Resumen
La cervicitis es una enfermedad de transmisión sexual común. En los últimos años, el abuso de antibióticos en el tratamiento de la cervicitis da lugar a la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos; es necesario desarrollar estrategias alternativas. En esta investigación, investigamos los efectos del Gel Vaginal Feilin (FVG), una fórmula herbal china, en el tratamiento de la cervicitis. Se optimizaron dos modelos de cervicitis con ratón BALB/c; se estableció un modelo in vitro en células HeLa. En el modelo de cervicitis inducida por clamidia trachomatis, se pudo observar el alto nivel de cargas bacterianas, la inflamación en el tejido y las citocinas en el suero. Con la administración de FVG, las cargas bacterianas en el moco cervical y el tejido del cuello uterino podrían inhibirse significativamente de manera dependiente de la dosis. La lesión patológica del cuello uterino y la vagina, así como los niveles de IL-2, IL-17 y MCP-1 en suero, podrían mitigarse con la FVG. La FVG redujo el número de inclusión inducida por C. trachomatis en células HeLa. Además, el daño histológico en el modelo de cervicitis inducida por Escherichia coli y Staphylococcus aureus podría reducirse mediante FVG. Estos resultados sugieren que la FVG es capaz de tratar la cervicitis a través de la inhibición de patógenos y la regulación de las respuestas inmunitarias del huésped. La FVG puede contribuir como agente alternativo para el tratamiento de la cervicitis.
1. Introducción
La cervicitis es una enfermedad de transmisión sexual común con una afección inflamatoria del cuello uterino . La infección del cuello uterino comienza en el tracto genital inferior (vagina) y luego se desarrolla en la enfermedad inflamatoria pélvica con infección ascendente del tracto genital superior (útero y trompas de falopio) y la cavidad peritoneal . La cervicitis se presentó con frecuencia como infección asintomática. La secreción mucopurulenta cervical o vaginal anormal y la ectopia cervical pueden ser los signos y síntomas de cervicitis en algunos pacientes . Sin embargo, la cervicitis grave puede llevar a más infertilidad y embarazo ectópico. Se considera que la cervicitis está asociada con la transmisión de la infección por VIH y el desarrollo de carcinomas cervicales .
La cervicitis puede ser inducida por varios patógenos, como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrea, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Tricomonas, virus del Herpes simple, citomegalovirus y adenovirus . Se informa que la infección por C. trachomatis es la causa más frecuente de cervicitis. A más del 10% de las mujeres con cervicitis se les diagnostica infección por C. trachomatis y el número de estas infecciones sigue aumentando en las últimas décadas . C. trachomatis es una bacteria intracelular obligada gramnegativa. Se pueden encontrar dos formas de C. trachomatis en su ciclo de desarrollo. La unión de cuerpos elementales (EBs) a las células huésped media la invasión de C. trachomatis. Dentro de las células huésped, C. trachomatis forma los cuerpos reticulados (RBs) y luego los RBs se replican dentro de la vacuola citoplasmática y finalmente forman la inclusión .
La clamidia puede persistir durante mucho tiempo en el cuello uterino sin síntomas. La infección puede resolverse espontáneamente sin tratamiento o puede causar cervicitis. El aclaramiento de C. trachomatis requiere respuestas de inmunidad Th1 . Sin embargo, las respuestas de la inmunidad adaptativa pueden tener una naturaleza de doble filo y causar daño tisular. El manejo de la infección por C. trachomatis se basa en el tratamiento de los pacientes y sus parejas sexuales con macrólidos. El abuso de antibióticos y el diagnóstico falso positivo pueden contribuir a la aparición de organismos resistentes a los antibióticos. Las bacterias resistentes a los antibióticos, por otro lado, conducen al fracaso del tratamiento . Después del tratamiento con el antibiótico, entre el 10% y el 20% de los pacientes sufrirán reinfección en el plazo de un año, lo que puede deberse a la ausencia de inmunidad protectora contra la clamidia . Teniendo en cuenta estas condiciones, es necesario desarrollar estrategias alternativas.
