Resumen
Antecedentes. Se ha postulado que la expresión de CD133 humano (prominina-1 humana) en las células cancerosas es un marcador de tronco y se considera un marcador putativo de las células madre cancerosas (CSC). Diseñamos un estudio para describir el patrón de expresión de CD133 en piel normal y en neoplasias cutáneas epiteliales. Método. Se comparó la expresión inmunohistoquímica CD133 de cuarenta y tres tumores ecrinos y apocrinos con la observada en otros tumores epiteliales de la piel. Además, se utilizó citometría de flujo para detectar la expresión de CD133 de cuatro neoplasias epiteliales de la piel, incluido un porocarcinoma. Resultado. Se observó inmunorreactividad CD133 en la superficie apical o apicolateral de las células que forman estructuras glandulares. No se tiñeron células de áreas sólidas de tumores benignos o malignos. Las células de cultivo derivadas de porocarcinoma mostraron un 22% de células CD133 positivas utilizando citometría de flujo, mientras que los cultivos de carcinoma de células escamosas contenían menos de 0,1%. Conclusion. Estas observaciones indican que CD133 es un marcador específico de diferenciación glandular que podría incluirse en el panel diagnóstico de tumores cutáneos con posible diferenciación ecrina o apocrina. Sin embargo, el uso de la expresión de CD133 como marcador de CSCs debe interpretarse con precaución en experimentos de piel.
1. Introducción
En los últimos años, se ha informado de un creciente conjunto de pruebas que apoyan la noción de que la capacidad de sostener la formación y el crecimiento tumorales reside exclusivamente en una pequeña población de células llamadas células madre cancerosas (CSC). La búsqueda de marcadores que demuestren el fenotipo similar a las células madre de estas células iniciadoras de tumores es un campo activo de investigación, y recientemente se han descrito varios marcadores de células madre en tumores de piel .
CD133 es el homólogo humano de la prominina-1 de ratón, una glicoproteína de superficie celular de cinco dominios transmembrana que ha recibido una atención notable debido a su expresión restringida a varias subpoblaciones de células madre somáticas . Este antígeno de superficie se descubrió como diana de un anticuerpo monoclonal definido como Mab AC133, un marcador expresado por una subpoblación de células madre hematopoyéticas CD34 positivas derivadas del hígado fetal humano y la médula ósea . Posteriormente, se detectó CD133 en diferentes tejidos humanos normales, incluidos los riñones, la próstata, el cerebro y el páncreas, y se encontró que estaba específicamente asociado con microvellosidades y otras protuberancias de la membrana plasmática . Además, este antígeno también se ha identificado en neoplasias hematológicas y en varias neoplasias humanas sólidas, incluidos tumores gliales, carcinoma de próstata, carcinoma renal, hepatocarcinoma, carcinoma colorrectal y melanoma maligno . El objetivo de muchos de estos estudios fue determinar la existencia de CCC, definidas como un pequeño grupo de células cancerosas que tienen la capacidad de autorrenovación, iniciación tumoral y mantenimiento del crecimiento tumoral. Los anticuerpos utilizados rutinariamente para la purificación de células AC133 positivas se dirigen a epítopos glicosilados mal caracterizados de especificidad incierta. Aunque la actividad funcional de CD133 sigue siendo controvertida y su función fisiológica aún no está determinada , está quedando claro que esta proteína de la superficie celular es un marcador único de protuberancias de membrana plasmática y microdominios de membrana . Se ha sugerido que en esta ubicación celular CD133 puede actuar como regulador de la composición lipídica de la membrana o puede participar en los mecanismos de polaridad y migración celular .
En estudios previos que reportan la tinción inmunohistoquímica CD133 de epitelios glandulares humanos, como glándulas salivales, glándulas lagrimales, conductos pancreáticos, glándulas endocervicales y glándulas sudoríparas, se ha descrito un patrón peculiar de expresión de CD133 . En estos epitelios, se ha demostrado que CD133 está localizado en protuberancias de la membrana plasmática en las áreas apicales de las células polarizadas. También se ha observado un patrón similar de tinción citoplasmática apical CD133 de las células que rodean la luz en los carcinomas de ovario, colon o páncreas .
El hallazgo de las células de las glándulas sudoríparas con tinción de anticuerpos CD133 nos llevó a diseñar un estudio que ahora presentamos, con el fin de evaluar la expresión de CD133 en tumores ecrinos y apocrinos de piel.
