Resultados

Modulación de los Niveles Celulares de p107 A Través de Proteólisis Controlada. Hemos demostrado previamente que el p107 endógeno, un miembro de la familia de proteínas RB, que no es un sustrato natural de SCFßTrCP, puede eliminarse en las células del carcinoma cervical C33A mediante la expresión ectópica de una ligasa quimérica de proteína ubiquitina ßTrCP (ßTrCP–E7N) que transporta un péptido de unión a p107 derivado de los residuos N-terminales 35-aa de la oncoproteína del VPH, E7 (E7N) (1). Sin embargo, las funciones de muchas proteínas celulares están dictadas por su abundancia intracelular, y no simplemente por su presencia o ausencia. Hasta ahora, no ha habido un método confiable para modular con precisión los niveles de proteínas intracelulares en las células de mamíferos.

Primero investigamos si los niveles de p107 podían reducirse sistemáticamente mediante la expresión controlada de diferentes cantidades de ßTrCP-E7N. Las células del carcinoma cervical C33A humano se infectaron con dosis crecientes de adenovirus recombinante portador de ßTrCP-E7N o el adenovirus control durante 24 h. La infección fue del 100%, incluso a la dosis más baja utilizada, juzgada por la expresión de GFP transportada por el adenovirus en todas las células receptoras (datos no mostrados). Como se muestra en la Fig. 1 (Superior), los niveles endógenos de p107 se redujeron sistemáticamente al 78%, 25% y 5% de los niveles en estado estacionario cuando las células C33A se transducieron con adenovirus ßTrCP-E7N recombinante a los emo de 10, 35 y 80, pero no a las mismas dosis del virus control Ad1. Por lo tanto, el SCFßTrCP-BP diseñado ofrece un medio simple y reproducible para reducir las cantidades totales de proteínas diana a niveles definidos para evaluar los efectos de la dosis en las actividades biológicas.

P107 se asocia de forma estable con ciclina A y Cdk2 a través de un sitio de unión de alta afinidad en células proliferantes (13-15). Para examinar si estas proteínas asociadas a p107 también están sujetas a degradación dirigida por ßTrCP-E7N, se realizó inmunoblotaje en células C33A infectadas por el virus Ad-F-TrCP-E7N. Como se muestra en la Fig. 1, los niveles endógenos de ciclina A y Cdk2 se mantuvieron inalterados, mientras que la p107 se reguló drásticamente a la baja. Además, los niveles de β-actina no objetivo no se vieron afectados por F-TrCP-E7N (Fig. 1). Este resultado proporcionó una fuerte evidencia de que la proteína ubiquitina ligasa ßTrCP-E7N degrada específicamente el sustrato objetivo p107, pero no sus proteínas asociadas.

Degradación Selectiva de una Subpoblación Específica de Proteína Diana Modificada Tras la Traducción. La modificación de una proteína celular a nivel postraduccional, como la fosforilación, es un medio fundamental que las células emplean para regular la función o conferir nuevas actividades de la proteína. Las herramientas experimentales para diseccionar la función asociada a un evento de modificación postraduccional específico son actualmente limitadas. Debido a que protein knockout opera a nivel postraduccional que reconoce directamente las proteínas diana, una aplicación es diseñar un E3 específico que sea capaz de seleccionar una subpoblación de proteínas modificadas postraductivamente para su degradación, en lugar de destruir toda la población.

Se encontró que el VPH16 E7 se unía selectivamente a la forma hipofosforilada de RB (16). Investigamos si la proteína ligasa de ubiquitina ßTrCP-E7N quimérica podía distinguir el RB hipofosforilado e hiperfosforilado y seleccionar solo la hipoforma para la degradación. Las células de osteosarcoma U2OS humano expresan ambas formas de RB que se pueden identificar fácilmente, en función de su diferente movilidad electroforética en el SDS/PAGE (Fig. 2A, carril 1) (17). La identidad de estos dos RB especies fue verificado mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos para cualquiera de hipo – o hiperfosforilada formas de RB (Fig. 2A, carriles 2 y 3). Las células U2OS se infectaron con el Ad-F-TrCP-E7N recombinante o los adenovirus Ad1 de control durante 48 h, y los niveles en estado estacionario de RB-P y RB se analizaron simultáneamente mediante Western blot, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-RB que reconoce ambas formas. Consistente con la unión preferencial de E7N al RB hipofosforilado, la expresión ectópica de F-TrCP-E7N resultó en la eliminación del RB hipofosforilado, mientras que el RB-P hiperfosforilado se dejó intacto (Fig. 2B Superior, compare los carriles 4-6 con los carriles 1-3). Este resultado destaca la capacidad de la ubiquitina-proteína ligasa F-TrCP–E7N de ingeniería para seleccionar una subpoblación específica de RB para la degradación, que se basó en el estado de cierta modificación postraduccional de la proteína diana.

