La inmunoterapia para el cáncer agonístico sistémico induce la expansión diferencial de linfocitos T CD4 y CD8 en órganos linfoides y periféricos
Se ha demostrado que la combinación de anti-CD40 con IL-2 induce retraso en el crecimiento y regresión en varios modelos de tumores . De manera similar a los datos publicados utilizando modelos de tumores de líneas celulares, el tratamiento del modelo de neoplasia intraepitelial mamaria (MIN-O), una línea de trasplante de tejido, con inmunoterapia anti-CD40 e IL-2 (IT) produjo respuestas antitumorales significativas (P = 0,0057), incluida la regresión en >50% de los ratones tratados (archivo adicional 1: Figura S1A). Estudios previos han demostrado que estas respuestas antitumorales se deben a las células T CD8, por lo que evaluamos el fenotipo de células T en el bazo, así como en el tumor y los pulmones (un sitio metastásico común para muchos modelos tumorales diferentes). Si bien observamos que la terapia generalmente indujo la expansión de CD8 en todos los órganos, observamos algunas diferencias en el fenotipo de memoria de células T CD8 en todos los sitios de los órganos (Archivo adicional 1: Figura S1B-C).
Nosotros y otros hemos demostrado previamente que las terapias inmunoestimulantes fuertes para el cáncer inducen una potente proliferación de células T CD4 y CD8 de memoria (CD44high) en el bazo y los ganglios linfáticos . También se observó que las células T CD4, pero no las CD8, también sufren muerte celular inducida por activación de forma dependiente del interferón(IFN)-γ, lo que resulta en una expansión global insignificante de las células T CD4 por número en estos mismos órganos en comparación con el valor basal . Estos datos se generaron utilizando lecturas de órganos linfoides. Sin embargo, a la luz de los fenotipos observados en el rodamiento MIN-O, ratones tratados con inmunoterapia, la expansión, la activación y la apoptosis de las células T activadas pueden verse afectadas de manera diferente en los tejidos periféricos. Por lo tanto, buscamos caracterizar y comparar la activación de células T en órganos periféricos (donde puede residir el tumor primario o las lesiones metastásicas) y órganos linfoides secundarios (que a menudo se examinan durante estudios inmunoterapéuticos para evaluar los mecanismos de acción). Evaluamos la frecuencia, expansión y apoptosis de las células T CD8 y CD4 (Foxp3neg) sistémicamente en órganos linfoides y periféricos. De acuerdo con los informes anteriores de nuestro grupo, sin alterar significativamente su frecuencia global (Fig. 1a), la inmunoterapia anti-CD40/IL-2 produjo una expansión significativa del número total de células T CD8 en el bazo y los ganglios linfáticos (Fig. 1b). En consonancia con los aumentos en el número total de CD8, la frecuencia de células T CD8 que incorporaban bromodesoxiuridina (BrdU) in vivo se expandió significativamente y la proporción de células apoptóticas evaluadas por la expresión de anexina V extracelular no fue significativamente diferente de la de los controles (Fig.C-D). Por el contrario, la frecuencia total de linfocitos T CD4 disminuyó y el número no cambió significativamente en comparación con los controles dentro de los mismos órganos (Fig. 1a a b). Mientras que las células T CD4 se estaban expandiendo según la evaluación de la incorporación de la BrdU, una proporción significativa de ellas también estaba pasando por apoptosis (Fig. 1c-d) que resulta en un cambio neto insignificante en los números totales. Estos datos estaban en línea con lo observado anteriormente . Cuando evaluamos los órganos no linfoides, incluidos los pulmones y el hígado, observamos tendencias similares en las células T CD4 y CD8, a saber, que las células T CD8 se expandían y sobrevivían en todos los órganos que las seguían (Fig. 2a-b) mientras que las células T CD4 (Foxp3neg) se estaban expandiendo y simultáneamente pasaban por apoptosis en una medida similar, lo que resultó en cambios insignificantes tanto en sus frecuencias como en sus números (Fig. 2c-d) en la periferia.