La Medicina Tradicional China (MTC) tiene una larga historia en el tratamiento de enfermedades ginecológicas . El gel vaginal de Feilin (FVG) se desarrolla a partir de una fórmula de medicina china utilizada clínicamente que se utiliza para tratar la cervicitis mucopurulenta. FVG consiste en los siguientes medicamentos a base de plantas:: Gentianae radix et rhizoma, Stemonae radix, corteza de Fraxini, Paeoniae radix rubra, corteza de Dictamni y Glycyrrhizae radix et rizoma. Según la teoría de la MTC: la FVG se puede usar para tratar la acumulación de humedad y materiales tóxicos inducidos por flujo vaginal anormal, como leucorrea profusa, fétida y amarillenta, picazón y dolor alrededor de los genitales externos . Se había estudiado la extracción, preparación y control de calidad de FVG. Las concentraciones de gentiopicroside y paeoniflorin en FVG se analizaron aproximadamente 5.90 mg/g y 8.96 mg/g, respectivamente .
En el presente estudio, probamos la hipótesis de que la FVG podría tratar la cervicitis de manera efectiva. Se establecieron modelos de cervicitis de ratón para evaluar el tratamiento de la FVG. En el modelo de ratón infectado por C. trachomatis, se evaluaron las cargas bacterianas, la lesión patológica y los niveles de MCP-1, IL-2 e IL-17 en suero. Las inclusiones en células HeLa inducidas por C. trachomatis se enumeraron in vitro. Además, después de ser infectado por la mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus, el tratamiento de la FVG fue evaluado a través del examen histológico del cuello uterino.
2. Materiales y Métodos
2.1. Preparación de FVG
Las seis hierbas medicinales se extrajeron tres veces con agua hirviendo y se precipitaron con alcohol a etanol al 70% (v/v). El sobrenadante se concentró con el evaporador rotatorio a una densidad relativa de 1,30 – 1,35 (50°C) para obtener la extracción de Feilin (FE, 5,62 g/g). La base de gel era la mezcla de carbopol 941 y goma xantana. La extracción se mezcló con la base de gel para obtener FVG. El cargamento de droga de FVG fue de 2,5 g/g, 1.25 g/g, y 0.625 g/g.
2.2. Se obtuvieron Cepas Bacterianas y Células Huésped
Clamidia trachomatis cepa de neumonitis de ratón Nigg II (ATCC® VR-123™), Escherichia coli (ATCC® 25922™) y Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™) de una Colección de Cultivos de Tipo Americano. E. coli y S. aureus se cultivaron en caldo nutritivo. La línea de células epiteliales del cuello uterino humano HeLa (ATCC ® CCL-2™) se compró en la Colección de Cultivos de la Academia China de Ciencias Médicas y se cultivó en medio RPMI 1640 que contenía 10% de FBS a 37°C en presencia de 5% de CO2. C. trachomatis N se propagó en células HeLa. Antes de la infección, las células HeLa infectadas (105 células/ml) se interrumpían y centrifugaban. El sobrenadante se recolectó para obtener cuerpos elementales purificados (EBs), que se pueden usar para infectar ratones y células HeLa directamente.
2.3. Infecciones en animales y Tratamiento
Se compraron 120 ratones BALB/c hembra (18-20 g) de Charles River Laboratories China (Beijing, China). Los animales fueron alojados en una instalación de barrera BSL2 para animales. Todos los procedimientos experimentales con animales descritos aquí fueron autorizados por el Instituto de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas, el Comité de Ética de Materia Médica China. El número de referencia de aprobación ética es 20162019.
