cribado de marcadores de superficie celular humana

Las células hESC y hPSC-RPE se disociaron en células individuales utilizando TripLO durante 5-10 min. Las vesículas ópticas se disociaron en células individuales utilizando TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) durante 10 min, seguido de disociación física a través de una aguja de 20 G. Para permitir el análisis simultáneo de estas diferentes poblaciones en la misma muestra, se etiquetaron células hESC, hPSC-RPE y células de vesículas ópticas con CellTrace™ CFSE (0,25 µM) durante 7 minutos a 37 °C o CellTrace™ Violet (5 µM) durante 20 minutos a 37 °C siguiendo el protocolo del fabricante (Thermo Fisher Scientific). Luego, los tres tipos de células se teñieron utilizando los paneles de cribado BD Lyoplate™ (BD Biosciences) siguiendo el protocolo del fabricante. El código de barras de las células permitió distinguir fácilmente entre los tres grupos de células y minimizar la variabilidad de la muestra durante el cribado. Las muestras se analizaron en placas de 96 pocillos en un LSRFortessa equipado con láseres de 405, 640, 488, 355 y 561 nm (BD Biosciences) o un CytoFLEX equipado con láseres de 405, 638, 488 y 561 nm (Beckman Coulter). Las células no viables se excluyeron del análisis utilizando un tinte de ácido nucleico 7-AAD (7-aminoactinomicina D) (BD Biosciences). El análisis de los datos se realizó con el software FlowJo v. 10 (Tree Star). El cribado marcador de superficie celular se realizó una vez para vesículas ópticas 3D y una vez para hPSC-RPE día 60.

Cultivo celular

Las líneas hESC HS980 y HS983 se derivaron y cultivaron previamente bajo condiciones definidas y libres de xeno30 (Autoridad Sueca de Revisión Ética: 2011/745:31/3). Los donantes dieron su consentimiento informado para la derivación y el uso posterior de las líneas de hESC. La línea WA09/H9 hESC se obtuvo de Wicell y se adaptó al cultivo sin alimentador en hrLN-521 (10 µg/mL, Biolamina). Las células se mantuvieron por propagación clonal en placas recubiertas de hrLN-521 en medio NutriStem hPSC XF (Industrias Biológicas), en una incubadora de 5% de CO2/5% de O2, y se pasaban enzimáticamente a una proporción de 1:10 cada 5-6 días.

Las líneas de hiPSC CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I y CTRL-14-II fueron proporcionadas amablemente por el centro central del Instituto Karolinska iPSC (Autoridad Sueca de Revisión Ética: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Los donantes dieron su consentimiento informado para la derivación y el uso posterior de las líneas hiPSC. Las células se mantuvieron por propagación clonal en placas recubiertas de hrLN-521 (Biolamina) en medio NutriStem hPSC XF (Industrias Biológicas), en una incubadora de 5% CO2/5% O2 y se pasaban enzimáticamente a una proporción de 1:10 cada 5-6 días.

Para el paso, los cultivos confluentes se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2+ y Mg2+ y se incubaron durante 5 min a 37 °C, 5% de CO2/5% de O2 con TrypLE Select. La enzima se eliminó cuidadosamente y las células se recogieron en medio NutriStem hPSC XF precalentado fresco mediante pipeteo suave para obtener una suspensión unicelular. Las células se centrifugaron a 300 × g durante 4 minutos, el pellet se resuspendió en medio NutriStem hPSC XF precalentado fresco y las células se platearon en un plato recién recubierto con hrLN-521. Dos días después de su paso, el medio se reemplazó con un medio NutriStem hPSC XF precalentado fresco y se cambió diariamente.

