas con ciclina A-CDK2 (F80A) y PE-ATP-γ-S y sometidas a digestión triptica. Los péptidos resultantes se mezclaron con perlas de disulfuro, que capturan tanto tiofosfopéptidos como péptidos que contienen cisteína. Las perlas se trataron con una solución básica para liberar selectivamente solo los fosfopéptidos. b) La química subyacente a la selectividad de los tiofosfopéptidos. Tanto las mitades de tiofosfato como de cisteína contienen grupos tioles reactivos que pueden ser capturados covalentemente por perlas de disulfuro. A valores de pH altos, los enlaces de sulfuro de fosforotiolato (cerca de la flecha superior) se hidrolizan para permitir la liberación de los péptidos unidos a las perlas, mientras que los enlaces de sulfuro de alquilo (cerca de la flecha inferior) son estables y, por lo tanto, los péptidos se retienen en las perlas. Tenga en cuenta que durante la hidrólisis del enlace fosforotiolato sulfuro, el tiofosfato se convierte en fosfato normal.
Para probar la viabilidad de este enfoque, fosforilamos GST-Rb con ciclina A-CDK2 (F80A) y PE-ATP-γ-S, y aplicamos nuestro procedimiento de purificación a una tripsina digerida de la mezcla de reacción. Los péptidos aislados se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem electrospray (ESI-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masas de trampa de iones. Los péptidos se identificaron haciendo coincidir los espectros de masa en tándem con una base de datos de secuencias de proteínas humanas (con la secuencia GST-Rb agregada) utilizando el software SEQUEST . El sustrato GST-Rb contiene cinco cisteínas, así como siete sitios SP/TP, que son sitios favorecidos para la fosforilación de CDK . Recuperamos múltiples fosfopéptidos que contenían solo y todos los sitios de fosforilación esperados (Tabla 1). Además, no recuperamos péptidos que contengan cisteína y muy pocos péptidos inespecíficos. Esto proporcionó una prueba de principio para nuestros ensayos a gran escala.
Identificación de sustratos humanos de ciclina A-CDK2 en lisados celulares
Nuestro objetivo era identificar Sustratos A-CDK2 a escala proteómica. Para reducir la complejidad de la muestra, fraccionamos el lisado celular completo de células HEK293 en 11 fracciones utilizando cromatografía de intercambio iónico y precipitación de sulfato de amonio (Archivo de datos adicional 1). A continuación, realizamos ensayos de cinasa in vitro en cada fracción. Como control positivo, también agregamos una pequeña cantidad de GST-Rb a cada reacción. Después de digerir la mezcla de reacción con tripsina, aplicamos nuestro protocolo de purificación para aislar los tiofosfopéptidos de las mezclas de péptidos. Los péptidos recuperados se sometieron a cromatografía líquida – análisis MS / MS y búsqueda en bases de datos. Recuperamos diversos números de péptidos y al menos un fosfopéptido Rb de cada una de las fracciones de lisado (archivo de datos adicional 2).
