Los ecosistemas de aguas subterráneas son las fuentes más importantes de agua potable en todo el mundo, pero están amenazados por la contaminación y la sobreexplotación. Los derrames de petróleo representan la fuente de contaminación más común y la alta carga de carbono produce anoxia y gradientes geoquímicos pronunciados. Los microbios desempeñan un papel importante en la transformación de los hidrocarburos de petróleo en sustancias menos tóxicas. Para investigar las poblaciones microbianas a nivel de una sola célula, la hibridación fluorescente in situ (FISH) es ahora una técnica bien establecida. Recientemente, sin embargo, se ha introducido la deposición catalizada por reportero (CARD)-FISH para la detección de microbios de ambientes oligotróficos. Sin embargo, los acuíferos contaminados con petróleo presentan el peor escenario posible para las técnicas de pesca debido a la combinación de una alta fluorescencia de fondo de hidrocarburos y la presencia de pequeñas células microbianas causadas por las bajas tasas de rotación características de los ecosistemas de aguas subterráneas. Por lo tanto, no es sorprendente que los estudios de microorganismos de estos sitios se basen principalmente en técnicas de cultivo, huellas dactilares y secuenciación de amplicones. Sin embargo, para revelar la dinámica de la población y las relaciones entre especies de los principales participantes en la degradación de los contaminantes, el PESCADO es una herramienta indispensable. En este estudio, se desarrolló un protocolo para PECES en combinación con cuantificación celular utilizando un microscopio de conteo automatizado. El protocolo incluye la separación y purificación de células microbianas de partículas de sedimentos, permeabilización celular y, finalmente, CARD-FISH en un horno de microondas. Como prueba de principio, se demostró la distribución de Arqueas y bacterias en 60 muestras de sedimento tomadas a través del penacho contaminante de un acuífero (Leuna, Alemania), que ha estado muy contaminado con varias diez mil toneladas de hidrocarburos de petróleo desde la Segunda Guerra Mundial.