El VPH16 E7 de longitud completa podía interactuar con los inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina p21Waf1 y p27Kip1, pero el dominio de unión se asignó al dominio C-terminal (residuos 40-98), en lugar del fragmento E7N (residuos 18-20). Para examinar más a fondo la especificidad de F-TrCP-E7N, también se probaron los mismos extractos de células U2OS con anticuerpos contra p21Waf1 y p27Kip1. Como se ve en la Fig. 2B (Medio), los niveles de estado estacionario de p21Waf1 y p27Kip1 permanecieron inalterados. En conjunto, la F-TrCP-E7N de ingeniería demostró especificidad proteolítica hacia las proteínas de la familia RB, pero no hacia otros reguladores del ciclo celular como Cdk2, ciclina A, p21Waf1 y p27Kip1.

Mutagénesis Basada en Estructuras para Generar una Ligasa de Proteína Ubiquitina ßTrCP-E7N Altamente Específica. El ßTrCP-E7N quimérico todavía es capaz de unirse a los sustratos ßTrCP endógenos, incluyendo IkB, β-catenina y ATF4 (3-7). La sobreexpresión de ßTrCP-E7N podría interferir con la degradación de estos sustratos nativos. Por el contrario, la unión del sustrato endógeno a ßTrCP-E7N podría interferir con el posicionamiento adecuado del sustrato previsto para aceptar ubiquitina de la enzima conjugadora de ubiquitina y, por lo tanto, reducir la eficiencia de la degradación dirigida (Fig. 3AUpper). Además, ßTrCP interactúa con un pseudo sustrato hnRNP-U, que ata ßTrCP y sus derivados en el núcleo e impide su interacción con los sustratos (21). Al introducir mutaciones específicas de los residuos de aminoácidos en ßTrCP para eliminar su unión a β-catenina, IkB o hnRNP-U, anticipamos mejorar no solo la especificidad, sino también la disponibilidad del ßTrCP-E7N diseñado para reclutar el sustrato deseado (Fig. 3 inferior).

El dominio de unión al sustrato de ßTrCP contiene siete repeticiones WD40 en la región C-terminal, que se pliegan en la típica estructura de hélice β de siete palas conservada entre las proteínas WD40 (3-7). Debido a que la integridad general de la estructura de hélice β de las proteínas WD40 es crítica para sus funciones, el enfoque de mutagénesis de deleción estándar probablemente inducirá alteraciones estructurales macroscópicas y, por lo tanto, no es aplicable para definir los sitios de unión al sustrato en ßTrCP. Sin embargo, la estructura cristalina conocida de las proteínas WD40 se puede explotar para identificar residuos superficiales involucrados en la unión de sustratos ßTrCP. Se diseñó un enfoque de mutagénesis basado en estructuras para identificar y mutar cinco residuos con carga positiva (R285, K365, R474, R521 y R524), que se prevé residan en la superficie superior de la hélice β WD40, que participan en la unión a proteínas asociadas a WD40 (Fig. 3B) (22). Este enfoque se detalló en Métodos de apoyo, que se publica como información de apoyo en el sitio web de la PNAS. También, ver Fig. 6, que se publica como información de apoyo en el sitio web de la PNAS. Además, es probable que las sustituciones de estos residuos de Lys/Arg no alteren la estructura general de ßTrCP.