El tejido del cuello uterino de ratones BALB/c fue lesionado con aguja angulada bajo anestesia. Luego se inocularon ratones con 50 µL de C. trachomatis N o la mezcla de E. coli y S. aureus (109 UFC/ml). Los ratones se infectaban una vez al día y se repetían durante tres días. 24 h después de la última infección, la FVG se administró en la vagina de ratón mediante pipeta (el volumen de FVG se controló cuidadosamente) a dosis de 2,2 g/kg, 1,1 g/kg y 0,55 g/kg durante 12 días. Los supositorios de policresuleno (PS), como control positivo, se mezclaron con base de gel y se administraron a una dosis de 16,5 mg/kg durante 12 días. El grupo de control y el grupo modelo recibieron un volumen igual de base de gel. En el día, y del tratamiento, se recogió el moco cervical con el hisopo. El día 15, se anestesió a los ratones, se tomaron muestras de sangre de la aorta ventricular y se separó el suero. Los ratones fueron asesinados por dislocación cervical bajo anestesia y se extirparon el cuello uterino y la vagina. El esquema del tiempo experimental se muestra en la Figura 1.
2.4. Análisis ELISA de C. trachomatis N, IL-2, IL-17 y MCP-1
Los hisopos con moco cervical se dispersaron con un volumen igual de PBS, el nivel de C. el trachomatis N en PBS se analizó con un kit de ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) (Meilian, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (agregar 50 µL de muestra y 50 µL de anticuerpo de detección a cada pocillo e incubar a 37°C durante 1 hora; lavar los pocillos, agregar 100 µL de conjugado de HRP a cada pocillo e incubar a 37°C durante 0,5 horas; lavar los pocillos, agregar 50 µL de sustratos cromogénicos a cada pocillo e incubar a 37°C durante 0,5 horas 0,5 horas; añadir 50 µL de solución de parada a cada pocillo; leer la absorbancia de cada pocillo a 450 nm). Los niveles de suero de IL-2, IL-17 y MCP-1in se determinaron mediante un kit ELISA (Meilian, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante descritas anteriormente.
2.5. El análisis por RT-PCR del ARN total de C. trachomatis N
se extrajo del cuello uterino utilizando TRIzol (Invitrogen, California, EE. UU.); la expresión de genes diana se analizó utilizando el Kit de RT-PCR de Escritura SYBR Prime de un Paso II (TaKaRa, Beijing, China) con Piko Real 96 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.). Los cebadores se utilizaron de la siguiente manera: Cebador delantero rRNA de 16S, 5 ‘- ACC CGT TGG ATT TGA GCG TA-3′; Imprimación inversa rRNA de 16S, MORDAZA DE 5′-GTT CCC CGA GAT TTG AC-3’; Imprimación delantera GAPDH, mordaza de 5 ‘- GCT TAT GTC GG GAG T-3′; Imprimación inversa GAPDH, 5′-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C-3’. La expresión relativa del gen N de C. trachomatis y del gen de ratón se calculó de acuerdo con el método.
2.6. Examen histológico
Los tejidos de ratones se fijaron con formaldehído al 10%, luego se incrustaron en parafina y se cortaron en rodajas para la tinción de hematoxilina y eosina. Las secciones fueron evaluadas visualmente por DMLB( Leica Camera AG, Wetzlar, Alemania); se prepararon dos secciones de cada muestra. Se aplicaron los siguientes criterios para la clasificación de los cambios patológicos.
» – » El cuello uterino y el epitelio de la vagina no muestran hiperplasia ni inflamación, y los tejidos son normales.
«+» El cuello uterino y el epitelio de la vagina tienen hiperplasia leve; el tejido conectivo tiene inflamación segmentaria leve.
El cérvix»++ » y el epitelio de la vagina tienen hiperplasia; el tejido conectivo fue infiltrado por células inflamatorias.
«+++» El cuello uterino y el epitelio de la vagina tienen hiperplasia significativa y fueron infiltraciones de células inflamatorias; el tejido conectivo estaba rodeado de inflamación difusa y congestión vascular.