CDKs fosforilan proteínas de forma dirigida a prolina en serina o treonina, y numerosos estudios apoyan la idea de que el motivo S/T-P-X-R/K representa el motivo de consenso de CDK. A partir de los fosfopéptidos identificamos un total de 203 proteínas: 180 candidatos fueron fosforilados dentro de motivos SP o TP (dirigidos a prolina; Archivo de datos adicional 3). Estos sustratos candidatos representan una amplia gama de procesos biológicos, incluido el control del ciclo celular, el metabolismo del ADN y el ARN, la traducción y las estructuras celulares (Figura 3). Un total de 96 de 222 (43%) de los sitios dirigidos a prolina se ajustaron al consenso conocido de CDK (con un residuo cargado positivamente en la posición +3). Curiosamente, alrededor del 24% de los sitios dirigidos a prolina (53/222) contenían un residuo cargado positivamente en las posiciones +4 o +5, lo que sugiere que este motivo también puede ser favorecido por CDK2. De hecho, Blethrow et al. también se observó que un número sustancial de sustratos de ciclina B-CDK1 contienen sitios no consensuados. Para los péptidos que contenían sitios no consensuados, encontramos que alrededor del 50% de las proteínas correspondientes llevaban al menos un motivo K/RXLφ o K/RXLXφ (donde φ es un residuo hidrofóbico grande y X es cualquier aminoácido) distal a los sitios de fosforilación, y casi todos ellos llevaban al menos un motivo RXL mínimo (Archivo de datos adicional 3). Esto es consistente con la idea bien establecida de que estos motivos promueven la unión de la ciclina A-CDK2 a los sustratos . Además de seleccionar fosforilaciones con motivos de consenso de CDK, identificamos 28 proteínas que han sido previamente implicadas como sustratos de CDK (marcadas en negrita en el archivo de datos Adicional 3) . Por lo tanto, casi el 15% de nuestros candidatos se han encontrado previamente como objetivos CDK, lo que respalda aún más la idea de que nuestros métodos se capturan y enriquecen para sustratos CDK2. Finalmente, el 43% de las fosforilaciones que encontramos han sido identificadas previamente en análisis de fosfoproteomas in vivo a gran escala, lo que indica que estas fosforilaciones no se limitan a nuestras condiciones de lisado .
Clasificación de las proteínas por categoría funcional. Los números indican proteínas identificadas en cada categoría.
Tanto en nuestros estudios y los reportados por Blethrow et al. se utilizaron esquemas de aislamiento de fosfopéptidos similares y ciclinas-CDK relacionadas, y anticipamos que podría haber una superposición sustancial en los sustratos revelados por ambos estudios. De hecho, encontramos casi el 50% (30/68) de los sustratos de ciclina B-CDK1 en nuestra lista de candidatos a ciclina A-CDK2; por lo tanto, estos métodos son robustos y reproducibles (archivo de datos adicional 4). Sin embargo, también hay diferencias sustanciales entre las dos listas, y es probable que sean el resultado de muchos factores, incluidas las diferencias de procedimiento, los diferentes tipos de células, la identificación incompleta de péptidos por EM y la especificidad del sustrato conferida por las subunidades de ciclina y/o quinasa. Algunas de estas diferencias también pueden reflejar las diferentes funciones biológicas de la ciclina A-CDK2 y la ciclina B-CDK1. Por ejemplo, encontramos nueve proteínas involucradas en la traducción de proteínas y/o en la función de los ribosomas, pero ninguna de estas proteínas se encontró con la ciclina B-CDK1, a pesar de su abundancia relativamente alta.
Aunque identificamos una serie de sustratos de CDK2 conocidos, no identificamos algunos sustratos de CDK2 previamente descritos. Algunos de los factores enumerados anteriormente también pueden explicar el fracaso en encontrar sustratos CDK2 conocidos en nuestros análisis. Además, los sustratos ya fosforilados por CDK endógenos no habrían sido tiofosforilados in vitro. También es posible que algunas proteínas no eran solubles durante el lisado de preparación y/o la etapa de sonicación y excluido de nuestro análisis. Finalmente, es posible que los complejos proteicos grandes hayan sido interrumpidos por los procedimientos de fraccionamiento antes de la reacción de la quinasa, y que las proteínas que son fosforiladas por CDK2 solo en el contexto de estos complejos no puedan ser descubiertas por nuestros métodos.
También recuperamos cuatro fosfopéptidos correspondientes a ciclina A y CDK2 y 27 fosfopéptidos adicionales con sitios no dirigidos a prolina (archivo de datos adicional 5). Sospechamos que estos fosfopéptidos eran el resultado de la fosforilación automática de la ciclina A-CDK2 y la fosforilación de fondo por otras quinasas, y otros han reportado fosforilación de fondo similar . Para probar estas posibilidades, realizamos una reacción de cinasa de control utilizando ciclina A-CDK2 (F80A) y PE-ATP-γ-S sin lisado celular añadido y recuperamos tres de los cuatro péptidos de ciclina A-CDK2 (archivo de datos adicional 5). Además, cuando realizamos una reacción similar de «solo quinasa» en presencia de γ-32P-ATP, observamos la incorporación de 32P en ambas proteínas de manera dependiente de la dosis (Archivo de datos adicional 6). Estos experimentos confirmaron que había auto-fosforilación de fondo de ciclina A-CDK2 en los ensayos originales.
