Resumen

Los canales de calcio Cav1.2 de tipo L dependiente de voltaje acoplan la despolarización de la membrana al aumento transitorio de la concentración de Ca2+ libre citoplasmática que inicia una serie de funciones celulares esenciales, incluidas la contracción del músculo cardíaco y vascular, la expresión génica, la plasticidad neuronal y la exocitosis. La inactivación o terminación espontánea de la corriente de calcio a través de Cav1.2 es un paso crítico en la regulación de estos procesos. La importancia fisiopatológica de este proceso se manifiesta en hipertensión, insuficiencia cardíaca, arritmia y una serie de otras enfermedades en las que la aceleración de la descomposición de la corriente de calcio debería presentar una función de beneficio. El tema central de este trabajo es la inactivación del canal de calcio Cav1.2 mediada por múltiples determinantes.

1. Introducción

La corriente interna de Ca2+ controlada por voltaje () es un mecanismo común de aumento transitorio de la concentración citoplasmática de Ca2+ libre desencadenada por la despolarización celular. Esta forma de señalización de Ca2 + activa procesos celulares esenciales que incluyen la contracción cardíaca , la regulación del tono muscular liso , la expresión génica, la plasticidad sináptica y la exocitosis . La terminación completa y rápida de la afluencia de Ca2+ está mediada por un intrincado mecanismo de inactivación espontánea del canal de calcio, que es crucial para prevenir la sobrecarga de Ca2+ de la célula durante los potenciales de acción y la restauración de la concentración de Ca2+ libre citoplasmática en reposo por debajo de µM . Este artículo se centrará en la base molecular y los múltiples determinantes de la inactivación del canal de calcio Cav1.2.

2. Cav1. 2: Retos y soluciones

2.1. Complejidad molecular

El canal de calcio Cav1.2 es un complejo oligomérico compuesto por las subunidades A1c, α2δ y β . El poro del canal iónico está formado por el péptido a1C (Figura 1) que está codificado por el gen CACNA1C. Las subunidades auxiliares β y α2δ son esenciales para la expresión funcional y la segmentación por membrana plasmática (PM) del canal . Existen en múltiples isoformas genómicas generadas por cuatro genes CACNB (CACNB1-4) y tres genes CACNA2D (CACNA2D1–3). Las tres subunidades están sujetas a empalmes alternativos. Añadiendo a la complejidad de la Cav1.2 organización molecular, subunidades beta tienden a oligomerizar . En conjunto, la variabilidad genómica, el empalme alternativo y la heteroligomerización generan una plétora de variantes de empalme Cav1.2 que se expresan en células de manera dependiente de la especie, el tejido y el desarrollo, mientras que el cambio de su equilibrio fino puede tener consecuencias fisiopatológicas significativas .

Figura 1.

la topología Transmembrana de la α 1C de la subunidad. Para ilustrar los sitios de diversidad molecular, la secuencia de polipéptidos está segmentada esquemáticamente de acuerdo con el mapa genómico CACNA1C y los exones invariantes (negros) y alternativos (azules) correspondientes están delineados por barras negras y numerados (1-50). Se cree que cuatro regiones de homología (I–IV), cada una compuesta de 6 segmentos transmembranarios (numerados), se pliegan alrededor del poro central. el dominio de interacción α (AID) de un sitio de unión β constitutivo se muestra en verde. Los motivos LA e IQ (rojo) constituyen el dominio de unión a calmodulina (CBD).

2.2. Desafíos en la Selección de la Célula Huésped

La diversidad natural de Cav1. 2 complica la interpretación de los datos obtenidos de células nativas, y mucho menos de los datos de un solo canal. Esto subyace a la importancia de la investigación Cav1.2 en sistemas de expresión recombinante donde la composición molecular del canal y la estructura de sus constituyentes están predefinidas. Sin embargo, este enfoque experimental encontró el principal problema de la selección de una célula huésped apropiada.

