II Efecto de la Hipertermia sola in Vitro
En 1967, Harris utilizó un ensayo de clonación de una sola célula para obtener curvas de supervivencia al calor de células renales de cerdo pseudodiploides. Las curvas se componían de un hombro inicial seguido de una disminución exponencial de la fracción sobreviviente y, por lo tanto, eran similares a las curvas obtenidas de la destrucción por radiación de células en cultivo (Puck y Marcus, 1955). Westra y Dewey (1971) y Palzer y Heidelberger (1973a) también han demostrado este fenómeno. Sin embargo, esto no implica similitud del mecanismo letal de las dos modalidades.
Un gráfico de Arrhenius del recíproco de la tasa de inactivación expresado en función del recíproco de la temperatura absoluta para las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células de riñón de cerdo reveló una energía de activación de 141 kcal/mol para ambos tipos en el rango de temperatura de 43,5° a 46,5°C (Westra y Dewey, 1971). La magnitud de la energía de activación es similar a la reportada para varias enzimas y proteínas (Johnson et al., 1954), y es significativamente mayor que la energía de activación reportada para el ADN (Eigner et al., 1961; Greer y Zambehof, 1962), lo que sugiere que la desnaturalización de proteínas puede ser la lesión letal por calor. Sin embargo, la entropía de activación de las dos líneas celulares fue diferente.
El conocimiento y la comprensión actuales de los objetivos y mecanismos de eliminación del calor son limitados. Si bien se han descrito varias alteraciones de la estructura celular y el metabolismo inducidas por el calor, ninguna de ellas se ha relacionado exclusivamente con la muerte celular. No se han encontrado medios para calentar orgánulos subcelulares selectivamente para obtener información sobre el objetivo o objetivos críticos del calor. Sin embargo, se han sugerido varias posibilidades.
Varios investigadores encontraron que el choque térmico reduce la capacidad de las células para incorporar timidina al ADN (Mondovi et al., 1970; Reeves, 1971; Plagemann y Erbe, 1972). Esta inhibición de la incorporación de timidina podría deberse a daños en el mecanismo de transporte de timidina, que se cree que controla la incorporación de ADN (Plagemann y Erbe, 1972). Sin embargo, se ha demostrado que el grupo de precursores etiquetados no disminuyó lo suficiente como para explicar la gran disminución en la incorporación de timidina en las células renales de cerdo (Plagemann y Erbe, 1972).
Dewey et al. (1971) encontraron que el calor indujo aberraciones cromosómicas en células CHO síncronas. La frecuencia de aberración fue demasiado baja para explicar la letalidad celular en las células M y G1 (menos de una aberración por célula cuando la supervivencia se redujo al 37%), pero podría explicar la muerte celular de las células de la fase S. Además, el calor y el análogo de timidina bromodeoxiuridina (BUdR), al actuar juntos, destruyeron las células aditivamente, lo que sugiere que las mismas estructuras fueron dañadas por ambos agentes. Luego se planteó la hipótesis de que el calor y la BUdR producen lesiones expresadas como daño en el ADN, pero que el calor produce daño en las proteínas cromosómicas, posiblemente enzimas de reparación, y que la BUdR produce daño en el ADN. Entonces, el daño en la proteína cromosómica podría interactuar con el daño de BUdR en el ADN o podría resultar en una inhibición en la reparación del daño del ADN. Esta hipótesis se apoya en la similitud entre las energías de activación para matar el calor (141 kcal / mol) y la inactivación de proteínas (Westra y Dewey, 1971). El daño al ADN mediado por proteínas que se produjo durante G1 aparentemente no se manifestó como aberraciones cromosómicas, posiblemente debido a la asociación más estabilizada entre estos componentes de la cromatina durante G1. Se pensó que el mecanismo de destrucción de células mitóticas era la destrucción del huso, lo que causó la alta frecuencia de células tetraploides observadas en estos experimentos.
La sensibilidad al calor varía considerablemente entre líneas celulares. Las células de próstata de ratón no se destruyeron hasta 5 horas a 43°C, mientras que la supervivencia de las células de próstata transformadas en hidrocarburos fue de 0,37 después de 2 1/2 horas de tratamiento térmico (Chen y Heidelberger, 1969). Se observó que la cantidad de minutos de calor necesarios para reducir la supervivencia de las células leucémicas L1210 y las células HeLa a 37% en la porción exponencial de la curva de supervivencia (D0) fue de 12 minutos y 30 minutos a 43°C, respectivamente (Palzer y Heidelberger, 1973a). Además, la tasa de inactivación por calor de las células CHO (Westra y Dewey, 1971) fue diez veces mayor que la tasa de inactivación de las células renales de cerdo (Harris, 1967).
Se ha encontrado que la cantidad de retardo de división después del calentamiento (Westra y Dewey, 1971; Palzer y Heidelberger, 1973b) es mucho más larga que el retardo producido por una dosis de radiación que reduce la supervivencia en una cantidad similar (Westra y Dewey, 1971). Esto sugiere que las lesiones responsables de la demora en la división o las lesiones responsables de la letalidad son diferentes para las dos modalidades.
