La zanahoria (Daucus carota) es una planta bienal sazonada en invierno que se cultiva por su raíz principal comestible. Es una de las verduras más consumidas y producidas debido a su variedad dietética en color, sabor, fibra y vitamina A, así como su consumo en formas crudas y cocidas. Cada año se producen más de 20 millones de toneladas para el consumo humano.

Las prácticas de cultivo de tejidos han sido muy populares en la clonación de plantas. El primer estudio de cultivo de tejido de zanahoria fue reportado en 1939 por Gautheret y Nobecourt. Sin embargo, Steward et al. y Reinert reportó el primer estudio de «embriogénesis de zanahoria»; trataron de cultivar las raíces usando suspensión celular y cultivos de callos.

La embriogénesis somática es un método eficiente para comprender e investigar los aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos del cultivo de células vegetales.

Muchos estudios sobre el cultivo de tejido de zanahoria llevaron al desarrollo de un método simple de embriogénesis en zanahorias. De acuerdo con el método, el crecimiento de cultivos de zanahoria se puede inducir simplemente eliminando la hormona 2,4-D de los cultivos de suspensión celular. Ahora, la zanahoria se usa a menudo como modelo experimental para el análisis de la embriogénesis somática en varios laboratorios de todo el mundo.

Material y equipo Necesarios para el Establecimiento del Cultivo

Materiales esterilizados

• 5 Cultivo de callo friable de zanahoria, no contaminado y mantenido a 25 ℃.
• 5 matraces Erlenmeyer (250 ml), que contienen medio de cultivo con 5 x 10-8 g/ml 2, 4-D.
• 5 cilindros de medición (100 ml) con tapas de aluminio.
• 2 espátulas.
• 25 hojas de papel de aluminio (100 x 100 mm).
• 2 piezas de tamices de nailon o acero inoxidable con una porosidad de 250 µm, que se pueden insertar en la abertura de los cilindros de medición.
• 5 placas de petri.

Materiales no esterilizados

• Pluma de marcado impermeable
• Agitadora rotativa
• Quemador Bunsen
• 1 matraz Erlenmeyer (150 ml) que contiene etanol al 95%
• Parafilm

Procedimiento para Iniciar y Establecer el Cultivo

1. Tome los tubos de cultivo de callos, esterilice la boca de los 5 tubos y transfiera el callo a la placa de Petri por separado (5 callos en 5 placas de Petri).
2. Tome un matraz canónico de 250 ml que contenga el medio de cultivo y 2, 4-D.
3. Transfiera los 5 calli de la placa de Petri a 5 matraces canónicos, por separado.
4. Llama / esteriliza la boca de los frascos y cúbrelos con la tapa. Sujete la tapa con parafilm.
5. Coloque todos los frascos que contienen el cultivo en la máquina agitadora rotativa en intensidad de luz oscura o baja a 25 ℃.
6. Después de 7 días, transfiera los frascos del agitador a una habitación estéril.
7. Retire el parafilm y la tapa de aluminio de cada matraz y esterilice la boca de los matraces.
8. Transferir la suspensión de cada matraz a un cilindro estéril de 100 ml por separado pasándolo a través de un tamiz.
9. Deje que el contenido se asiente durante 10 minutos y luego deseche el sobrenadante.
10. Transferir los residuos de células que quedan en la botella de medición a un matraz de 250 ml que contenga 60 ml de medio fresco.
11. Repita el paso 10 para cada matraz de cultivo.
12. Ponga los cinco frascos en el agitador de nuevo.
13. Después de 7 días, repita el procedimiento que haya realizado anteriormente (del paso 6 al 10). Sin embargo, esta vez solo tome 1/5 de las células residuales como inóculo.
14. Repita el procedimiento entre 3 y 4 veces. Al hacerlo, solo quedarán células individuales o agregados pequeños en la suspensión de zanahoria.
15. Para la suspensión de células de zanahoria, el número de células adecuadas oscila entre 105 y 3 x 105 células/ml o entre 100 y 300 mg (peso fresco) de inóculo en un volumen de 60 ml de medio fresco que contiene medios y 5×10-8 g/ml, 2,4-D.
16. Es apropiado un período de transferencia de 7 días para que la zanahoria obtenga células individuales en el cultivo de suspensión.

Approximate Schedule of the Culture

Event	Timing (approximate)
Initiation of cell suspension and determination of total cell number and PCV (packed cell volume)	Day 0
First transfer of cultures	Day 8
Fourth transfer of cultures	Day 29

Result

What should you observe while experimenting? Aquí hay algunos puntos para recordar mientras anota sus resultados.

• Fecha y duración del experimento.
• El número de cultivos y tratamientos aplicados.
• Registrar la morfología y el número de cultivos infectados en un intervalo de tres semanas.
• Determinar el PCV (volumen de células empaquetadas) al principio y al final de la transferencia del cultivo.
• Estimar el número total de células después de 3 subculturas, en los días 1, 2, 4 y 7, y trazar un gráfico contra el tiempo.
• Estudiar la relación entre la densidad del inóculo y el patrón de crecimiento.

El cultivo en suspensión proporciona un beneficio sobre otros cultivos, ya que permite el movimiento del tejido en el medio de cultivo que facilita el intercambio gaseoso. Además, elimina cualquier polaridad del tejido y el gradiente de nutrientes dentro y en los medios.

Aplicación de Cultivo de Tejidos para Zanahoria

1. Para clonar las raíces principales.
2. Para estudiar la forma mutante de las zanahorias.
3. Estudiar las respuestas fisiológicas de la zanahoria que también pueden facilitar la comprensión de otras plantas.
4. Estudiar el crecimiento y desarrollo de la zanahoria a partir de una sola célula.
5. Para estudiar la respuesta al estrés de la zanahoria que también proporciona una idea de las respuestas de otras plantas.
6. Para generar cientos de plantas transgénicas a partir de la suspensión de células individuales para cualquier propósito experimental.Reinert J. y Yeoman M. M. (1982). Plant Cell and Tissue culture: A laboratory manual (en inglés). Springer-Verlag, Berlín Heidelberg, Nueva York.
7. Hardegger M., Shakya R. (2004) Transformation of Carrot. En: Curtis I. S. (eds) Transgénic Crops of the World. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2333-0_22. Crecimiento y división de células de zanahoria en cultivo en suspensión. (1970). Fisiología Vegetal y Celular. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.pcp.a074564.
8. https://www.atzlabs.com/prodcut-info/C1955-Carrot -…