La mayoría de los estudios de los canales de calcio se realizaron con células HEK293. Estas células proporcionan una alta eficiencia de expresión de canales recombinantes de Ca2+, pero, desafortunadamente, contienen canales de calcio endógenos que exhiben corrientes de Ca2+ de hasta 3 pA / pF . Por lo tanto, las células HEK293 permiten el estudio adecuado de los canales recombinantes Ca2+ solo cuando la amplitud de la corriente es lo suficientemente grande como para ignorar la contribución de los canales endógenos. La evaluación correcta de los determinantes funcionales de los canales Ca2+, sin embargo, requiere el uso de células huésped que estén completamente libres de subunidades de canal Ca2+ endógenas. Las células COS1 o COS7 se adaptan bien a este requisito porque no generan corriente de calcio apreciable, no contienen subunidades de canal Ca2+ endógenas ni sus precursores, y no muestran inducción de subunidades Cav1.2 endógenas en respuesta a la expresión de las recombinantes . Los parámetros cinéticos y la dependencia de voltaje de la activación e inactivación de las corrientes de canal Cav1.2 medidas en células COS1 son consistentes con los datos obtenidos en otros sistemas de expresión . Una ventaja importante de las células COS es su tasa de división relativamente lenta que permite un mejor control de la eficiencia de expresión y ensamblaje de las subunidades de canal Cav1.2 de diferentes tamaños.

2.3. Problemas de Etiquetado y Medición Fluorescentes

La fusión de fluoróforos similares a GFP a los terminales N y / o C del a1C recombinante o al terminal N de β no cambia marcadamente las propiedades electrofisiológicas de los canales expresados, permite la aplicación de microscopía fluorescente y FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) al estudio de la distribución subcelular y el ensamblaje de Cav1.2, así como aspectos intrincados de la arquitectura molecular y la dinámica del canal. El canal conserva las principales características electrofisiológicas sin cambios cuando la secuencia terminal C de a1C codificada por exones distales 46-50 (Figura 1, residuos 1833-2138 en a1C,77) es reemplazada por ECFP. Sin embargo, el A1C fusionado por sus terminales N – o/y C al EYFP es altamente sensible al fotoblanqueo que lo inactiva irreversiblemente. Conocida como inactivación de luz asistida por fluoróforo (FALI), esta interesante propiedad limita la aplicabilidad del fotoblanqueo de aceptadores para las mediciones de TRASTE en Cav1.2 debido a la incertidumbre en el estado funcional del canal . Sin embargo, el análisis ratiométrico del TRASTE corregido entre los fluoróforos, fusionados a las colas de las subunidades a1C y/o β, refleja los reordenamientos estructurales reversibles dependientes del estado del canal inducidos por los cambios de voltaje de la transmembrana bajo la abrazadera de parche .

2.4. Cav1. 2 Recombinante: ¿Qué Necesita para la Expresión Funcional y Cómo Aparece?

Las propiedades típicas de un Cav1.2 recombinante «salvaje» se ilustran en la Figura 2(A) utilizando un ejemplo de la isoforma humana ubicua a1C,77 (GenBank no. z34815). Cuando el a1C marcado con EYFP se expresó en células COS1 solas, la proteína del canal marcado con fluorescentes se distribuyó difusamente sobre el citoplasma y no generó corriente de calcio medible (Figura 2(A), panel a)). El análisis cuantitativo de la distribución de a1C entre la PM y el citoplasma (Figura 2(B)) confirmó la falta de un objetivo significativo de PM por parte de a1C de forma independiente en la presencia de α2δ (barras a y b). Expresión de Cavß en ausencia de PM estimulado por α2δ dirigido a a1C, pero el canal permaneció en silencio (Figura 2 (A), panel c) a menos que α2δ fuera coexpresado (panel d). Por lo tanto, las subunidades β y α2δ son suficientes para el canal funcional; bajo estas condiciones experimentales, las subunidades β estimulan el objetivo de PM del complejo de canal y, en presencia de α2δ, facilitan la apertura de voltaje del canal Cav1.2.

