CPZ atenúa la colitis independientemente de TRPV1

Para desafiar el mecanismo por el cual los enemas CPZ atenúan la colitis experimental, indujimos la colitis con sulfato de dextrano sódico (DSS) y ratones con deficiencia de TRPV1 (cada grupo n = 8). Aunque existen informes contradictorios, los ratones con deficiencia de TRPV1 desarrollaron colitis DSS y pérdida de peso en el mismo grado que los ratones con TW congénicos en nuestro laboratorio, lo que cumple con nuestros resultados del modelo de colitis por TNBS que habíamos publicado7,8,9,10,11,12. Para los tratamientos con enemas de CPZ, se utilizó la misma concentración de CPZ (531 µM) que, según se informó anteriormente, atenuaba la colitis DSS (5%) en ratas8. El curso de la colitis se monitorizó diariamente mediante mediciones de peso corporal y endoscopia. Las aplicaciones de enemas CPZ (531 µM) dos veces al día atenuaron la colitis DSS en el mismo grado en ratones WT y TRPV1 -/−, lo que se reflejó en una puntuación endoscópica mejorada y en una reducción de la pérdida de peso corporal (Fig. 1A a C). Las manchas H&E del colon distal al final del experimento DSS de 7 días revelaron una arquitectura de tejido mucoso destruido con numerosas células inmunes infiltrantes en los colon de los controles. Esto estaba en marcado contraste con una mucosa ampliamente intacta y la ausencia de infiltración significativa de células inmunitarias en los colon de ratones tratados con CPZ de ambos genotipos (Fig. 1D). De acuerdo con estos hallazgos, la puntuación histológica se redujo considerablemente en los ratones tratados con CPZ de ambos genotipos (Fig. 1E).

CPZ activa TRPA1

La observación in vivo de que los enemas de CPZ inhibieron efectivamente la colitis en ratones mutantes nulos de TRPV1 impuso la pregunta sobre los efectos neuronales independientes de TRPV1 de CPZ. Dado que se había demostrado que la TRPA1 era crucial en varios modelos de inflamación,incluidas las colitis6,12, 14, probamos si la CPZ actúa sobre la TRPA1.

Corrientes iónicas inducidas por CPZ a través de hTRPA1

Se llevaron a cabo experimentos de pinza de parche en modo de pinza de voltaje en células HEK293t que expresaban hTRPA1 recombinante (células hTRPA1-HEK293t). A un potencial de retención de -60 mV, CPZ (10 µM) indujo una corriente interna que fue inhibida casi por completo (inhibición del 93%, n = 5) por el antagonista selectivo de TRPA1 HC-030031 (HC, 10 µM) (Fig. 2A). En todas las células en las que se registró una corriente interna inducida por CPZ, el carvacrol (100 µM), un agonista TRPA1 establecido, también evocó grandes corrientes internas en el mismo potencial de retención, demostrando la expresión funcional de hTRPA1. Estas células hTRPA1-HEK293 también se sometieron a rampas de voltaje de -100 a +100 mV de 400 ms de duración cada 4 s (Fig. 2B). La relación corriente-voltaje inducida por CPZ mostró una rectificación ligeramente hacia afuera y un potencial de reversión cercano a 0 mV (Fig. 2C). Las corrientes evocadas por CPZ (10 µM) fueron inhibidas por HC (10 µM). El efecto fue más pronunciado con potenciales negativos (89% ± 5% de inhibición a -80 mV, media ± DE, n = 7) que con potenciales positivos (80% ± 9% de inhibición a +80 mV).