También realizamos reacciones de quinasa de control utilizando fracciones de lisado, GST-Rb ‘spike-in’ y PE-ATP-γ-S sin la adición de ciclina A-CDK2. Estas reacciones de control «sin quinasa» fosforilaron 7 de los 27 fosfopéptidos no dirigidos a prolina en nuestra lista (archivo de datos adicional 5), lo que sugiere que la mayoría, si no todos, de estos fosfopéptidos resultaron de la fosforilación de fondo por quinasas que son capaces de usar el análogo de ATP en un grado limitado. Por ejemplo, la mayoría de estos péptidos contienen sitios de fosforilación dirigidos a residuos ácidos que son motivos de caseína quinasa 2. La caseína quinasa 2 es única en el sentido de que puede utilizar GTP y ATP; por lo tanto, el sitio activo puede acomodar los análogos voluminosos de ATP, como el PE-ATP . Es importante destacar que no recuperamos ningún fosfopéptido Rb de estos experimentos de control, lo que indica que no hubo actividad CDK inespecífica en nuestros ensayos. También recuperamos 44 péptidos no modificados, 12 de los cuales contenían residuos de cisteína. La mayoría de estos péptidos se originaron a partir de varias fracciones de lisados (archivo de datos adicional 2). Sospechamos que estos fueron el resultado de la unión inespecífica de bajo nivel de péptidos a la resina a pesar de las estrictas condiciones de lavado, y en el caso de los péptidos que contienen cisteína, de una pequeña cantidad de hidrólisis del enlace de alquildisulfuro durante la etapa de elución. En resumen, nuestros métodos fueron altamente selectivos, y nuestros estudios identificaron un grupo sorprendentemente grande de sustratos candidatos de ciclina A-CDK2, la mayoría de los cuales no han sido identificados previamente como dianas CDK.
Validación de sustratos candidatos como objetivos de ciclina A-CDK2
Empleamos varias estrategias para validar algunos de los nuevos candidatos de nuestra lista como sustratos de ciclina A-CDK2. Debido a que nuestras identificaciones de proteínas se basaron en secuencias de péptidos, comenzamos confirmando que la ciclina A-CDK2 fosforiló tres candidatos nativos y de longitud completa que fueron inmunoprecipitados a través de etiquetas epitópicas de 293 células transfectadas (EF2, TRF2 y RAP1). Debido a que estas proteínas no estaban presentes en la lista de ciclina B-CDK1 , determinamos si también están fosforiladas por la ciclina B-CDK1. Cada candidato a CDK2 fue fosforilado tanto por ciclina A-CDK2 como por ciclina B-CDK1, aunque EF2 fue fosforilado en menor medida que TRF2 o RAP1 (Figura 4a). También expresamos TRF2, RAP1 y la proteína ribosómica RL12 como fusiones de GST y las purificamos de Escherichia coli. Cuando usamos ciclina A-CDK2 para fosforilar TRF2 y RAP1 in vitro, las proteínas estaban altamente fosforiladas, y los análisis de MS revelaron que estas fosforilaciones ocurrieron en los mismos sitios que identificamos inicialmente (Figura 4b). También utilizamos ciclina A-CDK2 y ciclina B-CDK1 para fosforilar GST-RL12, y encontramos que ambas CDK también fosforilaron RL12 in vitro (Figura 4c). Estos estudios confirman así que los péptidos identificados en nuestra pantalla representan proteínas que pueden ser fosforiladas por la ciclina A-CDK2, al menos in vitro. Aunque encontramos diferencias cualitativas en la capacidad de la ciclina A-CDK2 y la ciclina B-CDK1 para fosforilar proteínas específicas, en cada caso los candidatos fueron fosforilados por ambas CDK. Debido a que el preparado enzimático que utilizamos en estos estudios contenía un exceso de CDK2 libre (F80A), consideramos la posibilidad de que algunas fosforilaciones de sustrato pudieran ser el resultado de la asociación de ciclinas endógenas con CDK2 (F80A) que era monomérica o que podría haberse disociado de la ciclina A durante las condiciones del ensayo. Encontramos que la cantidad de actividad de ciclina B-CDK2 (F80A) en estos extractos era insignificante en comparación con la ciclina A-CDK2 (F80A), y no pudimos detectar ninguna actividad de ciclina E-CDK2 (F80A) (Archivo de datos adicional 7). Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que algunos péptidos puedan haber sido fosforilados por CDK2 (F80A) en complejo con una ciclina endógena, y la especificidad de cualquier sustrato candidato para la ciclina A frente a otras ciclinas que activan CDK2 debe validarse como se describe a continuación.