Figura 2

Papel de la Cav1.2 subunidades auxiliares. A) Imágenes epifluorescentes de las células COS1 que expresan la distribución de EYFPN-α 1C obtenidas con el filtro YFP (barras de escalado, 4 µm) y trazas de la corriente máxima de calcio registrada en respuesta a pasos de 600 ms hasta +30 mV desde el potencial de retención mV (izquierda). (B) distribución Relativa de EYFPN-α 1C en la membrana plasmática (PM) sobre el citoplasma en ausencia (a) o presencia de α 2δ (b), β 2d (c), o α 2δ + β 2d (d). La relación de intensidad de fluorescencia en PM sobre el área debajo de PM se promedió después de la sustracción de fondo en cada célula. La proporción es inferior a 1.0 indica la falta de un objetivo significativo de partículas por α 1C.*.

La forma y apariencia de la corriente pico de calcio mostrada en la Figura 2(A) (panel d) es bastante típica para el Cav1.2 de modulación β2 . Sus principales características incluyen la tasa de descomposición relativamente lenta y una gran fracción de la sostenida restante al final del pulso despolarizante . Está claro que durante los potenciales de acción de larga duración, tales propiedades pueden conducir a una sobrecarga de calcio patógeno de la célula si no se equilibra con mecanismos compensatorios robustos. Fue el papel definitivo de Cav1.2 en la definición de la duración del potencial de acción en las células cardíacas que desencadenó la investigación y el desarrollo de bloqueadores de los canales de calcio, una clase de fármacos que a estas alturas tiene un mercado de mil millones de dólares. Es este papel de Cav1.2 el que estimula el interés actual por la identificación de determinantes moleculares de la inactivación de Cav1.2 con la esperanza de encontrar fármacos más específicos y eficaces.

2.5. Por último, pero No menos importante, una complicación: Agrupamiento Cav1.2

Un solo miocito ventricular contiene ~300,000 canales Cav1 .2, pero solo ~3% de los canales están abiertos en el pico. Contrariamente a la creencia popular, los canales Cav1.2 no están distribuidos uniformemente sobre la membrana plasmática. En las células neuronales y musculares cardíacas nativas, forman grandes grupos. La obtención de imágenes de una sola molécula de los canales recombinantes funcionales EYFPN-a1C/ß2a/α2δ expresados en células HEK293 reveló grupos compuestos de ~40 canales que eran móviles en la membrana plasmática . Tanto la espectroscopia de correlación de fluorescencia como la recuperación de fluorescencia después de los experimentos de fotoblanqueo arrojaron una constante de difusión lateral de µm2 / s. La importancia funcional de la movilidad de los clústeres Cav1. 2 no está clara. Se cree que en las células del músculo cardíaco tal movilidad puede ser restringida por interacciones con otras proteínas, por ejemplo, receptores de rianodina . El tamaño de los grupos Cav1.2 y su densidad específica en la membrana plasmática dependen del tipo de subunidad β expresada . La distancia entre los terminales de las subunidades vecinas a1C varía de 67 Å con ß1b neuronal/cardíaco a 79 Å con β3 vascular. La mayor densidad de cúmulos Cav1.2 en la membrana plasmática y el tamaño de cúmulo más pequeño se observaron con ß1b presente. La comprensión de los mecanismos moleculares que definen la arquitectura y las propiedades de los clústeres Cav1.2 es importante para comprender mejor la fisiopatología del acoplamiento entre la actividad Cav1.2 y las respuestas inducidas en la transducción de señales Ca2+.

3. Inactivación Dependiente de voltaje y Ca2+del Canal de Calcio Cav1.2

En el caso de los canales de calcio Cav1.2, dos mecanismos diferentes controlan la inactivación de corriente de Ca2+. Un mecanismo es impulsado por iones Ca2+ en el lado citoplasmático de la membrana plasmática, mientras que el otro depende del voltaje de la transmembrana. Experimentalmente, el reemplazo de Ca2 + por Ba2+ como portador de carga elimina la inactivación dependiente de Ca2+(CDI), de modo que los canales de calcio conductores de Ba2+se inactivan de manera dependiente del voltaje mediante mecanismos rápidos (FI) y lentos (SI). Estos tres mecanismos de inactivación, FI, SI y CDI, y sus principales determinantes se ilustran en la Figura 3.