El influjo de calcio inducido por CPZ a través de hTRPA1

La acción selectiva de CPZ sobre TRPA1 se confirmó mediante el empleo de la técnica de microfluorimetría de calcio. Las células hTRPA1-HEK293 fueron estimuladas por dos aplicaciones de CPZ (50 µM) durante 10 s a intervalos de 5 minutos (Fig. 2D). Los antagonistas selectivos HC (20 µM) y A-967079 (10 µM) se aplicaron durante 1 minuto antes y durante la primera prueba de CPZ. La respuesta CPZ fue completamente abolida por ambos antagonistas. Vale la pena señalar que la eliminación de HC llevó a un influjo de calcio, probablemente debido a la acción residual de CPZ, mientras que este efecto off estuvo ausente en el caso de A-967079, que puede desprenderse más lentamente (Fig. 2D). Luego analizamos la dependencia de la concentración de los efectos de CPZ. Se aplicaron concentraciones crecientes de CPZ (100 nM, 500 nM, 5 µM y 50 µM) a células hTRPA1-HEK293 durante 20 s cada una a intervalos de 3 minutos. Comenzando con 100 nM, todas las concentraciones de CPZ evocaron transitorios de calcio con amplitudes cada vez más grandes (Fig. 2E). Se aplicó carvacrol (100 µM) al final del experimento para controlar la expresión funcional de TRPA1, pero la respuesta de carvacrol después de 50 µM CPZ fue notablemente pequeña, lo que sugiere una desensibilización cruzada. Las células HEK293 no transformadas se sometieron a las mismas aplicaciones de CPZ y solo la concentración más alta probada (50 µM) indujo un aumento mínimo de calcio. Esperábamos que la CPZ enganchara los tres residuos críticos de cisteína en el dominio N-terminal del canal porque es un compuesto electrofílico. Las células HEK293 que expresaban hTRPA1 en PESO y las células que expresaban el mutante triple de cisteína hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) se sometieron a la aplicación de CPZ (1 µM, 20 s), seguidas del agonista no electrofílico carvacrol (100 µM, 20 s) y el AITC altamente electrofílico (50 µM, 30 s). Ionomicina se aplicó al final del experimento como control positivo. La amplitud del transitorio de calcio evocado por 1 µM CPZ se redujo sustancialmente (> 80%) en las células que expresaban hTRPA1-3C en comparación con las células que expresaban hTRPA1 en PESO (Fig. 2F), mientras que la diferencia de sensibilidad de CPZ entre los genotipos se eliminó a una concentración de CPZ de 100 µM (Fig. 2G). La respuesta AITC disminuyó en las células mutantes, mientras que el carvacrol evocó grandes transitorios de iones de calcio en mutantes WT y 3C. En conjunto, estas respuestas celulares indican que la potencia relativamente alta de la CPZ depende de las tres cisteínas críticas. Sin embargo, cuando la concentración de CPZ es 100 veces mayor, otros sitios de unión se hacen cargo de la activación de hTRPA1. Esta alta concentración de CPZ lipofílica también podría interactuar con la membrana lipídica celular, activando indirectamente TRPA1, como se demostró anteriormente para el componente lipídico A de los lipopolisacáridos16. Además, en presencia del eliminador de electrofilos, la N-acetil cisteína (NAC) a una concentración de saturación (15 mm), 50 µM de CPZ no pudo provocar ninguna respuesta. Tras la eliminación de NAC, la CPZ evocó grandes transitorios de calcio en las células HEK293t transfectadas por hTRPA1 (Fig. 2H) que confirma que la CPZ actúa como agonista electrofílico para la hTRPA1.

CPZ activa una subpoblación de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) sensibles a AITC

Las neuronas DRG se mantuvieron en cultivo primario e investigaron mediante microfluorimetría de calcio. Las células fueron estimuladas por CPZ (50 µM, 20 s), seguidas de AITC (100 µM, 30 s), capsaicina (CAP, 1 µM, 10 s) y KCl (60 mM, 30 s). La Figura 3A ilustra ejemplos de neuronas DRG que responden a estos cuatro estímulos. Una fracción típica de neuronas DRG fue activada por AITC (301 de 906 neuronas, 33%, n = 8 ratones), lo que indica la expresión funcional de TRPA1. Una subpoblación de estas neuronas sensibles al AITC también fue activada por CPZ (185 de 301 neuronas, 61%). La sensibilidad a la CPZ estaba casi completamente restringida a las neuronas sensibles al AITC. De un total de 200 neuronas sensibles a CPZ, 185 (93%) también fueron activadas por AITC, lo que indica una fuerte concordancia de sensibilidades a CPZ y AITC (Fig. 3). Al igual que en el caso de las células HEK293 que expresan hTRPA1, los transitorios de calcio evocados por CPZ en las neuronas DRG dependían de la concentración, con un valor de EC50 estimado en 30 µM CPZ y la pequeña respuesta AITC después de 100 µM CPZ sugería de nuevo una desensibilización cruzada (Fig. 3B, C). La Figura 3D muestra la superposición de CPZ, CAP y respuesta AITC en neuronas WT DRG a concentraciones dadas: el 14% de las neuronas DRG respondieron a AITC pero no a CAP (125/906), el 16% respondieron a CAP pero no a AITC, mientras que CPZ indujo transitorios de calcio en el 78% de las neuronas que respondieron tanto a AITC como a CAP (137 de 176). Para demostrar la especificidad de los efectos observados, las neuronas TRPV1−/− y TRPA1−/− DRG se expusieron al protocolo anterior. Alrededor del 90% de las neuronas DRG con deficiencia de TRPV1 que eran sensibles a AITC también respondieron a CPZ (509/572 células), mientras que ninguna de las 448 neuronas DRG con deficiencia de TRPA1 analizadas mostró flujo de calcio en respuesta a CPZ (100 µM), como se ilustra en los ejemplos representativos de la Fig. 3E, F.