Diferenciación monocapa hPSC-RPE

Un protocolo paso a paso que describe el protocolo de diferenciación se puede encontrar en Protocol Exchange36. Los hESC o hiPSC se recubrieron con una densidad celular de 2,4 × 104 células/cm2 en platos recubiertos de laminina (20 µg/ml) utilizando el medio NutriStem hPSC XF. Se añadió inhibidor de la Rho-cinasa (Y-27632, Miliporo) a una concentración de 10 µM durante las primeras 24 h, mientras que las células se mantuvieron a 37 °C, 5% de CO2/5% de O2. Después de 24 h, el medio hPSC se reemplazó con el medio de diferenciación NutriStem hPSC XF sin factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y factor de crecimiento transformador-β (TGFß) (Industrias Biológicas) y se colocaron células a 37 °C, 5% de CO2/21% de O2. A partir del día 6 después del recubrimiento, se agregaron al medio 100 ng/ml de Activina A (R&Sistemas D). Las celdas eran alimentadas tres veces por semana y mantenidas durante 30 días. Las monocapas se tripsinizaron utilizando TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) durante 10 minutos a 37 °C, 5% de CO2. La enzima se eliminó cuidadosamente y las células se recogieron en medio NutriStem hPSC XF fresco precalentado sin bFGF y TGFß mediante pipeteo suave para obtener una suspensión unicelular. Las células se centrifugaron a 300 × g durante 4 min, el pellet se resuspendió, se pasó a través de un colador celular (ø 40 µm, BD Biosciences) y las células se sembraron en platos recubiertos de laminina (hrLN-111 y hrLN-521 a 20 mg/ml) a diferentes densidades celulares que oscilaban entre 1,4 × 106 y 1,4 × 104 células/cm2. Las células replegadas se alimentaron tres veces por semana durante los 30 días siguientes con medio NutriStem hPSC XF sin bFGF y TGFß. Para la diferenciación in vitro de hPSC-RPE en suspensión 3D EBs, seguimos nuestro protocolo publicado previamente10. Brevemente, se cultivaron células madre pluripotentes para confluir en rhLN-521 y se rasparon manualmente para producir EBs utilizando una punta de pipeta de 1000 µL. Los EB se cultivaron en suspensión en placas de fijación baja (Corning) a una densidad de 5-7 × 104 células/cm2. La diferenciación se realizó en un medio NutriStem hESC XF hecho a medida en el que bFGF y TGFß se han eliminado con un cambio de medio dos veces por semana. Se añadieron diez micromoles de inhibidor de la Rho-cinasa (Y-27632, Miliporo) a los cultivos de suspensión solo durante las primeras 24 h. Después de 5 semanas de diferenciación, se cortaron mecánicamente las áreas pigmentadas del EBs utilizando un bisturí. A continuación, se disociaron las células utilizando TrypLE Select, seguido de un lavado a través de una aguja y una jeringa de 20 G. Las células se sembraron a través de un colador celular (ø 40 µm, BD Biosciences) en platos recubiertos con LN con una densidad celular de 0.6-1, 2 × 104 células / cm2 y alimentadas dos veces por semana con el mismo medio de diferenciación mencionado anteriormente. Se obtuvieron imágenes de campo brillante con un microscopio Nikon Eclipse TE2000-S y se utilizó una cámara Canon SX170 IS para capturar la pigmentación desde la parte superior de los pozos.

PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se aisló utilizando el Mini Kit RNeasy Plus y se trató con DNasa libre de RNasa (ambos de Qiagen). El ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando 1 µg de ARN total en una mezcla de reacción de 20 µL, que contenía hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa Superíndice III (Gibco, Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Citometría de flujo

La clasificación celular se realizó en cultivos hPSC-RPE después de 21 o 30 días de diferenciación. Las células se incubaron con los anticuerpos conjugados mencionados en hielo durante 30 min. Se incluyeron controles FMO para cada condición a fin de identificar y células portonegativas y positivas. Las células teñidas se clasificaron utilizando un Clasificador de Células de Fusión Aria FACS de BD (BD Biosciences) utilizando el software FACSDiva v8.0.1.

Inmediatamente después de la clasificación, se citospinaron 70.000 células diluidas en 100 µL de FBS al 2% y EDTA (Sigma) de 1 mM durante 5 minutos a 400 rpm en portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente, seguidos de la fijación con formaldehído sin metanol al 4% a temperatura ambiente durante 10 minutos y tinción por inmunofluorescencia.

Inmunofluorescencia

Histología e inmunotinción tisular

Inmediatamente después de la eutanasia mediante inyección intravenosa de 100 mg / kg de pentobarbital (Allfatal vet. 100 mg/ml, Omnidea), los ojos estaban enucleados y el área de inyección del bleb estaba marcada con un Tinte verde para Marcar el tejido (DTM) (Productos Histolab). Se realizó una inyección intravítrea de solución de fijación (FS) de 100 µL consistente en formaldehído tamponado al 4% (Solvenco AB) antes de la fijación en FS durante 24-48 h, e incrustación en parafina. Se produjeron secciones seriadas de cuatro micrómetros a través del área marcada con DTM y cada cuatro secciones se teñieron con hematoxilina-eosina.