CD4 and CD8 T cells have differential proliferative and apoptotic responses to immunostimulatory therapies in peripheral organs. Se trató a ratones con inmunoterapia anti-CD40/IL-2 y se evaluaron varios parámetros inmunitarios el día 12 de tratamiento en órganos periféricos (pulmones o hígado). Porcentaje (a) y número total (b) de células T CD4 (Foxp3-ve) y CD8 en órganos periféricos. Porcentaje de proliferación (c), evaluado por BrdU, y apoptosis (d), evaluado por la expresión de anexina V de superficie, de células T CD4 (Foxp3-ve) y CD8 en órganos periféricos. Estos datos son representativos de 2-3 experimentos independientes con 3 ratones por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM. Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
Los fenotipos de memoria de células T varían entre órganos linfoides secundarios y tejidos periféricos no linfoides en células T CD8, pero no en células T CD4 a continuación
En ratones, las células T CD4 y CD8 se pueden categorizar en fenotipos de memoria y naïve basados en la expresión de CD62L (L-selectina) y CD44 con la población CD44lowCD62L+ considerada naïve (TN), la población CD44highCD62L+ considerada memoria central (MTC), y la población CD44highCD62Lneg considerada memoria efectora y/o efectora (TE/EM). Se sabe que las células T CD4 y CD8 difieren en la distribución de estos subconjuntos en los órganos linfoides y periféricos. Mientras que las frecuencias naïve dentro de las poblaciones de CD4 y CD8 siguen siendo relativamente similares, la población de CD44high está más sesgada de memoria central en las células T CD8 y la memoria efectora está sesgada en las células T CD4 en un organismo en reposo . Sin embargo, en los órganos periféricos, las células T residentes en el tejido dentro de los subconjuntos de células T CD4 y CD8 son predominantemente del fenotipo de memoria efectora .
Estudios previos han demostrado que las células de fenotipo de memoria (CD44high) son el tipo de célula principal en expansión después de inmunoterapias estimulantes . Para comprender mejor la composición de las células T CD4 y CD8 en varios órganos, evaluamos el estado de su fenotipo de memoria en cada órgano que lo seguía. En reposo, la alta población de CD44 de células T CD8 en los órganos linfoides fue predominantemente MTC (>90%), mientras que en los órganos periféricos fue una combinación con ~60% de MTC (Fig. 3a, c, e, – f). En general, resulta en una expansión general de la alta frecuencia de cd44 en todos los órganos. Las frecuencias de la MTC no se modificaron o aumentaron ligeramente, mientras que las poblaciones de TE / EM se expandieron significativamente (Fig. 3e-f) de ~10% a 30% en los órganos linfoides y, de manera impresionante, de ~30-85% en los órganos periféricos.
El fenotipo de memoria de células T difiere en órganos linfoides y periféricos después de la inmunoterapia. Se trató a ratones con inmunoterapia anti-CD40/IL-2 y se evaluaron varios parámetros inmunitarios el día 12 de tratamiento en órganos linfoides (bazo o LN) o periféricos (pulmones o hígado). gráficos de puntos representativos a-b de la expresión CD44 vs CD62L en células T CD8 (a) y CD4 (Foxp3-ve) (b) en ratones control y tratados con IT. gráficos circulares c-d que representan la frecuencia de memoria central (blanco) vs efector/memoria de efector (negro) en la subpoblación CD44 de alta en células T CD8 (c) y células T CD4 (d); frecuencias de CD44 de alta representadas dentro de segmentos circulares para una población dada. (e-f) Frecuencia de la memoria efectora/efectora (e) y de la memoria central (f) Células T CD8 (paneles izquierdos) y CD4 (Foxp3-ve) (paneles derechos) en varios órganos de ratones de control o tratados con anti-CD40/IL2. Estos datos son representativos de 4-5 experimentos independientes con 3 ratones por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM
Dentro de la población CD44 Alta de células T CD4, los ratones en reposo estaban más sesgados hacia el fenotipo TE/EM con aproximadamente un 60-70% en el linfoide y un 75-95% en los tejidos periféricos (Fig. 3b, d). Al igual que ocurrió en las células T CD8, a raíz de ELLO, la alta proporción de CD44 se expandió, pero debido al hecho de que estaba tan sesgada al fenotipo TE/EM en todos los órganos en ratones en reposo, las frecuencias de CD4 TE/EM fueron en gran medida consistentes en todos los órganos en ratones tratados con IT (Fig. 3e). Las frecuencias CD4 de la MTC permanecieron relativamente bajas y consistentes en todos los órganos, tanto antes como después de la MTC (Fig. 3f).