Figura 3

los determinantes Moleculares de la Cav1.2 inactivación. Comparación del Cav1 de tipo salvaje.2 (A) con el mismo canal privado de determinantes CDI (B) y SI (C). Los cinco paneles horizontales muestran (a) la disposición de los determinantes críticos de la inactivación. ADSI se compone de aminoácidos hidrofóbicos conservados en la posición a -2 de segmentos S6 en repeticiones II, III y IV(círculos amarillos: Ala, Val e Ile, resp.), así como residuos Ser en la posición -1 de IS6 (círculo cian). El dominio de unión de levas (CBD) de la cola C α 1C se muestra mediante un rectángulo redondeado rojo. Una subunidad β (verde) se une al dominio de interacción α en el enlazador entre las repeticiones I y II, y, de una manera dependiente de Ca2+, a la región de CI de la subunidad C-cola α 1C (, no se muestra). La estructura distal de β 2 (β 2CED, bola azul) se une al CBD . b) Evidencia de coinmunoprecipitación de las subunidades indicadas. (c) Trazas normalizadas de (negro) y (rojo), y (d) dependencia de voltaje de (rojo) y constante de tiempo de FI (, negro) se presentan para ilustrar la CDI en (A) y la falta de CDI en (B) y (C). e) Relación entre CDI y modulación diferencial de subunidades β (DßM) de Cav1.2. A) Modulación diferencial de la inactivación por β 1a (traza negra) y β 2a (traza verde) en el peso Cav1.2. La interrupción del CDB (α 1C,86) elimina el CDI y el SI objetivo de CDI y DßM (B). La mutación de ADSI (α 1C,IS-IV) eliminó el CDI e inhibió completamente el SI, de modo que el canal permanece en marcha durante la duración del estímulo de despolarización (C).

3.1. La Inactivación Dependiente de Ca2+y el Dominio de Unión a Calmodulina de a1C

Hay varios determinantes diferentes de la CDI, pero no fue hasta 1997 que el sitio de detección de Ca2+de la CDI se redujo a un tramo de la secuencia C-terminal de 80 aminoácidos de a1C codificada por los exones 40-42 (Figura 2) marcada por un bloque rojo en la Figura 3(A) (panel a). Una variación de empalme natural en esta región en a1C, 86(Figura 3 (B)) inhibió completamente el CDI, como es evidente por la falta de desaceleración de la corriente con Ba2+ como portador de carga (panel c, traza negra) en comparación con (traza roja). Otro rasgo característico del CDI inhibido fue la falta de la dependencia del tamaño actual de la tensión(Figura 3 (B), panel d, símbolos abiertos) que se mantiene en contraste con la dependencia en forma de U de la constante de tiempo de inactivación rápida () en el potencial de membrana en el Cav1.2 de tipo salvaje(véase la Figura 3 (A), panel d). Se identificaron dos secuencias distintas, L y K, dentro de este tramo de 80 aminoácidos cuyas mutaciones a1C,como 86 en el a1C de tipo salvaje , se ajustan a las mismas características, lo que sugiere la existencia de dos sensores CDI adyacentes. Uno de ellos se describió en la región K como el motivo IQ de unión a calmodulina (CaM) y, más tarde, el vínculo del motivo IQ con CDI como el sitio de unión funcional a Ca2+ – CaM se confirmó en tres estudios independientes mediante el uso de mutantes CaM que carecen de afinidad con Ca2+. En consecuencia, el motivo de LA estaba vinculado al CDI como sitio de unión apo-CaM dotado por el estado de reposo del canal. Una molécula de leva única atada a este dominio de unión de leva dependiente de Ca2+(CBD) de a1C es el sensor de Ca2+ principal del canal .