2.7. Infección de Células Huésped y Tinción de Inclusión
Las células HeLa se sembraron en una placa de 6 pocillos con una densidad de 2×105 células/pocillo y se cultivaron durante 48 h. Luego, las células se incubaron con C. trachomatis N EBS contenido en medio. La placa se centrifugó a 32°C durante 1 hora y se cultivó continuamente a 37 ° C en presencia de 5% de CO2 durante 2 horas. El medio de las células infectadas se reemplazó con FE (500, 250 y 125 µg/mL) y se incubó durante otras 48 h. Después de eso, las células se lavaron con PBS, se fijaron con metanol y se teñieron con Giemsa. Las inclusiones en las células HeLa fueron capturadas por IX71 (Olympus, Tokio, Japón) y enumeradas.
2.8. Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v. 6 (Software GraphPad, California, EE.UU.). Todos los datos se distribuyeron normalmente (prueba de Kolmogorov-Smirnov). El número de inclusión y las puntuaciones histológicas se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney; otros se analizaron con la prueba t no apareada. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.
3. Resultados
3.1. La FVG Inhibe el Nivel de C. trachomatis N en el moco Cervical
EBs de C. trachomatis germinan y forman el RBs después de invadir las células huésped. El RBs comienza a multiplicarse después de 7-21 días. El inmunoensayo enzimático es un método no cultivado de uso común para diagnosticar la infección por clamidia . Se analizó el nivel de C. trachomatis N en el moco cervical para evaluar la gravedad de la infección en ratones.
En la etapa temprana de la infección por C. trachomatis N, no se observó cambio significativo de la carga bacteriana. 10 días después de la primera infección, el aumento de C. trachomatis N en ratones podría ser probado. El día, el nivel de carga bacteriana fue significativamente mayor que el grupo de control (Figura 2(a)). Con el tratamiento sucesivo de la FVG (2,2, 1,1, 0,55 g/kg), el nivel de C. trachomatis N en el moco cervical de ratones podría inhibirse fuertemente de manera dependiente de la dosis (Figuras 2(c) y 2(d)).
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3.2. FVG Inhibe la Carga de C. trachomatis N en el cuello uterino
En el diagnóstico de infección clamidial, la técnica de amplificación de ácido nucleico que incluye la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es más sensible y específica que el inmunoensayo enzimático . Por lo tanto, probamos la carga de C. trachomatis N en el cuello uterino de ratones con el método RT-PCR. El día 15, la expresión de ARNr 16S de C. trachomatis N en ratones fue significativamente mayor que en el grupo control (Figura 3). El tratamiento de FVG (2,2, 1,1 g/kg) durante 12 días podría inhibir fuertemente la carga de C. trachomatis N en el cuello uterino (Figura 3).
3.3. FVG Disminuye la C. cervicitis y Vaginitis Inducidas por trachomatis N
La infección de C. trachomatis en ratones es un modelo apropiado para estudiar las infecciones del tracto genital. La infección no induce una patología genital grave del tracto superior . Se analizó la patología del cuello uterino y la vagina para caracterizar la gravedad de la infección por C. trachomatis N.
Como se muestra en la Figura 4, en el grupo control, las células epiteliales y el tejido conjuntivo del cuello uterino eran normales, no se observó hiperplasia ni inflamación. En el grupo modelo, las capas epiteliales del cuello uterino tienen hiperplasia y las células inflamatorias se infiltraron en el epitelio y el tejido conectivo. Tras el tratamiento de la FVG (1,1 g/kg), la lesión patológica del cuello uterino podría reducirse significativamente (Figura 4).
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Como se muestra en la Figura 5, en el grupo control, el epitelio vaginal fue normal, no se observó hiperplasia ni inflamación. En el grupo modelo, las capas de epitelio vaginal tienen hiperplasia y las células inflamatorias se infiltraron en el tejido del epitelio. Después del tratamiento de FVG (2,2, 1,1 g / kg), la lesión de la vagina podría reducirse significativamente (Figura 5).