In vitro de validación de los selectivos candidato CDK2 sustratos. a) Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con vectores que expresaban EF2, TRF2 y RAP1 marcados con BANDERAS. Los inmunoprecipitados de anticuerpos anti-FLAG se fosforilaron in vitro con ciclina A-CDK2 o ciclina B-CDK1 en presencia de γ-32P-ATP (paneles superiores izquierdos). En reacciones paralelas, la histona H1 fue fosforilada como control para normalizar las actividades de la ciclina A-CDK2 y la ciclina B-CDK1 (panel derecho). «C» denota reacciones de «solo quinasa» sin sustratos transfectados (panel izquierdo) y reacción de «sin quinasa» (panel derecho). Las muestras de proteínas se separaron por una PÁGINA de SDS y los geles se transfirieron a membranas de PVDF. Fosfo-señales fueron visualizadas mediante autorradiografía. Posteriormente, se probó la membrana con un anticuerpo anti-BANDERA (Sigma-Aldrich) para confirmar la identidad de la banda portadora de la señal fosfórica (paneles inferiores izquierdos). El asterisco representa una banda no específica de la preparación comercial de ciclina B-CDK2. b) La reacción a la quinasa se llevó a cabo utilizando γ-32P-ATP y GST-TRF2, GST-RAP1, GST-Rb (control positivo) y GST (control negativo) como sustratos en presencia o ausencia de quinasa de ciclina A-CDK2 de tipo salvaje. Las reacciones se visualizaron mediante la PÁGINA SDS seguida de tinción de Coomassie y autorradiografía (panel izquierdo). Se realizó un ensayo de quinasa similar utilizando ciclina A/CDK2 de tipo salvaje y ATP-γ-S, y posteriormente se sometió a un esquema de aislamiento de fosfopéptidos. El análisis de MS confirmó que TRF2 y RAP1 fueron fosforilados en los sitios exactos que identificamos en la pantalla con un sitio adicional para RAP1 (panel derecho). c) El ensayo de quinasa se realizó utilizando γ-32P-ATP, ciclina A-CDK2 o ciclina B-CDK1 con cantidades crecientes de GST-RL12 purificado. Las muestras se separaron por PÁGINA DE SDS y el gel se tiñó con Coomassie (panel inferior) seguido de autorradiografía (panel superior). «C» denota reacciones de «solo quinasa» sin sustratos transfectados.