Variación de empalme de a1C en la región CBD de a1C, 86 no solo inhibe completamente la CDI, sino que también elimina el SI(Figura 3 (B), panel c) y priva al canal de sensibilidad diferencial a la modulación de subunidades β(Figura 3 (B), panel e) a pesar del hecho de que β permanece asociado con a1C,86(Figura 3 (B), panel b). Esto indica que las tres propiedades del canal—CDI, SI y modulación de subunidades β-están vinculadas entre sí .

3.2. Inactivación lenta

Se han presentado varias evidencias de que los aminoácidos confinados a la parte distal de los segmentos S6 en a1C juegan un papel importante en el SI . El estudio sistemático de esta región delineó el «determinante anual de inactivación lenta» (ADSI) como una estructura compuesta por cuatro aminoácidos altamente conservados de cuatro segmentos transmembranarios S6, que constituyen el extremo citoplasmático del poro (Figura 3(A), panel a). Su mutación simultánea (S405I en IS6, A752T en IIS6, V1165T en IIIS6 e I1475T en IVS6) genera el canal A1C, IS-IV. El análisis de la cinética actual del canal A1C, IS-IV mostró una tremenda aceleración del componente de inactivación rápida ( ≤ 10 ms) que comprende aproximadamente el 50% de la amplitud total (or). La inactivación lenta dependiente del voltaje de a1C,IS-IV está completamente inhibida, y el canal permanece en marcha durante la duración de la despolarización. El reemplazo de Ca2 + por Ba2+ como portador de carga (panel c) no cambió significativamente este patrón de inactivación, mientras que el análisis de la dependencia de voltaje para el componente inactivador de a través del canal A1C,IS-IV (panel d) confirmó la falta de CDI. El reemplazo de ß1a por ß2a (panel e) no cambió la inactivación de la corriente del canal A1C,IS-IV, lo que sugiere la falta de modulación diferencial de la subunidad β,mientras que el análisis de coinmunoprecipitación (panel b) proporcionó evidencia directa de asociación entre a1C, IS-IV y β.

Tomados en conjunto, los resultados presentados en la Figura 3 sugieren que hay una conversación cruzada entre ADSI, CBD y β, apoyada por interacciones directas entre ellos y/o plegamiento conformacional específico de los constituyentes del haz de polipéptidos subyacente al poro. De hecho, tanto la interacción de β con CBD como la importancia de la conformación funcional se demostraron directamente en células vivas que expresaban Cav1.2 recombinante.

3.3. El papel del plegado de la cola C A1c

La microscopía cuantitativa de TRASTES dependiente de voltaje combinada con una abrazadera de parche en la célula viva mostró que la cola del terminal C de la subunidad a1C está sujeta a reordenamientos conformacionales reversibles controlados por voltaje . El anclaje de la cola C de a1C a la valva interna de la membrana plasmática a través del dominio de homología de pleckstrin (PH) fusionado al extremo C de a1C (a1C -) abolió este reordenamiento conformacional e inhibió tanto el SI como el CDI (Figura 4(A)) de una manera muy similar a la observada con A1C,IS-IV (Figura 3(C)). Esta modificación limitando la movilidad del terminal carboxílico a1C tuvo una gran implicación en la transducción de señales Ca2+. La activación transcripcional dependiente de CREB asociada a la actividad de Cav1.2 se suprimió completamente a pesar del robusto generado por el canal «anclado en C» en respuesta a la despolarización. La liberación de la cola C a1C mediante la activación de la hidrólisis de PIP2 tras la activación de la fosfolipasa C restaura completamente todas estas funciones deficientes, incluyendo SI, CDI y el acoplamiento efectivo de a la transcripción dependiente de CREB . Por lo tanto, es el plegado funcional específico de la cola terminal C a1C lo que es crucial para la inactivación. Es crucial para la transducción de señales porque está diseñado para enjaular el Ca2+ permeable en CaM unido al CBD y para mover efectivamente este Ca2+ enjaulado a objetivos de señalización aguas abajo asociados con la transcripción dependiente de CREB o la contracción del músculo cardíaco . Sobre todo, esta función se produce en estrecha coordinación con estímulos extracelulares que activan el canal. En términos de transducción de señales, SI es un bloqueo en el interior del canal que es liberado por el Ca2+ permeable para acelerar su cierre e iniciar el movimiento de la cola del terminal C.