Para la inmunotinción, los portaobjetos se desparafinizaron en xileno, se deshidrataron en alcoholes graduales y se enjuagaron con ddH2O y solución salina tamponada Tris (TBS, pH 7,6). La recuperación de antígenos se logró en tampón de citrato de 10 mM (citrato trisódico dihidrato, Sigma-Aldrich, pH 6,0) con Interpolación-20 de 1:2000 (Sigma-Aldrich) a 96 °C durante 30 min, seguido de enfriamiento de 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con TBS y se bloquearon durante 30 minutos con suero de burro normal al 10% (Abcam) diluido en TBS que contenía 5% (p/v) de IgG y albúmina de suero bovino libre de proteasa (Jackson Immunoresearch) en una cámara humidificada. Los anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo se incubaron durante la noche a 4 ° C: proteína del aparato mitótico nuclear humano (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Milipora MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) y CD56/NCAM1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clon ) (Datos suplementarios 2). Se incubaron anticuerpos secundarios (IgG anti-conejo asno (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 e IgG anti-ratón asno (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, ambos de Thermo Fisher Scientific) (Datos suplementarios 2) diluidos 1:200 en tampón de bloqueo 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se montaron con vector Vectashield con medio de montaje DAPI ((4′,6-diamidino-2-fenilindol)) (Laboratorios Vectoriales) bajo un cubreobjetos de 24 × 50 mm2.

Para inmunohistoquímica, los portaobjetos se desparafinizaron, seguidos de recuperación de antígenos (solución ER2, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) y tinción (Protocolo IHC F) para anticuerpos CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) y CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clon) (Datos suplementarios 2) en el instrumento Bond RXm (Leica Biosystems).

Las imágenes se tomaron con microscopio invertido de fluorescencia Olympus IX81 o microscopio confocal de barrido puntual Zeiss LSM710-NLO. El análisis posterior a la adquisición de las imágenes se realizó utilizando el software ImageJ.

Ensayo de fagocitosis

Las POS bovinas marcadas con isotiocianato de fluoresceína fueron aisladas y amablemente administradas por el Dr. E. F. Nandrot del Instituto de la Visión, Paris37. Las células hPSC-RPE se cultivaron en la membrana transwell (0,33 cm2, Corning) recubiertas con hrLN-521 20 µg/mL durante 1 mes después de la siembra. Las células se incubaron a 37 °C o 4 °C durante 16 h con 2,42 × 106 POS/Transwell descongelados diluidos en DMEM (medio de águila modificado de Dulbecco) o medios independientes del CO2 (ambos de Thermo Fisher Scientific), respectivamente. Después de la incubación, las células se apagaron con la Solución Azul Tripano 0.2% (Gibco, Invitrogen) durante 10 min a temperatura ambiente, fijado con 4% de formaldehído sin metanol (Polisciencias) a temperatura ambiente durante 10 min, y permeabilizado con 0,3% de Tritón X-100 en D-PBS durante 15 min. Se utilizó tinción de faloidina de rodamina (1:1000, 20 min a temperatura ambiente, Biotina 00027) (Datos complementarios 2) para visualizar los límites celulares. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst 33342 (1:1000, 20 min a temperatura ambiente, Invitrogen).

Las imágenes se obtuvieron con el microscopio confocal de barrido de puntos Zeiss LSM710-NLO. El análisis posterior a la adquisición de las imágenes se realizó utilizando Imaris (Bitplane) y las cuantificaciones de POS se realizaron con el software CellProfiler 2.1.1. Módulos utilizados: Imágenes de carga, ColorToGrey, Objetos primarios de identificación, Forma de tamaño de objetos de medición, Imágenes guardadas y hoja de preferencias de exportación. Los objetos se identificaron por un diámetro típico de 10-40 unidades de píxeles utilizando dos Clases, Global, Otsu, método de umbral de varianza ponderada con límites inferiores y superiores de 0,01 y 1,0, y factor de corrección de 2,1, con objetos agrupados que se distinguen por su intensidad.

Ensayo de inmunoabsorción enzimática

Las células hPSC-RPE se cultivaron en membranas Transwell (0,33 cm2, Miliporas) recubiertas con diferentes sustratos. Los sobrenadantes de los lados apical y basal de hPSC-RPE (es decir, los compartimentos superior e inferior del transwell, respectivamente) se recolectaron 60 h después de cambiar el medio. Los niveles de secreción de PEDF se midieron en triplicados para cada condición con kits ELISA PEDF humanos disponibles comercialmente (BioVendor RD191114200R), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, después de 60 días de cultivo. Las lecturas de densidad óptica se midieron utilizando el Lector de Microplacas SpectraMax 250 (Dispositivos Moleculares). Los resultados se presentan como media ± SEM.