La desensibilización sistémica a través de TRPA1 atenúa el dolor

Después de descubrir que la CPZ es un potente agonista de TRPA1, comprendimos por qué los primeros enemas de CPZ (dos veces al día) eran obviamente dolorosos en los ratones WT. A continuación, cuantificamos el comportamiento nocifenso inducido por enemas de CPZ (531 µM) en animales sanos (cada uno n = 6) contando las reacciones de retorcimiento y registrando las respuestas de reflejos visceromotores (VMR) a través de la electromiografía integrada (EMG) de la pared muscular abdominal (Fig. 4A, B). Durante el curso de la repetición de los tratamientos de CPZ dos veces al día, notamos que los knockouts de TRPA1 no mostraron un comportamiento relacionado con el dolor en ningún momento. Además, los ratones WT presentaron una disminución progresiva de las respuestas al dolor inicialmente fuertes con una disminución pronunciada alrededor del día 3 que llevó a una desensibilización finalmente completa en ambos parámetros nocifensivos. Esta pérdida de percepción del dolor colónico en ratones que, por lo demás, eran normales, aumentó la expectativa de que los enemas podrían haber administrado CPZ una cantidad farmacodinámica suficiente para inducir hipoalgesia sistémica. Para probar esta hipótesis, empleamos la prueba de limpieza de ojos usando AITC (100 µM) y CAP (1 mm) (Fig. 4C, D) (n = 6). Ambas pruebas mostraron una atenuación clara de los recuentos de toallitas oculares en los ratones WT que habían sido tratados con enemas de CPZ (hasta 12-16 h antes de la prueba). Estos efectos probablemente fueron mediados por la desensibilización de TRPA1 en lugar del bloqueo de TRPV1, ya que los ratones con deficiencia de TRPV1 eran insensibles a la instilación de aceite de mostaza (AITC, 100 µM) en el ojo en el mismo grado que los ratones WT (Fig. 4C). Viceversa, los enemas de CPZ fueron ineficaces en ratones TRPA1−/−, cuando estos ratones fueron desafiados por instilaciones de capuchón en el ojo (Fig. 4D).

Dado que los enemas repetidos son una vía de administración desagradable, probamos un posible efecto anti-nociceptivo de CPZ peroral (531 µM) en el agua potable. El régimen de bebida durante 10 días fue bien tolerado sin que se produjeran efectos adversos obvios. Durante el curso de la administración oral continua de CPZ, la latencia de retirada de la pata a la estimulación de calor radiante (método Hargreaves) aumentó progresivamente en ambas patas traseras (Fig. 4E). El tiempo de tolerancia se duplicó aproximadamente en el día 7 y se mantuvo significativamente elevado del día 2 al 10. Después de 2 semanas de recuperación con agua potable pura, las latencias de abstinencia habían vuelto al nivel basal. La respuesta mecánica a la estimulación con la fuerza creciente linealmente de un filamento electrodinámico de von Frey no se vio afectada significativamente durante los diez días de consumo de CPZ (Fig. 4F). Se planteó la cuestión de si el calor y la hipoalgesia química representaban un efecto de clase de los agonistas desensibilizantes de TRPA1 o si era específico para CPZ. Por lo tanto, administramos AITC en una concentración similar y bien tolerada (500 µM) a través del agua potable. El mismo régimen de dosis para AITC descrito para CPZ resultó en un aumento progresivo de la latencia de retirada de la pata a la estimulación de calor radiante que fue significativamente menor que la inducida por CPZ (Fig. 4E). La respuesta mecánica no se modificó bajo el régimen de bebida AITC (Fig. 4F).

