Secuenciación automatizada de ADN por electroforesis capilar
La separación de los productos de una reacción de secuenciación dideoxi marcada radiactivamente o fluorescente se ha realizado históricamente en un gel de losa de poliacrilamida, por ejemplo, el tipo utilizado en un ABI 377 de 96 carriles. Los inconvenientes de este método incluyen la necesidad de preparar un gel nuevo para cada secuencia, carga manual de muestras en el gel, tiempos de ejecución relativamente largos (8 ~ 10 horas para la resolución de un fragmento de ADN de 1 Kb) y dificultades en el seguimiento automático y/o manual de los carriles.
Un método de separación alternativo utiliza electroforesis capilar. Se preparan una serie de reacciones de secuenciación de ADN dideoxi estándar, cada una en un pocillo de una placa de 96 pocillos de 8 filas x 12 columnas. Una serie de tubos capilares ultrafinos (0.diámetro interior de 1 mm, de 50 a 80 cm de longitud) se rellenan con una mezcla de perlas de resina y se colocan en una matriz multicapilar. Un extremo de la matriz está montado en una placa de cátodo cargada negativamente para que sus extremos se alineen con cada pocillo de la placa de muestra. La aplicación de alto voltaje hace que el ADN etiquetado en cada pozo de muestra ingrese al capilar correspondiente y migre hacia el depósito de ánodo cargado positivamente. Debido a los altos voltajes utilizados, la separación electroforética requiere solo 1 ~ 3 horas. Al igual que en la electroforesis en gel de losa, los fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente que los más grandes . Los tintes de las etiquetas finales son activados por un láser en la ventana del detector, y la longitud de onda de fluorescencia de cada fragmento es leída por un fotómetro a medida que pasa por un punto fijo. A diferencia del sistema de gel de losa, el láser y el fotómetro son fijos e inamovibles, y pueden activar y leer múltiples capilares uno al lado del otro simultáneamente como flujos de datos separados: esto evita el problema de rastrear carriles separados en un gel de losa. Los datos de movilidad se envían a una computadora y se genera un cromatograma para cada muestra que es esencialmente idéntico a los del sistema de gel de losa.
Los secuenciadores capilares suelen utilizar un robot para cargar automáticamente una pila de placas de muestra. El conjunto capilar se lava con tampón entre las placas, de modo que la máquina se puede dejar sin supervisión durante muchas tiradas. En las instalaciones más grandes, las reacciones de PCR también pueden vincularse directamente a placas de secuenciación en estaciones de trabajo robóticas que dan servicio a docenas o cientos de secuenciadores capilares. Los datos del cromatograma se colocan en un servidor y los usuarios pueden descargarlos a cientos o miles de kilómetros de distancia. Las economías de escala pueden hacer que sea más barato externalizar la secuenciación de ADN en lugar de comprar, mantener y dotar de personal a una máquina interna.