La expresión de marcadores de activación en las células T CD4 y CD8 depende de la ubicación y el fenotipo de memoria
Además de las diferencias en la proliferación y la apoptosis, también hemos observado de forma rutinaria que las células T CD4 y CD8 regulan diferentemente la activación y las moléculas inhibidoras que LA siguen. El ejemplo más notable de esto es PD-1 que, basado en estudios centrados en órganos linfoides secundarios (bazo y LN), se reguló preferentemente en células T CD4 y no CD8 y se pensó que probablemente estaba involucrado en el proceso preferencial de AICD que ocurrió en células T CD4 pero no CD8 después de ÉL . Otro ejemplo sería la regulación ascendente preferencial de NKG2D en células T CD8, pero no CD4, que confiere capacidad lítica inducida por el espectador después de una fuerte exposición de citoquinas al subconjunto de CD8 de memoria. Estudios previos de nuestro laboratorio, así como los datos presentados en la Fig. 3 han demostrado que entre las células T CD4 y CD8, las células primarias que proliferan activamente y responden a ELLAS son las células del fenotipo de alta memoria CD44 . Por lo tanto, a continuación nos centramos en esta población.
En la población CD44high, se ha demostrado que las células T CD8 proliferantes no logran regular al alza los marcadores consistentes con la activación por un estímulo específico de antígeno, como CD25 y PD-1, sin embargo, regulan al alza los marcadores que les permiten adquirir un fenotipo de espectador, a saber, NKG2D, confiriendo la capacidad de actuar más de una manera libre de antígeno similar a NK. Por el contrario, las células T CD4 de alta proliferación (Foxp3neg) de CD4 regulan desproporcionadamente la PD-1 (en contraste con las células T CD8 y las células T CD4 reguladoras de Foxp3+), lo que hemos sugerido les permite ser dirigidos preferentemente para la inducción de apoptosis . De acuerdo con estos informes anteriores, observamos fenotipos similares entre linfocitos T CD44highCD8+ tratados con IT residentes en el bazo y los ganglios linfáticos, que regularon significativamente la NKG2D, pero no la PD-1 (Fig. 4a, c) y células T CD44highCD4+, que regularon de forma robusta PD-1, pero no NKG2D (Fig. 4b, d). Cuando evaluamos los mismos marcadores fenotípicos en las poblaciones de células T residentes en órganos periféricos no linfoides, el fenotipo de células T CD44highCD8 + fue considerablemente diferente del de los residentes en los órganos linfoides secundarios. Mientras que las células T CD44highCD8+ residentes en los pulmones y el hígado seguían siendo NKG2D + CD25neg (Fig. 4a, c), la frecuencia de células NKG2D+ en esta población pareció aumentar del 20-30% en los órganos linfoides al 40-50% en los órganos periféricos (Fig. 4a). Además, a diferencia de los órganos linfoides en los que la expresión de PD-1 no se modificó, la expresión de PD-1 aumentó significativamente tanto en los pulmones como en el hígado tras ELLA en la población CD44highCD8+ (Fig. 4c). Por el contrario, el fenotipo de células T CD44highCD4 fue notablemente similar al de las células T CD4 de bazo y ganglio linfático en todos los órganos (Fig. 4b, d) con expresión comparable de PD-1, y regulación al alza mínima de NKG2D. CD25 no se reguló al alza en células T CD4 o CD8 en ningún sitio (datos no mostrados). Esto fue inesperado porque hemos sugerido previamente que la expresión diferencial de PD-1 era probablemente el mecanismo subyacente de la inducción diferencial de apoptosis entre las células T CD4 y CD8 después de regímenes de TI inmunoestimulantes fuertes. Sin embargo, en los órganos periféricos, las células T CD4 siguen estando desproporcionadamente afectadas por la apoptosis a pesar del hecho de que la expresión de PD-1 es comparable entre las células T CD4 y CD8. Este patrón que surgió también fue interesante porque el aumento de la expresión de los marcadores de activación en la periferia pareció correlacionarse directamente con el predominio de TE/EM, particularmente en el caso de PD-1.
