En 1838, aunque aún no era un oficial de línea naval experimentado, Wilkes tenía experiencia en trabajos de reconocimiento náutico, y estaba trabajando con científicos civiles. Sobre esta base, se le dio el mando de la expedición de exploración del gobierno»… con el propósito de explorar y estudiar el Océano Austral,… así como para determinar la existencia de todas las islas y bancos de arena dudosos, como para descubrir, y fijar con precisión, la posición de aquellos que en o cerca de la pista de nuestros barcos en ese barrio, y han escapado a la observación de los navegantes científicos.»El Escuadrón de Exploración de los Estados Unidos fue autorizado por ley del Congreso el 18 de mayo de 1836.

La Expedición de Exploración, comúnmente conocida como la «Expedición Wilkes», incluía naturalistas, botánicos, un mineralogista, taxidermistas, artistas y un filólogo, y fue transportada por el USS Vincennes (780 toneladas) y el USS Peacock (650 toneladas), el bergantín USS Porpoise (230 toneladas), el buque de almacén USS Relief, y dos goletas, el USS Sea Gull (110 toneladas) y el USS Flying Fish (96 toneladas).

Saliendo de Hampton Roads el 18 de agosto de 1838, la expedición se detuvo en las Islas Madeira y Río de Janeiro; visitó Tierra del Fuego, Chile, Perú, el Archipiélago de Tuamotu, Samoa y Nueva Gales del Sur; desde Sídney navegó hacia el Océano Antártico en diciembre de 1839 e informó del descubrimiento de «un continente antártico al oeste de las Islas Balleny» del cual avistó la costa el 25 de enero de 1840. Después de trazar 1500 millas de costa antártica, la expedición visitó Fiyi y las Islas Hawaianas. En Fiji, la expedición secuestró al jefe Ro Veidovi, acusándolo del asesinato de una tripulación de balleneros estadounidenses. Y, en julio de 1840, dos marineros, uno de los cuales era el sobrino de Wilkes, el guardiamarina Wilkes Henry, fueron asesinados mientras hacían trueque por comida en la isla Malolo de Fiji. La retribución de Wilkes fue rápida y severa. Según un anciano de la isla Malolo, casi 80 fijianos murieron en el incidente.

De diciembre de 1840 a marzo de 1841, empleó a cientos de porteadores nativos hawaianos y muchos de sus hombres para transportar un péndulo a la cima de Mauna Loa para medir la gravedad. En lugar de usar el sendero existente, se abrió camino por su cuenta, tardando mucho más de lo que esperaba. Las condiciones en la montaña le recordaban a la Antártida. Muchos de sus tripulantes sufrieron ceguera por la nieve, mal de altura y lesiones en los pies por el desgaste de sus zapatos.

Exploró la costa oeste de América del Norte, incluido el Estrecho de Juan de Fuca, Puget Sound, el río Columbia, la Bahía de San Francisco y el río Sacramento, en 1841.

Celebró la primera celebración del Día de la Independencia de los Estados Unidos al oeste del río Misisipi en Dupont, Washington, el 5 de julio de 1841.

La Expedición de Exploración de los Estados Unidos pasó por las Islas Ellice y visitó Funafuti, Nukufetau y Vaitupu en 1841. La expedición regresó a través de Filipinas, el Archipiélago de Sulu, Borneo, Singapur, Polinesia y el Cabo de Buena Esperanza, llegando a Nueva York el 10 de junio de 1842.

Después de haber rodeado completamente el globo (la suya fue la última misión naval a vela en hacerlo), Wilkes había registrado unas 87.000 millas y había perdido dos barcos y 28 hombres. Wilkes fue juzgado en consejo de guerra a su regreso por la pérdida de uno de sus barcos en el Columbia River bar, por el maltrato regular de sus oficiales subordinados y por el castigo excesivo a sus marineros. Un testigo importante en su contra fue el doctor Charles Guillou.Fue absuelto de todos los cargos, excepto castigar ilegalmente a los hombres de su escuadrón. Por un corto tiempo, estuvo asignado al Servicio de Prospección de la Costa, pero de 1844 a 1861, se dedicó principalmente a preparar el informe de la expedición.

Su Narrativa de la Expedición de Exploración de los Estados Unidos (5 volúmenes y un atlas) se publicó en 1844. Editó los informes científicos de la expedición (19 volúmenes y 11 atlas, 1844-1874) y fue el autor del Vol. XI (Meteorología) y Vol. XXIII (Hidrografía).Alfred Thomas Agate, grabador e ilustrador, fue el artista botánico y retratista designado de la expedición. Su trabajo fue utilizado para ilustrar la Narrativa de la Expedición de Exploración de los Estados Unidos.

La Narrativa contiene mucho material interesante sobre los modales, las costumbres, las condiciones políticas y económicas en muchos lugares entonces poco conocidos. El Mapa de Wilkes de 1841 del Territorio de Oregón es anterior a la primera expedición de John Charles Fremont en el Camino de Oregón guiada por Kit Carson durante 1842.

Otras contribuciones valiosas fueron los tres informes de James Dwight Dana sobre Zoófitos (1846), Geología (1849) y Crustáceos (1852-1854). Además, los especímenes y artefactos traídos de vuelta por los científicos de la expedición finalmente formaron la base para la colección del Instituto Smithsoniano. Además de muchos artículos e informes más cortos, Wilkes publicó las principales obras científicas de América Occidental, incluyendo California y Oregón en 1849 y Voyage round the world: embracing the principal events of the narrative of the United States Exploring Expedition en un volumen: ilustrado con ciento setenta y ocho grabados en madera en 1849, y Theory of the Winds en 1856.