Las mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial

Las células RPE de resistencia eléctrica transepitelial chapadas en tubos Transwell (0,33 cm2, Miliporo) se midieron utilizando el Sistema de Resistencia Eléctrica Millicell Medidor de voltios-ohmios (Millicell xt-2, Miliporo), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos de sesenta días se equilibraron fuera de la incubadora a temperatura ambiente durante 15-20 minutos antes del experimento. Las mediciones se realizaron en medios de cultivo sin cambios por triplicado para cada condición, en tres posiciones diferentes de cada pozo. Para el análisis ulterior se utilizaron promedios. La resistencia de fondo se determinó a partir de un inserto de cultivo en blanco en el mismo medio recubierto con el sustrato correspondiente pero sin células, y se restó de la condición de experimento respectiva. Las mediciones se reportan como resistencia en ohmios por el área en centímetros cuadrados (Ω × cm2). Los resultados se presentan como media ± SEM.

Microscopía electrónica de barrido

Las células hPSC-RPE se cultivaron en insertos transwell recubiertos con LN521 (20 µg/mL) durante 60 días. Se fijaron por inmersión en glutaraldehído al 2,5% en tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7,4. La membrana transwell se cortó y se lavó en agua miliq antes de la deshidratación escalonada de etanol y el secado en puntos críticos con dióxido de carbono (Leica EM CPD 030). Los insertos se montaron en columpios de muestras con lengüetas adhesivas de carbono y pulverización catódica recubierta con una fina capa de platino (Quorum Q150T ES). Las imágenes de microscopía electrónica de barrido se obtuvieron utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) a 3 kV y el detector SE2.

Microscopía electrónica de transmisión

Las células hPSC-RPE se cultivaron en insertos transwell recubiertos con LN521 (20 µg/mL) durante 60 días. Se fijaron por inmersión en glutaraldehído al 2,5% en tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7,4. La membrana transwell fue cortada y en tiras finas, enjuagada en tampón de fosfato de 0,1 M, seguida de post fijación en tetróxido de osmio al 2% en tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7,4, a 4 °C durante 2 h. Las tiras de membrana se sometieron a deshidratación escalonada de etanol y finalmente se incrustaron en LX-112. Se prepararon secciones ultrafinas (~50-60 nm) con un Leica EM UC7 y se contrastaron con acetato de uranilo, seguido de citrato de plomo. La obtención de imágenes por microscopía electrónica de transmisión se realizó en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi HT7700 (Hitachi High-Technologies) operado a 80 kV y las imágenes digitales se adquirieron utilizando una cámara CCD Veleta (Olympus Soft Imaging Solutions).

Análisis bioinformático de secuenciación de ARN unicelular

Las células hPSC-RPE de sesenta días se disociaron utilizando TrypLE Select y pasaron a través de un filtro celular (ø 40 µm, BD Biosciences). Se resuspendieron a una concentración de 1000 células/µL en 0,04% de ASC en SBP. Las células se transportaron a 4 ° C a la Instalación de Genómica Unicelular Eucariótica (ESCG, SciLifeLab, Estocolmo, Suecia), donde se preparó una biblioteca de ADNc de 3′ para secuenciar ARN unicelular con la plataforma de Genómica 10x (Genómica 10x) utilizando el software NovaSeq 6000. Cell Ranger 2.1.se utilizó una canalización de 1 (10x Genómica) para convertir archivos de llamadas base Illumina al formato fastq, alinear las lecturas de secuenciación con el transcriptoma hg19 utilizando el alineador de ESTRELLAS 38 y generar matrices de códigos de barras de características. Las células filtradas de control de calidad Cell Ranger (718, 810, 931 y 1129 gotitas que contenían células se capturaron para muestras de CD140b+GD2, CD140b+CD184, 1:20 replatadas y hESC, respectivamente) se analizaron en la versión 3.5.1 de R (R Core Team)39, utilizando la versión 2.3.440, 41 de Seurat suite. Como medida adicional de control de calidad, se seleccionaron células RPE con genes expresados de forma única (≥2000 a ≤5000), UMIs (≥10.000 a ≤30.000) y porcentaje de mapeo de UMI a genes MT (≥0,025 a ≤0,10). Del mismo modo, hESC con genes expresados de forma única (≥2000 a ≤8000), UMIs (≥10.000 a ≤80.000) y porcentaje de mapeo de UMI a genes MT (≥0,025 a ≤0,10). Este paso de filtración dio como resultado un conjunto de datos final de 616, 725, 779 y 905 celdas para muestras CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, 1:20 replatadas y hESC, respectivamente. Antes de la reducción de la dimensionalidad por análisis de componentes principales (PC), la variación celular en la expresión génica impulsada por UMIs, la expresión génica mitocondrial y las etapas del ciclo celular retrocedieron durante el proceso de escalado de datos42. Se seleccionaron genes variables dentro de muestras de EPR en función de su expresión y dispersión promedio normalizadas (corte de expresión = 0,0125-5, y corte de dispersión inferior = 0,5). Para la selección de PC, se evaluaron los hallazgos de PCHeatmap, jackStraw, desviaciones estándar de PC y análisis de Clustree 43. Las primeras 15 piezas se utilizaron para la proyección tsne44 y el análisis de agrupamiento (resolución = 0,1, perplejidad = 40).