Expresión diferencial de marcadores de activación e inhibidores en células T CD8 dependiendo de la ubicación. Se trató a ratones con inmunoterapia anti-CD40/IL-2 y se evaluaron varios parámetros inmunitarios el día 12 de tratamiento en órganos linfoides (bazo o LN) o periféricos (pulmones o hígado). Porcentaje de NKG2D+ (a-b) y PD-1+ (c-d) de células T CD8 (a, c) y CD4 (Foxp3-ve) (b, d) en varios órganos. Gráficos circulares que representan CD8 EM / CM de cada órgano bajo determinadas condiciones de tratamiento/órgano. Estos datos son representativos de 2-4 experimentos independientes con 3 ratones por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM. Las estadísticas se obtuvieron utilizando ANOVA con post-test de Bonferroni, * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
Recientemente se ha demostrado que las células TE/EM circulantes expresan niveles elevados de DP-1 en humanos en reposo . Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las células CD8+ TE/EM podrían expresar preferentemente estos marcadores de activación en lugar de la MTC CD8+, lo que resulta en frecuencias diferenciales de las células T CD44highCD8+ que expresan marcadores de activación en los órganos linfoides secundarios y periféricos que lo siguen. Por lo tanto, evaluamos la expresión de NKG2D y PD-1 en células CD8 + CD44highCD25neg TE/EM y TCM en todos los órganos en ratones tratados con IT y en reposo. En ratones de control, ambos NKG2D (Fig. 5a) y PD-1 (Fig. 5c) se expresaron con mayor frecuencia en el subconjunto TE/EM de la población CD8+CD44highCD25. Sin embargo, la frecuencia general de la población TE/EM entre células T CD8+ en ratones en reposo es relativamente baja en comparación con la MTC (gráficos circulares Fig. 5a), por lo tanto, la expresión general de PD-1 y NKG2D es predominantemente baja (Fig. 4) ya que la MTC constituye la mayoría de las células T CD8 + en reposo. En los ratones tratados con inmunoterapia, la expresión de NKG2D y PD-1 aumentó en todos los órganos (Fig. 4). Una vez más, ambos NKG2D (Fig. 5b) y PD-1 (Fig. 5d) se expresaron más en las células T CD8+ de TE/EM que en las células T CD8+ de MTC. En los órganos linfoides, donde la población TE/EM se expandió en comparación con el control, todavía era significativamente menor que las células TCM CD8+ (gráficos circulares, Fig. 5b) lo que resulta en expansiones menos significativas en estos sitios. A diferencia de los órganos linfoides, las células CD8+ TE/EM constituyeron la mayoría de los órganos periféricos analizados (gráficos circulares, Fig. 5b), lo que hace que la expresión general de NKG2D y PD-1 sea significativamente mayor en estos sitios. Una vez más, es importante señalar que en los órganos linfoides de ratones tratados con inmunoterapia, la expresión general de ambos marcadores de activación fue significativamente menor que en los órganos periféricos debido al sesgo de la MTC en los linfáticos sobre la periferia en la población CD8. Los niveles de expresión no variaron mucho entre TE/EM de diferentes órganos (no hubo diferencias significativas entre los órganos linfoides y periféricos) dentro de los mismos grupos de tratamiento, pero en general aumentaron en los tratados con TI en comparación con el control, una tendencia que fue más pronunciada con NKG2D que con PD-1 (Fig. 5). Por el contrario, la expresión de los marcadores de activación de la MTC se mantuvo relativamente constante no solo entre los órganos de ratones dentro de un grupo de tratamiento, sino también entre los grupos de control y los tratados con tecnología informática (Fig. 5a a b). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la constitución del grupo de memoria/activado (MTC vs TE/EM) pesa mucho sobre el fenotipo de la población de células T activadas, particularmente con las células T CD8, ya que su constitución varía mucho entre los órganos linfoides y no linfoides.