Figura 4

papel Diferencial de la carboxilo y amino-terminal de la cola de α 1C en Cav1.2 inactivación. Se muestran (a) imágenes epifluorescentes que ilustran el objetivo de la membrana plasmática de α 1C marcado con EYFP (barras de escala, 4 µm) y (b) trazas superpuestas del máximo (negro) y (rojo) escalado a la misma amplitud para α 1C-/β 1a/α 2δ, (A) PHN-α 1C/α 2δ (B) y ΔN-α 1C/α 2δ (C).

3.4. Función del Terminal N a1c

Todas las funciones mencionadas anteriormente dependen también de la integridad del terminal N a1C. Las propiedades de inactivación del canal recombinante a1C/β/α2δ no se alteran en gran medida por cambios estructurales de la parte proximal de la cola N de a1C, por ejemplo, por la fusión de una proteína fluorescente , por el dominio de PH o por el empalme alternativo de exones 1/1A que generan la isoforma larga de a1C . El primer análisis funcional del efecto de la deleción parcial del terminal N a1C mostró que está involucrado en la inactivación, mientras que β evita la inhibición del canal por la cola N. Usando microscopía de TRASTE combinada con pinza de parche, encontramos que la inactivación causa una fuerte reorientación mutua de los terminales A1C y ß1a NH2, pero su distancia frente a la membrana plasmática no cambia apreciablemente . Esta falta de movilidad relativa es conferida por β de una manera que facilita la respuesta del canal a la compuerta de voltaje. Los experimentos sobre desacoplamiento de la cola terminal N de la subunidad a1C de la regulación del canal se llevaron a cabo en ausencia de β. El anclaje de la cola N de a1C en la valva interna de la membrana plasmática a través del dominio de PH unido creó condiciones cuando PHN-a1C y α2δ fueron suficientes para generar una corriente interna robusta (Figura 4(B)). Este canal, sin embargo, está privado de CDI y de cualquier inactivación dependiente del voltaje. De hecho, ni la corriente Ba2+ ni la Ca2 + han mostrado decaimiento apreciable (ver trazas superpuestas). La liberación de la cola N de a1C tras la hidrólisis de PIP2 por activación de la fosfolipasa C inhibió completamente el canal de deficiencia de β . Propiedades similares, excepto una activación mucho más lenta de la corriente, se observaron en la eliminación de la cola N-terminal de a1C (Figura 4 (C)). Con cualquier tipo de desacoplamiento de la cola del terminal N a1C, ya sea a través de una eliminación o por anclaje de PM, un retraso en la activación de la corriente de célula completa parece estar asociado con la prolongación de la primera latencia. Las grabaciones de un solo canal revelaron que la eliminación de la cola N estabilizó esencialmente el estado abierto del canal ΔN-a1C/α2δ, que mostró aberturas más largas durante la despolarización de larga duración .

Por lo tanto, el CDI está mediado por determinantes del CDB de la cola C a1C, por el ADSI en la región del poro citoplasmático y por el plegamiento de los terminales C y N de a1C. La calmodulina integra estos determinantes, proporcionando un interruptor dependiente de Ca2+que termina la inactivación lenta, libera la cola C a1C y transporta la Ca2+/calmodulina asociada que actúa como un estímulo activador de la transducción de señales de Ca2+.