Mediante el uso del kit de mutagénesis multisitio dirigido a QuikChange (Estratageno), hemos mutado simultáneamente estos residuos a Glu. Este mutante compuesto marcado con BANDERA, designado F-TrCP (m1) – E7N, fue probado para su unión tanto a los objetivos knockout endógenos (IkB) como a los previstos (p107). Las células HeLa se transfectaron transitoriamente con F-TrCP (m1)-E7N o F-TrCP-E7N, y sus interacciones con IkB y p107 se determinaron por coinmunoprecipitación. F-TrCP-E7N y F-TrCP exhibieron afinidades similares a la proteína IKB fosforilada, mientras que las mutaciones del compuesto m1 abolieron la unión a F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3C Central). Por el contrario, se detectaron niveles similares de p107 en los inmunocomplejos de F-TrCP-E7N o F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3C Inferior), lo que indica que la ligasa de proteína ubiquitina F-TrCP(m1)-E7N de ingeniería es completamente funcional para reclutar los objetivos celulares previstos. Estos resultados están de acuerdo con las predicciones estructurales de la Fig. 3B, y definir aún más los residuos de aminoácidos en ßTrCP críticos para el reconocimiento de sustrato endógeno.

El F-TrCP(m1)-E7N diseñado se analizó más a fondo para determinar su potencia en la degradación de p107 endógeno. Las células C33A se cotransfectaron con F-TrCP, F-TrCP-E7N o F-TrCP(m1)-E7N, junto con un plásmido de expresión CD19. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recolectaron y enriquecieron para aquellos que recibieron los plásmidos transfectados utilizando las perlas inmunomagnéticas conjugadas con el anticuerpo monoclonal anti-CD19. Los niveles endógenos de p107 se determinaron posteriormente mediante inmunoblotaje. Como se muestra en la Fig. La expresión ectópica en 3D de F-TrCP(m1)-E7N resultó en una reducción del 95% de los niveles endógenos de p107, mientras que se observó una reducción del 82% de p107 para F-TrCP-E7N (Fig. 3D Superior, comparar carriles 4 y 3). Además, la expresión de F-TrCP(m1)-E7N no tuvo un efecto observable sobre la degradación inducida por el factor de necrosis tumoral (TNF)-α de IkB por el SCFßTrCP nativo, o sobre la destrucción de p27kip1 por las ubiquitinas ligasas de proteínas SCFSkp2 (datos no mostrados). Por lo tanto, la expresión ectópica de la F-TrCP(m1)-E7N de ingeniería no interfiere con la actividad general de ubiquitinación del SCF al silenciar los componentes centrales del SCF (Skp1, CUL-1 y Rbx1/Roc1) compartidos por las proteínas endógenas de la caja F.

La degradación de p107 dirigida se evaluó más a fondo en células C33A individuales mediante ensayo de inmunofluorescencia indirecta. De manera consistente, p107 se erradicó en gran medida en células C33A que expresaban F-TrCP-E7N o F-TrCP(m1)-E7N, pero no solo F-TrCP (Fig. 3E). Colectivamente, estos resultados indican que al eliminar los sitios de unión de los sustratos endógenos ßTrCP, la ubiquitina ligasa proteica F-TrCP(m1)-E7N demostró una mayor especificidad y una actividad proteolítica robusta hacia el objetivo previsto.

Dominio de Unión Mínimo como Péptido Objetivo para un Reclutamiento Eficiente del Sustrato. Para lograr una alta especificidad del reclutamiento de sustrato y minimizar la orientación inespecífica de otras proteínas celulares, probamos si el dominio de interacción p107/RB mínimo de E7N (designado E7m), que abarca los residuos 21-29 de E7 que abarcan el motivo LXCXE (23), podría lograr una unión y degradación eficientes de p107. Se construyó una ligasa quimérica de proteína ubiquitina en la que ßTrCP y E7m se unían covalentemente mediante un espaciador flexible de 20 aa compuesto de 10 copias de repeticiones Gly-Ser (designadas 10G). El F-TrCP-E7N o el F-TrCP-10GS-E7m se transfectaron transitoriamente a células C33A, y su unión al p107 endógeno se evaluó mediante inmunoprecipitación en extractos preparados después del tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 para inhibir la degradación como consecuencia de esta interacción. Como se muestra en la Fig. 4A (carriles 2 y 3), el F-TrCP-10GS-E7m tenía una afinidad ligeramente mayor a p107 que la del F-TrCP-E7N original. El F-TrCP-E7N y el F-TrCP-10GS-E7m se evaluaron más a fondo para determinar su eficiencia en la degradación de p107 por transfección transitoria en células C33A, como en la Fig. 3D. Como se muestra en la Fig. 4B, F-TrCP-E7N y F-TrCP-10GS-E7m indujeron hasta un 92% y un 95% de regulación descendente de p107, lo que indica que el ßTrCP diseñado que lleva el dominio de unión mínima a p107 funciona de manera tan eficiente como el F-TrCP-E7N original en la degradación de proteínas diana.