0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001
Evaluación de células T de pacientes que reciben terapia inmunoestimuladora sistémica a dosis altas
A continuación, queríamos evaluar si estos resultados se traducían en pacientes humanos que recibían terapias inmunoestimulantes para el cáncer. Actualmente no hay ensayos que evalúen la combinación de anti-CD40 agonista con IL-2 humana recombinante, sin embargo, hemos comparado de forma rutinaria nuestra terapia combinada con otros tratamientos inmunoestimulantes sistémicos, incluidos agonistas de RLD a dosis altas y terapias de citoquinas sistémicas a dosis altas, y hemos mostrado cambios fenotípicos y funcionales similares en las células T que se observan en nuestro modelo preclínico . Para evaluar si los pacientes en la clínica mostraron cambios similares en la expresión de marcadores de superficie, recolectamos células mononucleares de sangre periférica (CMPB) de pacientes con melanoma metastásico que se sometieron a tratamiento sistémico con dosis altas de IL-2. Los pacientes recibieron 6 x 10^5 UI/Kg cada 8 h para un total planificado de 14 dosis. Se recogieron muestras de PBMC un día antes del inicio del tratamiento (valor basal) o el día 8 del primer ciclo de tratamiento (día 8) para evaluar el fenotipo de células T. Comparando muestras basales y del día 8, se observó un aumento significativo de células de fenotipo de memoria PD-1+ (CD45RO+) en los subgrupos de células T CD4 y CD8 tras el tratamiento con dosis altas de IL-2 (Fig. 6a a c). Cuando esta población se desglosó en memoria central (CD62L+) y memoria efectora/efectora (CD62L -) en el punto de tiempo del día 8, el subconjunto de memoria efectora/efectora expresó una expresión significativamente mayor de PD-1 que el subconjunto de memoria central (Fig. 6d-e). En conjunto, estos datos se correlacionan con lo observado en estudios murinos, lo que sugiere que estos datos son aplicables a estudios en humanos y pueden ser un indicador de lo que está ocurriendo localmente.
las células T de memoria del efector/efector de células T humanas sometidas a terapia con IL-2 expresan PD-1 regulado al alza. Se aislaron PBMCS antes del tratamiento y en el día 8 de tratamiento de pacientes sometidos a dosis altas de IL-2 sistémica para melanoma. Se evaluaron las PBMC para la expresión del subconjunto de células T de PD-1 mediante citometría de flujo. una estrategia de compuerta representativa para la tinción de PBMCS humanas. b-c Frecuencia de expresión de PD-1 en las células T CD4 (b) y CD8 (c) de memoria. (d-e) Frecuencia de expresión de PD-1 en subconjuntos centrales (CD45RO + CD62L+) y memoria efectora (CD45RO + CD62L-) en células T CD4 (d) y CD8 (e). En este conjunto de datos se incluyeron seis muestras de pacientes. Los datos se presentan como media ± SEM. Las estadísticas fueron obtenidos mediante la prueba de T de Student, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