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3.4. La FVG Reduce las Respuestas de Citoquinas Séricas de la infección por C. trachomatis N
Las citoquinas pueden ser liberadas por las células epiteliales y las células inmunitarias después de la infección por C. trachomatis, la mayoría de las cuales provienen de las células Th1. Estas citocinas contribuyen a las respuestas inmunitarias, pero inducen el daño patológico . Los niveles de citoquinas en suero se probaron para apoyar los resultados del examen histológico. En el día, los niveles de IL-2, IL-17 y MCP-1 aumentaron significativamente (Figura 6). Tres dosis de FVG podrían inhibir eficazmente la liberación de IL-17 y MCP-1. La producción de IL-2 podría regularse a la baja con FVG a dosis bajas (1,1 y 0,55 g/kg).
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3.5. La FVG Reduce el Recuento de Inclusión Inducida por C. trachomatis N In Vitro
La proliferación de C. trachomatis ocurre en las células huésped con la formación de RBs. La inclusión se puede formar aproximadamente 12 h después de la infección, que contiene números de RBs . Se evaluó la inhibición in vitro de la FVG en la infección de C. trachomatis N con el número de inclusión. Después de incubar células HeLa con C. trachomatis N durante 48h, se pudieron observar inclusiones con la tinción de Giemsa. Después del tratamiento con FVG (FE), el número de inclusión se redujo significativamente de forma dependiente de la dosis (Figura 7).
3.6. La FVG Reduce la Lesión Patológica del Cuello Uterino Inducida por E. coli y S. aureus
A pesar de que C. trachomatis es el patógeno más común de la cervicitis, los anaerobios como E. coli, S. aureus y Klebsiella pneumoniae podrían aislarse en los pacientes con cervicitis . En nuestro trabajo anterior se había establecido un modelo de cervicitis de rata infectada por la mezcla de E. coli, S. aureus y N. gonorrea . En la presente investigación, se optimizó un modelo de ratones infectados por la mezcla de E. coli y S. aureus. 14 días después de la primera infección, se demostró que el cuello uterino estaba gravemente infectado.
En el grupo control, el epitelio cervical fue normal y no se observó hiperplasia ni inflamación. En el grupo modelo, las capas internas del epitelio cervical tienen hiperplasia, y las células inflamatorias (neutrófilos y eosinófilos) se infiltraron gravemente en el tejido del epitelio. Después del tratamiento de FVG (2,2 y 1,1 g/kg), la inflamación del cuello uterino podría inhibirse significativamente (Figura 8).
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4. Discusión
El diagnóstico de cervicitis es difícil debido a la falta del síntoma obvio. En algunos pacientes, se pudo observar secreción mucopurulenta anormal y ectopia cervical . En las últimas décadas se habían establecido muchos modelos de cervicitis en mamíferos. Macacos, ratas y ratones podrían utilizarse para establecer el modelo de cervicitis. Tanto bacterias (C. trachomatis) como compuestos químicos (fenol, ácido acético) podrían utilizarse para inducir la cervicitis . En esta investigación, se optimizaron dos modelos de ratón. Después de la infección por C. trachomatis N, la carga bacteriana de C. trachomatis N en el moco cervical se elevó continuamente con el tiempo. La infección por C. trachomatis N podría conducir a la regulación ascendente de las citoquinas en el suero y a la inflamación en los tejidos de la vagina y el cuello uterino. Después de la infección con la mezcla de E. coli y S. aureus, la lesión del cuello uterino podría detectarse en el diagnóstico patológico.
Clínicamente, los antibióticos fueron la primera opción para tratar la cervicitis de acuerdo con diferentes patógenos. Pero la aparición de resistentes a los antibióticos, como los resistentes a quinolonas C. trachomatis y N. la gonorrea, el S. aureus resistente a la meticilina y la E. coli resistente a la vancomicina se convierten en un problema grave en todo el mundo debido al abuso de antibióticos . La MTC puede contribuir con estrategias alternativas para el tratamiento de la cervicitis. En esta investigación se probaron los efectos de la FVG en la cervicitis.