Administración por Retroviral del ßTrCP de Ingeniería para la Degradación Sostenida de Dianas Endógenas. A continuación, examinamos si las ligasas de proteína ubiquitina de ingeniería podían expresarse de forma estable para lograr una degradación sostenida del objetivo previsto. Las células leucémicas promielocíticas HL-60 se transducieron con retrovirus recombinantes que expresaban PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N o el control F-TrCP-E7N(ΔDLYC), en los que se eliminó el sitio de unión de RB/p107 (1). Las células infectadas con transgenes quiméricos de F-TrCP cromosómicamente integrados se aislaron mediante clasificación FACS, basada en la expresión de GFP de los virus, y se evaluó la degradación del p107 endógeno de las células HL-60 infectadas inmediatamente después de la infección (Fig. 5A), o después de 3 meses de cultivo en medio de crecimiento (Fig. 5B). Además, debido a que otros dos miembros de la familia de proteínas RB, RB y p130, también se expresan en células HL-60, examinamos si una sola F-TrCP-E7N puede apuntar simultáneamente a la degradación de toda la familia de proteínas RB que interactúan con el mismo motivo LXCXE de E7N. La expresión ectópica de F-TrCP-E7N transducida retroviralmente indujo una drástica reducción de la forma hipofosforilada de RB, así como de p107 (Fig. 5A) y p130 (datos no mostrados) en células HL-60, ya sea inmediatamente después de la infección y de la clasificación de FACS (Fig. 5A), o 3 meses después de la infección y el cultivo continuo (Fig. 5B, carril 3). Por el contrario, la expresión estable de F-TrCP-E7N(ΔDLYC) en células HL-60 no tuvo efecto en la alteración de p107, RB (Fig. 5A, carril 3) y niveles p130 (datos no mostrados). Consistente con la observación de que F-TrCP-E7N degrada preferentemente RB hipofosforilado en células U2OS (Fig. 2), la reducción de especies de RB hiperfosforiladas por la expresión estable de F-TrCP-E7N fue menos pronunciada, en comparación con la de la forma hipofosforilada en células HL-60 (Fig. 5A, compare el carril 2 de pRB y pRB-P).

En tratamiento con ácido transretinoico total (ATRA), las células HL-60 salen del ciclo celular y se someten a diferenciación terminal. Se observó una acumulación de RB hipofosforilado, que previamente se informó que contribuía a la detención del crecimiento inducida por ATRA, mientras que el RB hiperfosforilado no era detectable (24, 25). Para examinar si la maquinaria SCFßTrCP también se puede aprovechar durante la salida del ciclo celular, las células HL-60 que expresan de forma estable F-TrCP-E7N o F-TrCP(m1)-E7N se trataron con ATRA de 1 µM durante 72 h, y se evaluó la degradación de las proteínas de la familia RB. Las células HL-60 que expresaban de forma estable F-TrCP-E7N produjeron una disminución del 95%, 98% y 85% de los niveles de RB, p107 y p130, respectivamente, en comparación con las células infectadas con el virus pBMN-GFP de control (Fig. 5B, carril 2). Debido a que ATRA también activa la transcripción de genes bajo el control del virus de la leucemia murina Moloney LTR de pBMN-GFP (26), el aumento de la expresión de F-TrCP-E7N en el tratamiento con ATRA probablemente contribuyó aún más a la regulación a la baja eficiente de p107, p130 y RB hipofosforilado (Fig. 5B).