3.5. Expresión e inactivación de Cav1.2 en ausencia de β y α2δ

¿Son las subunidades β y α2δ esenciales para la expresión funcional del canal Cav1. 2? El análisis de los efectos de la CaM exógena (CaMex) sobre la expresión y las propiedades de Cav1.2 en ausencia de β o α2δ demostró claramente que ni β ni α2δ son esenciales. La sobreexpresión de CaMex solo modifica ligeramente la desconexión de voltaje del canal A1C/ß2d / α2δ al cambiar la dependencia de voltaje de la activación y la inactivación hacia potenciales más negativos, facilitando (pero no acelerando) la inactivación y aumentando la densidad de aproximadamente 2 veces . Se mantiene la CDI, como se desprende del efecto de la sustitución de Ca2 + por Ba2+ como portador de carga que aumentó significativamente el curso temporal de inactivación de la corriente (Figura 5 A)). La nueva comprensión de los roles de β y α2δ viene con el hallazgo de que CaMex representa la expresión y actividad del canal a1C en ausencia de β (Figura 5(B)) o α2δ (Figura 5(C)), pero no ambas subunidades auxiliares. Aunque CaMex no está relacionado estructuralmente con β y α2δ, soporta tráfico, CDI y apertura de canales. El análisis cuantitativo mostró que CaMex no estimuló la redistribución de a1C en PM sobre el citoplasma, sino que mejoró significativamente el objetivo de la membrana plasmática de los canales A1C/α2δ. Por otro lado, CaMex no mejoró la distribución relativa de los canales a1C/ß2d y a1C/ß2d/α2δ en la membrana plasmática sobre el citoplasma. Por lo tanto, dependiendo de la subunidad auxiliar presente, la actividad de canal soportada por CaMex de a1C/ß2d y A1C/α2δ está bajo control de diferentes mecanismos. A pesar de eso, los canales de subunidad auxiliar simple facilitados por CaMex exhiben propiedades bastante similares, incluida una cinética de inactivación significativamente más lenta de la corriente de calcio y un fuerte cambio de la dependencia de voltaje de activación e inactivación hacia potenciales más negativos. Al igual que los canales convencionales a1C/ß2d/α2δ, estos canales retienen CDI y una alta sensibilidad a los bloqueadores de los canales de calcio dihidropiridina . Sin embargo, solo el canal a1C/β/CaMex muestra la facilitación de la corriente de calcio mediante un prepulso fuerte de despolarización (datos no mostrados).

Figura 5

Actividad de Cav1.2 se expresa en la ausencia de α β o 2δ subunidades. Se muestran (a) imágenes epifluorescentes que ilustran la localización predominante de partículas de EYFPN-α 1C (barras de escala, 4 µm) en células COS1 y (b) trazas superpuestas del canal máximo (negro) y (rojo) escalado a la misma amplitud para α 1C/β 2d/α 2δ/CaMex (A), α 1C/α 2δ/CaMex (B) y α 2δ-canal α 1C/β 2d/CaMex (C) libre de β.

Debido a que la CAM asociada con CBD está involucrada en la CDI, está claro que el efecto de CaMex está mediado por diferentes sitios de unión de CaM. Uno de los posibles candidatos de este sitio está presente en la parte distal de la cola terminal N del a1C . Queda por ver si este sitio realmente desempeña un papel integrador en el paquete regulador de varios determinantes moleculares que apoyan la inactivación de Cav1.2. Otra posibilidad limita el papel de CaMex a la activación de Cav1 silencioso.2 dentro de los grupos grandes, donde la limitada disponibilidad local de CaM puede ser la razón de la baja actividad fraccionaria descrita en la Sección 2.5. Cualesquiera que sean los mecanismos asociados con la regulación de Cav1.2 por CaM, parecen tener poca implicación práctica para su uso en medicina en este momento, precisamente porque CaM es un péptido omnipresente y multifuncional que regula muchas otras funciones celulares, mientras que su presencia en Cav1.2 es vital para la CDI.