Al determinar la reducción de la supervivencia causada por una dosis constante de calor en células sincronizadas, se ha demostrado para las células CHO (Dewey et al., 1971; Westra y Dewey, 1971), levadura (Schenberg-Frascino y Moustracchi, 1972), células HeLa (Palzer y Heidelberger, 1973b) y células meristemáticas (de la Torre et al., 1971) que las células de fase S (de la Torre et al., 1971; Dewey et al., 1971; Westra y Dewey, 1971; Schenberg-Frascino y Moustacchi, 1972; Palzer y Heidelberger, 1973b) y las células de fase M (Westra y Dewey, 1971) fueron las más sensibles en relación con las células en otras fases del ciclo celular. Este hallazgo contrasta directamente con los estudios de irradiación, en los que ambos estudios in vitro (Sinclair, 1968; Dewey et al., 1970) e in vivo (Gillette et al., 1970; Dawson et al., 1973), la fase S es la fase más radiorresistente. Debido a la especificidad del ciclo celular de la letalidad por calor, se ha sugerido la inducción de una sincronía parcial después de tratamientos térmicos repetidos (de la Torre et al., 1971) y observado (Martin y Scloerb, 1964).
Varios investigadores han informado que las células neoplásicas son más sensibles al calor que las células normales (Mondovi et al., 1969; Levine y Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle y Dickson, 1971). Esto puede deberse a deficiencias nutricionales u otros factores que pueden hacer que el tejido maligno sea más sensible al calor. Sin embargo, existen excepciones (Chen y Heidelberger, 1969; Kachani y Sabin, 1969), y en la mayoría de los casos, la morfología alterada o el metabolismo se ha equiparado con la destrucción celular. Por lo tanto, en los datos que sugieren una sensibilidad selectiva al calor de las células cancerosas (Mondovi et al., 1969, 1970; Levine y Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle y Dickson, 1971; Overgaard y Overgaard, 1972a; Kim et al., 1974), no se ha demostrado que para el criterio de muerte reproductiva, las células tumorales sean más sensibles al calor que las células normales de las que surgió el tumor.
Se ha investigado brevemente la aplicación fraccionada de calor. Palzer y Heidelberger (1973a) examinaron la recuperación de células HeLa asíncronas entre dosis divididas de calor. Sus datos indican que las células eran capaces de reparar el daño por calor subletal en 6 horas. Además, la fluctuación en la fracción sobreviviente sugirió una sincronización parcial de la población asíncrona como resultado de la primera dosis. Hubo una disminución en la supervivencia después de un aumento inicial debido a la reparación del daño por calor subletal. La disminución de la supervivencia se interpretó como el resultado de la redistribución de las células a una fase más sensible del ciclo celular debido a la sincronización parcial inducida por la primera dosis del agente letal.
Gerweck et al. (1974) investigaron la capacidad del calor para matar células hipóxicas in vitro. La hipoxia se produjo en las células CHO mediante una técnica de gaseamiento rápido. Las curvas de supervivencia a la radiación para las células CHO aeróbicas e hipóxicas revelaron una relación de realce de oxígeno (REA) de 2,5, lo que indica que se logró hipoxia radiobiológica. El calentamiento se realizó por inmersión en agua a 45,5 ° C para intervalos de tiempo variables. Luego se construyeron curvas de supervivencia al calor de células aeróbicas e hipóxicas que revelaron que las células hipóxicas eran al menos tan sensibles al calor y posiblemente ligeramente más sensibles al calor que las células aeróbicas. La D0 para las células hipóxicas fue de 1,2 min y para las células aeróbicas de 1,8 min.
Schulman y Hall (1974) encontraron que las células hipóxicas de hámster chino V79 eran más sensibles al calor que las células aeróbicas V79. Cuarenta y tres grados Celsius fueron necesarios para producir daño en las células aeróbicas, mientras que 41°C produjo daño en las células hipóxicas.
En resumen, la eliminación térmica de células de mamíferos en cultivo tiene las siguientes características: a una temperatura dada, una gráfica del logaritmo de la fracción sobreviviente en función del tiempo de tratamiento es típicamente exponencial precedida por un hombro inicial, lo que indica que las células tienen la capacidad de acumular daño por calor subletal y luego se matan exponencialmente con el aumento del tiempo de tratamiento. Los estudios de dosis divididas indican que las células también tienen la capacidad de reparar este daño por calor subletal. Existe una variación considerable en la sensibilidad al calor entre varias líneas celulares. Existe una sensibilidad a la edad celular con las células de fase S y fase M que son más sensibles al calor. El blanco dañado por el calor es desconocido, pero una interacción proteína-ADN es al menos una posibilidad plausible. Las células hipóxicas parecen ser más sensibles al calor que las células oxigenadas.