CPZ causa una desensibilización sostenida de TRPA1 / TRPV1 que expresa neuronas sensoriales peptídergicas

Luego nos preguntamos si la desensibilización de animales enteros por CPZ podría reproducirse a nivel celular. Con este fin, realizamos experimentos de imágenes de calcio con neuronas DRG aisladas que se habían obtenido de ratones de control y de animales tratados durante 7 días dos veces al día con enemas de CPZ. Estas neuronas se mantuvieron necesariamente en cultivo durante 16 a 24 h, en presencia de NGF. Un total de 399 neuronas de ratones de control y 584 neuronas de ratones tratados con enema se cargaron con Fura-2 y se registraron transitorios de calcio evocados por AITC, carvacrol, CAP y una solución rica en KCl. Las respuestas a estos agonistas de TRPA1 (AITC y carvacrol) y TRPV1 (CAP) no fueron significativamente diferentes en las neuronas DRG de los animales de control y los animales tratados con enemas (Fig. S1). Sin embargo, la expresión de ARNm de TRPA1 (qPCR) se reguló aproximadamente dos veces en GRD lumbosacro preparado inmediatamente después del enema final de CPZ (Fig. S2), mientras que no se detectó ningún cambio en la expresión de TRPA1 cuando transcurrieron 24 h in vivo después del enema final. El ARNm del virus TRP1 no cambió en ambas circunstancias. Por lo tanto, la regulación al alza de la transcripción de la expresión del gen TRPA1 había tenido lugar, debido a los múltiples enemas de CPZ, pero se revirtió rápidamente cuando se interrumpió el suministro de CPZ. En condiciones de cultivo de DRG, probablemente se había producido la misma reversión epigenética y todas las CPZ residuales probablemente se eliminaron, de modo que no se podía esperar una desensibilización residual. Como los modelos celulares no reflejaron la desensibilización inducida por CPZ de los animales enteros in vivo, buscamos otro indicador fuerte del sorprendente efecto sistémico. La mayoría de las neuronas nociceptivas son peptídergicas, expresando predominantemente péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) y sustancia P (SP)15,17. Tras la despolarización, como por el KCl y la afluencia de calcio, debido a la activación de canales de calcio dependientes de voltaje, estos neuropéptidos se liberan de las fibras nerviosas en una función cuasi eferente (inflamación neurogénica). Por otro lado, los canales TRP activados son muy buenos conductores de calcio por sí solos y no requieren soporte de ningún canal de sodio o calcio activado por voltaje para evocar exocitosis vesicular de CGRP18. Por lo tanto, la liberación estimulada de CGRP puede servir como un índice de activación de nociceptores (peptídicos). De la misma manera,los neuropéptidos vasoactivos tienen varios efectos en el proceso de inflamación per se y se ha demostrado que el agotamiento o desensibilización de la población de neuronas sensoriales peptídergicas atenúa las colitis19,20, 21. Para determinar si los enemas CPZ (531 µM) se desensibilizan a través de TRPA1, local y sistémicamente, empleamos preparaciones aisladas de colon y piel de ratón. Los colon de ratones sanos C57BL / 6 (n = 8) se expusieron a CPZ (100 µM), lo que indujo la liberación masiva de CGRP (Fig. 5); aplicaciones posteriores de AITC (100 µM) 5 min o 15 min después de CPZ (Fig. 5A, B) ya no pudo inducir la liberación de CGRP, lo que sugiere una profunda desensibilización cruzada funcional aguda al agonista TRPA1. Este efecto no puede deberse a la depleción, ya que la respuesta KCl (60 mm) resultante fue normal. Los colon de ratones que habían sido tratados repetidamente con enemas de CPZ (531 µM) in vivo, dos veces al día durante 7 días, se aislaron y probaron 12-16 h después del último enema. Ni CPZ (100 µM) ni AITC (100 µM) indujeron ninguna liberación de CGRP en esta condición (Fig. 5C, D); notablemente, la liberación de CGRP inducida por CAP (30 nM) se redujo fuertemente, pero no se abolió (Fig. 5E). En contraste, la liberación de CGRP inducida por KCl (60 mm) por despolarización inespecífica no solo no se redujo, sino que en realidad aumentó después de los enemas de CPZ. Esto indicó que las fibras nerviosas del colon no estaban agotadas de CGRP, sino más bien sobrellenadas, pero esencialmente desensibilizadas de manera sostenida a la activación química a través de TRPA1 y TRPV1 (n = 6). Finalmente, también la preparación cutánea, aislada 12-16 h después del último enema de CPZ, mostró que la liberación de CGRP inducida por AITC (100 µM) y CAP (1 µM) se redujo fuertemente de acuerdo con la desensibilización corporal observada en las pruebas de comportamiento (Fig. 5F, G, véase la Fig. 4A-F) (n = 6).