4. modulación de Subunidades β de Cav1.2

La notable variabilidad molecular de las subunidades β, reflejada en las propiedades de inactivación alteradas del Cav1.2 modulado diferencialmente , ejemplificada en la Figura 3(A) (panel e), presenta una nueva oportunidad para el desarrollo de enfoques innovadores para el tratamiento de las enfermedades asociadas con el mal manejo de Ca2+. Varias observaciones recientes proporcionan una base para una visión tan optimista. En primer lugar, las subunidades β exhiben una tendencia a formar homo – y hetero-oligómeros que fue demostrada directamente por una variedad de técnicas bioquímicas tanto en células nativas como en el sistema de expresión recombinante. Mientras que un aumento de la homooligomerización β aumenta significativamente la densidad de, la heterooligomerización de variantes de empalme β2 con otras subunidades β también puede cambiar la cinética de dependencia de voltaje e inactivación de Cav1. 2 . La β-oligomerización está mediada por varios determinantes moleculares y, por lo tanto, necesita múltiples intervenciones para ser manejadas, por ejemplo, en caso de sobreexpresión patógena de β2. Sin embargo, parece ser más factible apuntar al propio β2; el determinante molecular de la inactivación lenta e incompleta específica de β2 (véase la Figura 2(A), panel d) se identificó como el determinante C-terminal de 40 aminoácidos (ß2CED) presente en las 7 variantes de empalme β2 conocidas de origen natural. El desacoplamiento de su interacción independiente de Ca2+ y CaM con el CBD(Figura 3 (A), panel a) recupera las propiedades de inactivación características de Cav1.2 modulado por ß1b/β3 que exhiben una inactivación rápida y completa de , como se demostró en experimentos de deleción. En mi opinión, tal desacoplamiento selectivo de ß2CED de la unión a su receptor en CBD es una nueva estrategia atractiva para manejar la sobrecarga de Ca2+ porque otras subunidades β no deben verse afectadas. Además, se preservará una conversación cruzada entre Cav1. 2 y la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/CaM más cercana.

5. Conclusiones

Este trabajo ha demostrado que sabemos cómo acelerar la inactivación de Cav1.2 a menos de 10 ms (Figura 3(C)), privarlo de la inactivación por completo (Figuras 4(B) y 4(C)), o eliminar la dependencia de su expresión de β o α2δ sin consecuencias significativas para la inactivación. Describimos las funciones finales de la terminal a1C y la CaM para la inactivación, y sin embargo ninguno de estos estudios nos ha acercado al objetivo final de controlar el mal manejo del calcio asociado con Cav1.2 excepto los viejos y, desafortunadamente, no demasiado selectivos bloqueadores de los canales de calcio. El único nuevo objetivo factible es la modulación β2 patógena de Cav1. 2, donde se establece la interacción efector-receptor.

En términos de biología molecular, Cav1.2 es sin duda uno de los sistemas reguladores más complicados conocidos. Notable diversidad molecular de cada uno de los Cav1.2 constituyentes da lugar a múltiples variantes genéticas / de empalme del canal que están sujetas a segregación en grupos grandes y diversos y a un cambio funcional continuo a través de homo y heterooligomerización de β y otros componentes de señalización, por no hablar de especies, tejidos y variabilidad del desarrollo. Nos sorprende la redundancia de las propiedades de múltiples isoformas Cav1.2 y nos sorprende aún más cuando algunas de ellas, que muestran solo propiedades electrofisiológicas «convencionales», resultan estar asociadas a una enfermedad . Al buscar una explicación, nuestra visión no debe enfocarse intuitivamente solo en las características de la dependencia de corriente y voltaje de calcio, amplitud y duración. La respuesta final , como la organización espacial y temporal de eventos de señalización CREB asociados con isoformas Cav1.2 específicas, y su competencia con otros mecanismos de señalización (por ejemplo, dependientes de cAMP) u otras isoformas Cav1.2 presentes, puede proporcionar nuevas ideas y abrir nuevas fronteras para la investigación de los roles de variantes de empalme Cav1.2 individuales en células y tejidos normales y enfermos.

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