2. Materiales y Métodos
2.1. Casos
Una búsqueda retrospectiva recuperó 43 tumores adnexales ecrinos y apocrinos de piel previamente diagnosticados de los archivos del Servicio de Patología del Hospital Universitario de Albacete. Se obtuvieron portaobjetos de vidrio, bloques de parafina e informes histopatológicos de todos los casos. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). En este estudio también se incluyeron casos de carcinoma de células basales () y carcinoma de células escamosas () para comparar los resultados obtenidos en estas neoplasias con los obtenidos en tumores de glándulas sudoríparas. Para evaluar la expresión de CD133 en piel normal, analizamos piel de diferentes áreas obtenidas de los márgenes de seis tumores de piel resecados quirúrgicamente y de tres autopsias.
Para el cultivo de células de cáncer de piel, se obtuvieron siete muestras de tumores de piel humanos que correspondieron a un porocarcinoma ecrino y seis carcinomas de células escamosas. Se incluyó tejido fresco de estos casos en el medio de Aguila modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con penicilina/estreptomicina y fungizona, inmediatamente después de la resección quirúrgica.
2.2. Inmunohistoquímica
Se cortaron secciones de tejido fijadas en formalina, incrustadas en parafina de 4 µm de ancho, se desparafinizaron en xileno y se rehidrataron en una serie graduada de etanol. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 3% durante 5 minutos. Los portaobjetos fueron tratados con recuperación de epítopo inducida por calor e inmunotenidos con tres anticuerpos monoclonales anti-CD133 diferentes: Anticuerpo monoclonal AC133, anticuerpo monoclonal 293C3 y anticuerpo monoclonal AC141 (todos de Miltenyi Biotec, Alemania). Los anticuerpos se probaron en diferentes diluciones y tiempos de incubación. La detección de CD133 se realizó utilizando el sistema EnVision-HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) en una plataforma de autoservicio de DakoCitomation, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó diaminobencidina (DAB substrate system, Dako, Glostrup, Dinamarca) como cromógeno. De los tres anticuerpos anti-CD133 diferentes analizados, solo uno, el anticuerpo monoclonal AC133, trabajó en parafina. Los otros dos anticuerpos analizados fallaron porque las secciones incubadas con estos anticuerpos no mostraron tinción o porque la inmunotinción observada cuando se utilizaron concentraciones altas de anticuerpos se consideró inespecífica (se observó tinción similar en los controles negativos). El anticuerpo monoclonal AC133 dio resultados fiables en las secciones embebidas en parafina analizadas. Establecemos para este anticuerpo una dilución 1 : 10 y 40 minutos de incubación a temperatura ambiente como las condiciones de trabajo preferidas. Posteriormente, todos los experimentos se realizaron en esas condiciones.
Se utilizaron secciones de piel con glándulas sudoríparas normales como controles positivos. Además, cuando estaban presentes en las secciones, se utilizaron glándulas sudoríparas normales de la piel adyacente a las neoplasias como controles positivos internos. Se realizaron controles negativos omitiendo el anticuerpo anti-CD133 durante la incubación primaria de anticuerpos.
Se evaluó por separado la tinción inmunohistoquímica de áreas sólidas y de estructuras acinares o ductales de los tumores. La tinción CD133 se clasificó utilizando una escala semicuantitativa. Las estructuras acinares o ductales se evaluaron de la siguiente manera: ( – ) sin tinción; ( + ) tinción de material secretor en la luz de conductos o acinos aislados y/o tinción débil del borde apical o luminal de pocos conductos o acinos; ( ++ ) tinción clara del borde apical o luminal de la mayoría de los conductos o acinos presentes en el tumor; ( + + + ) tinción del borde apical o luminal de todos los conductos o acinos presentes en el tumor. La expresión de CD133 fue evaluada por dos patólogos sénior (EP y SYNC) de manera ciega y sin conocimiento de información clínica y patológica. En los casos de evaluaciones discrepantes, ambos patólogos reevaluaron las láminas bajo un microscopio multicabezal y se obtuvo una concordancia.
2.3. Cultivo de Células Cancerosas de Tumores Cutáneos
Los fragmentos tumorales se desagregaron mecánica y enzimáticamente por digestión con colagenasa tipo IA (2 mg/ml) (Gibco, Invitrogen) en solución salina balanceada de Hank (HBSS) a 37°C durante 2 horas. Las células se filtraron a través de una malla de nailon de 40 µm y se disociaron mediante el paso en serie a través de pipetas serológicas. El tejido digerido se centrifugó a 1000 × g durante 10 min y el pellet se lavó varias veces para obtener una suspensión de una sola célula. Las células aisladas se colocaron en matraces de cultivo y se cultivaron a 37 ° C en medios DMEM/F12 que contenían suero fetal bovino al 10% y se suplementaron con penicilina / estreptomicina y fungizona.
