Contribuido por Paul Barber
Extracción de ADN a través de Chelex
Chelex es conocido por ser tan voluble como barato y fácil. He aquí algunos consejos para una buena amplificación: 1. A veces, las muestras funcionan mejor si se usan de inmediato, a veces es mejor esperar toda la noche antes de usarlas. Experimenta y encuentra lo que funciona para tu especie. Los resultados pueden variar según los taxones.2. Al hacer PCR iniciales, haga una dilución en serie de la plantilla.La cantidad de una extracción de ADN Quelex utilizada en una PCR puede ser tan alta como la mitad del volumen de la PCR o tan baja como 1 microlitro de una dilución de 1:10.000. Encuentro que 1 microlitro de un 1:1 es bueno para la mayoría de las aplicaciones.3. Si no obtiene amplificaciones de su PCR la primera vez con un extracto de Chelex, repita el procedimiento de vórtice, giro, incubación, vórtice, giro, sentado durante la noche descrito anteriormente. A menudo, esto hará que una PCR negativa funcione.
Método¶
- Con lejía, esterilice una espátula de reactivo seco y una pequeña barra de agitación magnética.
- Preparar una mezcla de 5-10% en peso de resina Chelex100 (parte Biorad 143- 3832,100-200 malla Chelex, forma sódica) y agua esterilizada UV para HPLC. La forma más efectiva de hacerlo es tomar un tubo falcon estéril de 50 ml, colocarlo en una báscula dentro de un vaso de precipitados pequeño y poner a cero la báscula. Luego agregue 5 gramos de Chelex y llene hasta 50 ml de marca con agua.
la Precisión no es crítica. La técnica estéril lo es.
- Coloque la barra de agitación estéril en el tubo y colóquela en el agitador magnético. Chelex se asienta rápidamente, por lo que si la mezcla no está bien mezclada, sus concentraciones y resultados serán variables. Manteniendo la mezcla bien mezclada, coloque una alícuota de 300-500 microlitros en tubos eppendorf de 0,6 o 1,6 ml (de nuevo, estériles) y tape inmediatamente. Si tiene acceso a una campana de flujo laminar, ese es un buen lugar para hacer todo esto. Es posible que desee limpiar la báscula y el agitador con una solución de lejía al 10% y/o esterilizar con rayos UV antes de usar.
- Encienda el bloque calefactor. Ajuste a 95°C. Llene los agujeros con agua.
- Con fórceps estériles (Llama sobre un quemador de alcohol varias veces para esterilizar), retire un pequeño trozo de tejido de la muestra. Este pedazo de tejido debe ser lo suficientemente grande como para ser visible, pero no tan grande como para ser fácilmente visible. Imagine cortar una sección de 0,2 mm de una grapa estándar. Esto es muy grande. Demasiado tejido puede inhibir sus reacciones.
Esterilizar pinzas entre muestras.
- Cuando haya terminado, haga un control negativo de Chelex sumergiendo sus pinzas esterilizadas en un tubo de lechada de Chelex.
- Muestra de vórtice y lechada chelex durante 10-15 segundos.
Asegúrese de que las tapas estén apretadas firmemente antes de comenzar.
- Girar muestras brevemente a alta velocidad en una microcentrífuga
- Incubar muestras durante 20 minutos a 95°C
* La temperatura del bloque puede disminuir ligeramente al realizar este paso. Esta caída es normal. Revise los tubos durante la incubación para asegurarse de que las tapas no se hayan desprendido.*
- Muestras de vórtice de nuevo durante 10-15 segundos.
Es cuidadoso, ya que el vapor puede despegar la tapa del tubo de la centrífuga. Mantenga las tapas hacia abajo.
- Tubos de centrifugado de nuevo a alta velocidad en microcentrífuga.
- las Muestras están listas para usar.
Solo use supernate para reacciones de PCR. ¡Chlex bead desactivará Taq!
Este método se basa, con permiso, en un protocolo original disponible aquí.