FVG es un gel vaginal, cuya base de gel es la mezcla de carbopol 941 y goma xantana . En los últimos años, se han utilizado muchas preparaciones comerciales de gel vaginal de fórmula herbal china para tratar la cervicitis . La administración vaginal de medicamentos es una vía tradicional de administración de medicamentos en la mucosa, que se puede utilizar para el tratamiento de enfermedades locales y sistémicas . Las preparaciones tradicionales, como supositorios, geles, tabletas, películas vaginales, irrigaciones y pesarios, se pueden usar como formulaciones vaginales . Como uno de los sistemas de administración de medicamentos más utilizados, los geles vaginales se han utilizado para la preparación de microbicidas, anticonceptivos, inductores del parto y hormonas sexuales. En comparación con otros sistemas de administración de medicamentos, el gel vaginal es más seguro y tiene una mayor biodisponibilidad .
Los seis medicamentos a base de hierbas en FVG se pueden usar en el tratamiento de enfermedades ginecológicas en la MTC . Según la teoría de la MTC, en esta fórmula, la radix y el rizoma de Gentianae es el «fármaco monarca» o «fármaco principal», la radix de Stemonae y la corteza de Fraxini son el «fármaco ministerial» o «fármaco asistente», la radix rubra de Paeoniae y la corteza de Dictamni son el «fármaco adyuvante», y la radix y el rizoma de Glicirrizae es el «fármaco guía». La Gentianae radix et rizoma puede contribuir más a los efectos de la FVG. Los iridoides y los glucósidos totales de la peonía están aislados principalmente de Gentianae radix et rhizoma y Paeoniae radix rubra, respectivamente. Estos compuestos muestran efectos antiinflamatorios significativos . Los alcaloides y limonoides contribuyen a la actividad antibacteriana de la corteza dictamínica . Las cumarinas en la corteza de Fraxini y las flavonas en Glycyrrhizae radix y rizoma muestran efectos antibacterianos y antiinflamatorios . Los alcaloides contribuyen a la actividad insecticida de Stemonae radix . Estos compuestos bioactivos de estos medicamentos a base de plantas pueden apoyar el tratamiento de la FVG en la cervicitis.
La IL-17 es producida por células Th17 característicamente. Clínicamente, la concentración de IL-17 en las secreciones genitales de los pacientes infectados por C. trachomatis es significativamente mayor que la de las mujeres no infectadas . El alto nivel de IL-17 en el modelo de cervicitis de ratón estuvo de acuerdo con el resultado clínico. Los niveles de IL-2 y MCP-1 están asociados con las respuestas de Th1. La IL-2 es secretada por las células Th1 y estimula la producción de citocinas. Existe una correlación inversa entre el nivel de MCP-1 y las respuestas Th1. La inhibición del MCP-1 puede aumentar la producción de IFN-γ . La FVG podría regular a la baja las concentraciones de IL-2, IL-17 y MCP-1. Estos resultados sugirieron que la FVG podría inhibir la cervicitis a través de la regulación de las respuestas inmunitarias del huésped.
Al principio del ciclo de infección de C. trachomatis, el sistema de secreción de tipo III permite que el EBs invada las células huésped . La internalización de C. trachomatis es seguida por el desarrollo de RBs e inclusiones. El inhibidor del sistema de secreción tipo III podría bloquear la formación de inclusiones . La investigación in vitro demostró que la FVG podría inhibir el número de inclusión en células HeLa.
En conclusión, se establecieron con éxito dos modelos de cervicitis de ratón con la infección de C. trachomatis N, S. aureus y E. coli. Probamos que la FVG podría inhibir significativamente la cervicitis. La FVG podría regular a la baja la carga bacteriana, mitigar la lesión patológica y reducir el número de inclusión. Los efectos de la FVG se asociaron con la inhibición de patógenos y la regulación de las respuestas inmunitarias del huésped. Esta investigación proporciona evidencia de que la FVG podría usarse como un nuevo agente alternativo que alivia el problema de la resistencia a los antibióticos durante el tratamiento de la cervicitis.
Disponibilidad de datos
Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.
Conflictos de intereses
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses relacionado con este trabajo.
Las contribuciones de los autores
Xin Mao y Ronghua Zhao contribuyeron igualmente a este trabajo.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nos. 81773977 y 81774204).