Los grupos de células se analizaron mediante dos enfoques. Los genes diferenciales superiores se identificaron primero para cada grupo utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se calculó la expresión génica secundaria distintiva (puntuaciones de módulos) para el hESC indiferenciado y varios tipos de células presentes en la retina humana. Las células que expresaban marcadores de mesodermo se subdividieron manualmente en un grupo separado utilizando las características de trazado interactivo de Seurat. Los datos se cargan en ArrayExpress (EMBL-EBI), consulte los detalles a continuación.

Animales

Tras la aprobación del Comité de Ética de Experimentación Animal del Norte de Estocolmo (DNR N25/14), se utilizaron en este estudio 10 conejos albinos blancos de Nueva Zelanda (proporcionados por Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Suecia) de 5 meses de edad, con un peso de 3,5 a 4,0 kg. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y de la Visión.

Trasplante subretiniano

Las monocapas hPSC-RPE se lavaron con PBS, se incubaron con TripLO y se disociaron a suspensión unicelular. Las células se contaron en una cámara hemocitométrica de Neubauer utilizando azul Tripano al 0,4% (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugadas a 300 × g durante 4 min, y el pellet celular se resuspendió en PBS recién esterilizados con filtro a una concentración final de 1000 células/µL. La suspensión celular se alícuota asépticamente en unidades de 600 µL y se mantiene en hielo hasta la cirugía.

Los animales fueron sometidos a anestesia general mediante administración intramuscular de 35 mg/kg de ketamina (Ketaminol, 100 mg/ml, Intervet) y 5 mg/kg de xilazina (Rompun vet. 20 mg/ml, Bayer Animal Health), y las pupilas se dilataron con una mezcla de ciclopentolato al 0,75%/fenilefrina al 2,5% (LPA). Se realizaron microcirugías en ambos ojos utilizando una técnica transvítrea de pars plana de 2 puertos y 25 G (Alcon Accurus, Alcon Nordic) como se describió previamente45. La suspensión celular se introdujo en una jeringa de 1 mL conectada a un tubo de extensión y una cánula de politipo de 38 G (MedOne Surgical Inc). Sin vitrectomía previa, la cánula se insertó a través del trocar temporal superior. Después del posicionamiento adecuado de la punta, determinado por un destello focal de la retina, se inyectaron lentamente subretinalmente 50 µL de suspensión celular (equivalente a 50.000 células) ~6 mm por debajo del margen inferior de la cabeza del nervio óptico, formando una burbuja uniforme que era claramente visible bajo el microscopio quirúrgico. Se tuvo cuidado de mantener la punta dentro de la ampolla durante la inyección para minimizar el reflujo. Después de retirar el instrumento, se aplicó una ligera presión a las esclerotomías sin sutura autoadhesivas. Se administraron dos microgramos (100 µL) de triamcinolona intravítrea (Triescencia, Alcon Nordic) 1 semana antes de la cirugía y no se administraron antibióticos postquirúrgicos.

Estadísticas y reproducibilidad

Para los análisis estadísticos, se realizaron análisis bidireccionales de varianza y comparaciones múltiples post hoc utilizando la corrección de la prueba de Tukey para evaluar las diferencias in vitro de las diferentes densidades evaluadas y condiciones de clasificación versus condiciones replateadas en los ensayos de secreción de TEER y PEDF.

Todas las cuantificaciones se realizaron cegados. Parámetros estadísticos, incluidas las definiciones y el valor exacto de n (por ejemplo, número total de experimentos, réplicas, etc.).), las desviaciones, los valores de P y los tipos de pruebas estadísticas se informan en las figuras, las leyendas de las figuras correspondientes y en esta sección. El análisis estadístico se realizó con Prism 7 (Software GraphPad, versión 7.0 c). En todos los casos, el análisis estadístico se realizó con datos de al menos tres réplicas experimentales biológicamente independientes. Las comparaciones entre grupos se planificaron antes de las pruebas estadísticas y los tamaños de los efectos objetivo no estaban predeterminados. Las barras de error mostradas en los gráficos representan la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. Todas las micrografías mostradas son imágenes representativas de tres experimentos independientes, a menos que se especifique lo contrario (por ejemplo, Fig. 1c).

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de Informes de Investigación de la Naturaleza vinculado a este artículo.