El efecto de las proteínas de la familia RB en la progresión normal del ciclo celular se ha examinado en fibroblastos de embriones de ratón con alteraciones en los genes RB, p107 y p130, y se ha encontrado que no responde a las señales que inducen la detención de G1, como la retirada del factor de crecimiento o el daño al ADN (27, 28). Sin embargo, no se han estudiado los efectos colectivos de los miembros de la familia RB en la proliferación de células tumorales, debido a la falta de herramientas genéticas reversas eficientes. Las células HL-60 estables que expresan F-TrCP(m1)-E7N de este estudio nos permitieron evaluar cómo las células tumorales deficientes para las tres proteínas de la familia RB respondieron a las señales de detención G1. En células HL-60 de crecimiento exponencial que expresaban F-TrCP(m1)-E7N que inducían la degradación constitutiva de las proteínas de la familia RB, se observó una marcada aceleración de la progresión del ciclo celular en comparación con las infectadas por el virus control pBMN-GFP (Fig. 5C Izquierda). Este resultado es consistente con el deterioro del control de las transiciones G1–S observadas en fibroblastos embrionarios de ratón RB–/–, p107–/– y p130–/– triple knockout (27, 28).

El tratamiento ATRA inhibió la transición de la fase G1 a la fase S en células HL-60 infectadas por el pBMN-GFP de control (Fig. 5C) o virus F-TrCP-E7N(ΔDLYC) (datos no mostrados), que es consistente con lo reportado para células HL-60 no infectadas (Fig. 5C) (24). También se observó un retraso inicial en la transición G1–S en células pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 a las 48 h después de ATRA. Sin embargo, no se pudo lograr una detención completa de G1 en la etapa posterior (72-96 h) y las células continuaron el curso de la progresión del ciclo celular (Fig. 5C). En contraste, todas las células de control pBMN-GFP/HL-60 se bloquearon en G1 entre 72 y 96 h. Estas observaciones sugieren que la degradación mediada por F-TrCP(m1)-E7N de los miembros de la familia de RB perjudica un evento de respuesta ATRA tardía necesario para completar la detención del crecimiento, mientras que la atenuación temprana de la progresión de G1-S no se vio afectada en gran medida. Además, se observó una reducción drástica del número de células entre las 72 y las 96 h después del tratamiento con ATRA debido a la muerte celular masiva durante la salida y diferenciación del ciclo celular inducida por ATRA (29). Sorprendentemente, las células HL-60 que expresaban F-TrCP(m1) – E7N mostraron un aumento promedio de 2 a 3 veces en las poblaciones subG1 en comparación con las células HL-60 infectadas por el virus de control (datos no mostrados), lo que es consistente con el aumento de la muerte celular en células de fibroblastos embrionarios de ratón RB -/–, p107–/– y p130–/– triple knockout en condiciones inhibidoras del crecimiento (28). Colectivamente, la expresión constitutiva de F-TrCP (m1)-E7N indujo una regulación descendente de todas las proteínas de la familia RB, lo que conduce a una inhibición de la detención del crecimiento y un aumento de la muerte celular en el tratamiento con ATRA.

La detención G1 inducida por ATRA implica la regulación coordinada de múltiples señales/componentes celulares que controlan negativamente el ciclo celular(revisado en ref. 30). Dimberg et al. (31) informaron que ATRA desencadena una secuencia de eventos en células mieloides que implican un aumento temprano de la expresión de p21waf1, estabilización de p27kip1 y, más tarde, desfosforilación de RB al inicio de la detención de G1. Debido a que la ßTrCP(m1)-E7N solo degrada a los miembros de la familia RB y no tiene ningún efecto en la estabilidad de p21waf1 y p27kip1, es probable que solo se vea afectada la respuesta ATRA tardía, dependiente de RB, que es consistente con la resistencia de las células pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 para completar el arrestat72-96 h de G1 (Fig. 5C). La inhibición temprana del crecimiento observada por ATRA a las 48 h (Fig. 5C) podría atribuirse, al menos en parte, a la regulación ascendente de p21waf1 y p27kip1, cuya estabilidad no se ve afectada por la expresión constitutiva de F-TrCP(m1)-E7N (Figs. 2 y 5).