2.4. Análisis de citometría de flujo
Todos los experimentos se realizaron en suspensiones celulares preparadas al primer paso del cultivo primario de tumores. Las células se separaron utilizando EDTA al 0,02% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 15 minutos a 37°C y se lavaron con PBS antes de la tinción. Las suspensiones celulares se ajustaron a células / ml y se incubaron con la dilución de anticuerpos recomendada (1/10) durante 20 minutos en la oscuridad (4°C). Se utilizaron muestras sin anticuerpo primario como controles negativos. El anticuerpo utilizado fue anti-CD133/1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Los anticuerpos no unidos se eliminaron lavándose con SBP y las células se resuspendieron en un volumen adecuado de tampón. El análisis se realizó en un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando Summit V5. 0.1. software 5170 (Dako).
3. Resultados
3.1. Hallazgos clínicos
La cohorte de pacientes estaba formada por 29 hombres y 23 mujeres, con edades comprendidas entre los 24 y los 90 años (mediana, 49 años). El sitio de presentación fue variable, la mayoría de ellos localizados en la región de la cabeza y el cuello. Los datos clínicos se resumen en la Tabla 1. A todos los pacientes se les realizó biopsia de piel por escisión.
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| CD133 staining was graded using a semiquantitative scale. Acinar or ductal structures were evaluated as follows: (- ) sin tinción; ( + ) tinción de material secretor en la luz de conductos o acinos aislados y/o tinción débil del borde apical o luminal de pocos conductos o acinos; ( ++ ) tinción clara del borde apical o luminal de la mayoría de los conductos o acinos presentes en el tumor; ( + + + ) tinción del borde apical o luminal de todos los conductos o acinos presentes en el tumor. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Hallazgos inmunohistoquímicos
De los tres anticuerpos monoclonales diferentes analizados en secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina , y de acuerdo con informes anteriores, solo el AC133 dio resultados sensibles y confiables. El patrón de tinción inmunohistoquímica general observado con este anticuerpo estuvo estrechamente relacionado con la arquitectura tisular. La tinción se localizó principalmente en la superficie apical de las células que formaban estructuras ductales o glandulares. Los hallazgos inmunohistoquímicos observados en estas estructuras utilizando el anticuerpo anti-CD133 se resumen en la Tabla 1 y se describen a continuación. Las áreas sólidas de cualquiera de los tumores anexos examinados o de los carcinomas de células basales y escamosas examinados no demostraron ser positivas a CD133.
3.2.1. Se observó expresión de CD133 en tejido normal
en la superficie endoluminal o apical de las células de los acinos y los conductos terminales de las glándulas ecrinas normales (Figura 1(a)). Los canalículos intercelulares formados en la membrana lateral de las células ecrinas ubicadas en la porción secretora de las glándulas sudoríparas normales estaban claramente manchados (Figura 1(b)), así como la secreción encontrada en el lumen de los conductos ecrinos. Se observó tinción de glándulas apocrinas normales en los conductos terminales en el borde apical de las células, aunque con una distribución irregular. En las áreas acinares de estas glándulas, donde la secreción de decapitación apocrina era obvia, CD133 mostró solo una tinción débil o negativa.
(a)
(b)
(a)
(b)
CD133 en normal eccrine glándulas manchas de la endoluminal de la superficie de las células y el sudor de la secreción de la glándula (una). También se observan canalículos intercelulares en la membrana lateral de las células ecrinas (b).