Validación de RL12 como sustrato in vivoCDK2
Los estudios anteriores validaron varios candidatos nuevos identificados en nuestra pantalla como sustratos CDK2 in vitro. Sin embargo, para determinar si un sustrato nuevo también es fosforilado por CDK2 in vivo, realizamos un análisis más completo de la proteína ribosómica RL12. Primero mezclamos inmunoprecipitados de ciclina A-CDK2 marcada con epítopo y RL12 expresados en células humanas en presencia de γ-32P-ATP y encontramos que la ciclina A-CDK2 fosforiló RL12 in vitro (Figura 5a). La fosforilación fue abolida en gran medida en un mutante RL12 donde la fosfoserina identificada S38 fue reemplazada por una alanina, y se restauró cuando S38 fue reemplazada por una treonina (Figura 5b). A continuación, se utilizó el mapeo de fosfopéptidos para identificar el péptido que contenía S38 y se confirmó que estaba fosforilado directamente por CDK2 in vitro (Figura 5c). Para probar si el RL12 también está fosforilado in vivo de una manera dependiente de CDK2 en el mismo sitio, marcamos metabólicamente células con ortofosfato de 32P e inmunoprecipitado de tipo salvaje o RL12-S38A de células que sobreexpresan la ciclina E-CDK2, la ciclina E-CDK2 catalíticamente inactiva o el inhibidor de CDK p21 (para inhibir CDK endógenas) . Debido a que no podemos estudiar la fosforilación endógena de RL12 debido a la falta de un anticuerpo anti-RL12 adecuado, estos estudios examinaron la fosforilación de RL12 ectópico in vivo (estas condiciones de transfección llevaron a una sobreexpresión de aproximadamente cinco a diez veces del ARNm de RL12 (archivo de datos adicional 8). Encontramos que el RL12 de tipo salvaje, pero no el RL12-S38A, fue fosforilado in vivo (Figura 5d). Esta fosforilación se incrementó en las células que sobreexpresaron la ciclina E-CDK2, pero no la ciclina E-CDK2 inactiva, y se redujo en las células que sobreexpresaron el inhibidor de la CDK p21 (que inhibe las ciclinas-CDK endógenas; Figura 5d). Finalmente, utilizamos mapeo de fosfopéptidos y análisis de ácido fosfoamino de la proteína RL12 inmunoprecipitada de las células marcadas y confirmamos que la fosforilación de RL12 por ciclina E-CDK2 in vivo también ocurrió en S38 (Figura 5e). La fosforilación in vivo de RL12 S38 también se ha reportado en estudios de fosfoproteomas .
la Fosforilación de RL12 in vitro e in vivo. a) El RL12 marcado con HA o el control vectorial («vec») se transfectaron de forma transitoria a células U2OS e inmunoprecipitaron con el anticuerpo 12CA5. Los complejos de ciclina A-CDK2 también se expresaron de forma transitoria por separado en células U2OS y se inmunoprecipitaron utilizando un anticuerpo contra la ciclina A. Los ensayos de quinasa se llevaron a cabo utilizando el inmunoprecipitado RL12 (o control) con o sin el inmunoprecipitado de ciclina A-CDK2 en presencia de γ-32P-ATP. b) Se llevaron a cabo ensayos similares con inmunoprecipitados de ciclina A-CDK2 y RL12 que contenían mutantes de fosfosita de tipo salvaje (wt) y los mutantes de fosfosita RL12 indicados. El asterisco indica la cadena ligera del anticuerpo. c) Mapeo de fosfopéptidos y análisis de ácido fosfoamino de los mutantes de tipo salvaje radiomarcado (panel izquierdo) y S38T (panel derecho) de RL12. d) RL12, RL12-S38A o control vectorial de tipo salvaje se transfectó transitoriamente con ciclina E-CDK2, ciclina E-CDK2 catalíticamente inactiva (dn) o p21. Todas las células se sometieron al etiquetado con ortofosfato 32P. El RL12 se inmunoprecipitó a partir de lisados celulares y se visualizó mediante una PÁGINA de SDS seguida de autorradiografía. e) También se llevó a cabo un análisis cartográfico de fosfopéptidos en el RL12 radiomarcado que figura en d). La flecha inferior muestra un segundo y menor sitio de fosforilación detectado in vivo.
Aunque hemos validado cada uno de los nuevos candidatos que hemos probado hasta ahora al mostrar que las proteínas de longitud completa están fosforiladas por CDK2, es probable que algunos candidatos en nuestra lista no sean sustratos de ciclina A-CDK2 fisiológicamente relevantes. Por ejemplo, las reacciones de cinasa se realizaron en lisados, y la compartimentación subcelular in vivo puede restringir el acceso de CDK2 a algunos candidatos. Además, es posible que otras quinasas celulares sean redundantes o más importantes que CDK2 con respecto a sustratos individuales in vivo. Por lo tanto, es fundamental que los candidatos sean evaluados rigurosamente en un contexto lo más fisiológico posible. Con este fin, en los estudios en curso, estamos utilizando un enfoque de orientación génica para mutar un subconjunto de estos sitios de fosforilación en los genes endógenos para estudiar su importancia fisiológica.