3.2.2. Los tumores
CD133 no se expresaron en ninguno de los carcinomas escamosos o de células basales examinados. Utilizando el anticuerpo AC133, los tumores anexos analizados en este trabajo mostraron el siguiente patrón de tinción (que se resume en el Cuadro 1).Tumores Benignos con Diferenciación Ecrina o Apocrina. Todos los casos de espiradenoma ecrino presentaron inmunorreactividad CD133 en la membrana apical de las estructuras tipo conducto presentes dentro de los nódulos tumorales. La superficie luminal de las células epiteliales que forman los quistes uniloculares de todos los casos de hidrocistoma ecrino analizados también fue positiva. Los conductos y pequeños quistes presentes en tres de los seis casos de poroma ecrino mostraron una tinción intensa de la capa celular interna de los túbulos proliferados, y esta tinción se localizó en el borde endoluminal de las células. Los otros tres casos de poroma analizados mostraron el mismo patrón de tinción en la mayoría de los túbulos, pero con un patrón de tinción (++) o (+) de positividad a CD133. Las estructuras en forma de conducto, presentes en los cuatro casos de cilindroma, también mostraron inmunorreactividad en la membrana apical de las células epiteliales. La tinción de los cuatro siringomas condroides fue prominente, y todos los conductos presentes, que formaron estructuras ramificadas ocasionales, mostraron una intensa positividad en la membrana apical (Figura 2). Los conductos dilatados y tortuosos, que conducen a los espacios quísticos de todos los casos de siringocistoadenoma papilífero, mostraron inmunorreactividad en la porción apical de las células epiteliales o en la superficie luminal de los quistes, con una intensidad que osciló entre (++) y (+++) (Figura 3). Los cinco casos diagnosticados como hidradenoma nodular mostraron estructuras aisladas similares a conductos que dieron positivo para CD133 con una tinción apical de las células que formaron los túbulos (Figura 4) que varió en intensidad de (++) a (+++). Los dos casos de hidradenoma de papilífero también mostraron expresión de CD133 en la porción apical de las estructuras glandulares. Solo dos de los seis casos de siringoma examinados mostraron tinción consistente en la superficie luminal de los pequeños conductos que formaron los tumores, que generalmente estaban revestidos por dos capas de células epiteliales cúbicas. Los casos de hidrocistoma apocrino no demostraron ninguna inmunorreactividad positiva.
CD133 positividad en la superficie interna de condroide siringomas la ramificación de los túbulos. No se observa tinción de las células estromales ni de las células epiteliales externas.
proyecciones Papilares de syringocystadenoma papilliferum forrado por pseudostratified epitelio columnar son CD133 positivas. La positividad es muy intensa en la superficie endoluminal.
Lineal CD133 tinción de células columnares revestimiento de los túbulos de un hidradenoma caso. Solo se tiñen las células que se encuentran en la superficie interna de los túbulos.
Tumores Malignos con Diferenciación Ecrina o Apocrina. No se pudo demostrar inmunorreactividad en la superficie luminal de los quistes del caso diagnosticado como carcinoma apocrino. Los dos carcinomas anexos microquísticos analizados en este estudio mostraron una fuerte positividad a CD133 en la superficie apical de las células que formaron la luz grande y pequeña de las estructuras tubulares. Se pudo demostrar la inmunotinción del CD133 en las células muy atípicas que rodeaban las estructuras tubulares del caso del porocarcinoma (Figura 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).
3.3. Caracterización de Cultivos Primarios de Tumores Cutáneos Humanos y Análisis de Citometría de Flujo
Se procesaron siete muestras derivadas de tumores cutáneos humanos con el objetivo de obtener suspensiones unicelulares. Debido a un número insuficiente de células obtenidas de los tumores o a la contaminación fúngica o bacteriana, solo cuatro muestras se cultivaron con éxito y se analizaron para determinar la expresión del epítopo CD133/1 de la superficie celular. Estas biopsias cultivadas con éxito incluyen un porocarcinoma ecrino y tres carcinomas de células escamosas. El examen microscópico de las células cultivadas reveló diferentes morfologías que variaron de manera consistente según el tipo histológico de tumor. Las células del carcinoma de células escamosas mostraron apariencia epitelioide o de células fusiformes, mientras que las células derivadas del porocarcinoma ecrino tenían una forma más redondeada y se agruparon en islotes de células pequeñas y atípicas. La presencia de células epiteliales en estos cultivos se confirmó a través de la expresión positiva de E-cadherina y EpCAM como marcadores epiteliales.
Para determinar si los cultivos de células tumorales de piel contenían una población de células CD133 positivas, utilizamos citometría de flujo para examinar la expresión del marcador de superficie CD133/1 con el anticuerpo AC133. Todas las muestras de carcinoma de células escamosas contenían menos de 0,1% de células positivas, mientras que casi 22% de células positivas se detectaron en el porocarcinoma ecrino. La Figura 6 muestra histogramas representativos de los dos tipos de tumores de piel evaluados.
(a)
(b)
(a)
(b)
CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. El carcinoma de células escamosas muestra tinción negativa para células CD133 y 0% de células CD133 positivas en citometría de flujo.
4. Discusión
El progreso en la biología de las células madre cutáneas y en la comprensión de la carcinogénesis depende en gran medida de la disponibilidad de marcadores específicos para poblaciones distintivas de células madre . Se pueden usar marcadores conocidos de células madre de la piel o de células madre que se han identificado en otros órganos o tumores para la detección de CCC cutáneas. Uno de estos marcadores que se pueden probar en la piel es la proteína CD133 (prominina-1). Los primeros datos que reportaron la expresión de CD133 utilizando el anticuerpo monoclonal AC133, producido contra un nuevo antígeno de glicoproteína de células madre, mostraron que CD133 se expresó selectivamente en células madre hematopoyéticas CD34 y células progenitoras derivadas del hígado fetal humano y la médula ósea, así como de la sangre . Desde entonces, varios informes han demostrado que la prominina-1 se puede usar para identificar y aislar células madre humanas de varias fuentes, incluido el sistema hematopoyético , la próstata , el páncreas o el riñón . Además, se han utilizado anticuerpos monoclonales contra CD133 para identificar y aislar una supuesta población de células iniciadoras de tumores o CCC en varios carcinomas humanos y melanomas malignos . En el glioma, el aumento del número de células cancerosas CD133 positivas, así como la presencia de grupos de estas células, se han propuesto como un factor pronóstico importante, independiente de otros factores como el grado tumoral . Sin embargo, otros estudios, utilizando clones anti-CD133 diferentes y novedosos, han sugerido que la expresión de CD133 no se limita a las células madre y progenitoras y parece expresarse en células epiteliales adultas de tejidos humanos y de ratón . Por ejemplo, usando un clon CD133, llamado 13A4, derivado de prominina-1 de ratón, Weigmann et al. se demostró la expresión de prominina-1 en la superficie apical de células neuroepiteliales y túbulos proximales renales adultos, y Karbanová et al. , utilizando un anticuerpo monoclonal (80B258) generado contra un polipéptido de prominina-1 humana, se observó inmunorreactividad en tejidos humanos adultos, particularmente en epitelios glandulares. Estos resultados indican la necesidad de estudios adicionales para aclarar si el antígeno AC133, que previamente se había encontrado en la citometría de flujo restringido a las células progenitoras CD34 positivas, se expresa en células epiteliales adultas . Se ha sugerido que la expresión variable de CD133 observada está relacionada con la afinidad diferencial de los diversos anticuerpos a varias formas glicosiladas de CD133 . El anticuerpo monoclonal AC133 reconoce un epítopo glicosilado de prominina-1 y, curiosamente, la glicosilación de esta proteína puede cambiar dependiendo del estado de diferenciación celular, o puede alterarse durante el proceso de transformación maligna . En nuestro estudio sobre tumores de piel humanos, hemos observado que la expresión de CD133 depende en gran medida de la formación de conductos de las glándulas sudoríparas y de la secreción de las glándulas sudoríparas. La inmunorreactividad al CD133 se observó principalmente en la superficie apical / endoluminal de estructuras similares a conductos o quistes de la mayoría de los tumores ecrinos benignos y malignos. Ninguno de los tumores estudiados, ni benignos ni malignos, presentó racimos aislados o pequeños de células neoplásicas CD133 positivas en áreas sólidas. Se notificó anteriormente un patrón similar de tinción CD133 de la membrana celular apical de las células secretoras en estructuras tubulares normales, como los túbulos proximales renales o en glándulas tumorales de cáncer colorrectal . También se encontró tinción de CD133 en la superficie apical / endoluminal de las células que forman una luz en los carcinomas de ovario . En estos casos, la localización apical de CD133 ha sido implicada en una posible función secretora de esta molécula. La distribución morfológica de la tinción CD133 demuestra una correlación con estructuras secretoras bien reconocidas de tejidos y glándulas normales, lo que sugiere una relación funcional de CD133 con la secreción. De hecho, en nuestro estudio, los tumores que se sospecha que se originan en las áreas ductales de las glándulas sudoríparas, como los siringomas, mostraron un patrón de tinción menos intenso que los originados en las porciones acinares.
La expresión de CD133 en la superficie celular de células tumorales diferenciadas es un argumento en contra de CD133 como marcador específico de células madre cancerosas en la piel. Sin embargo, no se puede descartar por completo la existencia de una pequeña población de CCC CD133+, como se ha demostrado en otros órganos, donde el CD133 se expresa en la superficie celular de ambos, CCC y células tumorales diferenciadas .
En conjunto, nuestros hallazgos demuestran una expresión inmunohistoquímica específica del anticuerpo AC133 en la superficie secretora de células normales y neoplásicas diferenciadas de glándulas ecrinas. Los experimentos que utilizan este anticuerpo como marcador de CSCs en la piel deben interpretarse con precaución. El anticuerpo AC133 es un marcador sensible y específico de diferenciación glandular cutánea, útil para el diagnóstico de tumores con posible diferenciación ecrina o apocrina.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo técnico a Pedro Javier Benito Castellanos y a Laura Abendaño.
