Resultados

Caracterización de Células Dendríticas Plasmacitoides del Intestino Delgado.

Aplicamos procedimientos estándar para aislar células inmunes localizadas en el epitelio (intraepitelial, IE) y el LP del intestino. En ambas preparaciones celulares encontramos una población distinta de células CD11c + B220+ Ly6C + que representaron hasta el 1% de todas las células. En contraste con la pDC, la DC mieloide (m) (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) solo estaba presente en números muy bajos en la preparación de IE (Fig. 1 A). Tanto el pDC de la preparación LP como el IE mostraron bajos niveles de expresión de CMH de superficie clase II (Fig. 1 A). Un análisis posterior reveló que las células CD11c + B220 + Ly6C + de ambas preparaciones expresan uniformemente los marcadores de pDC PDCA1 y 120G8 (Fig. 1 B). Las citospinas de la pDC clasificada (CD11c + B220 + Ly6C+) y la DC mieloide (mDC) de la preparación IE revelaron una morfología redonda y lisa, similar a la de las células plasmáticas de la pDC, mientras que la mDC mostró las dendritas características (Fig. 1 C). Para caracterizar aún más la localización de pDC dentro del intestino, aplicamos anti-B220, anti-120G8 y anti-CD3 mAb en inmunohistología. Las micrografías se tomaron aleatoriamente de secciones y, como se muestra en la Fig. 1 D, el posicionamiento de las células CD3 de 120G8+B220+se determinó en relación con las células epiteliales mediante el análisis de imágenes (análisis; Olympus, Hamburgo, Alemania). Al evaluar el posicionamiento de ≈150 pDC, observamos que el 4,9% de estas células estaban claramente ubicadas dentro de la capa de células epiteliales, mientras que otro 6,7% estaba situado a una distancia de 5-10 µm del extremo apical de las células epiteliales (Fig. 1 D). Estos datos demuestran que una cierta cantidad del pDC se ubica dentro o cerca del epitelio intestinal, mientras que >el 80% de las células analizadas se ubicaron a distancias >15 µm, lo que las convierte en células LP (Fig. 1 D). Debido a que había un número similar de pDC en la preparación de IE y LP siguiendo los procedimientos de aislamiento estándar, actualmente no está claro si la pDC de la LP contamina la preparación de IE o si la localización de pDC en el epitelio está aislada de manera más eficiente. Debido a que apenas encontramos ningún mDC dentro de la preparación de IE, favorecemos esta última posibilidad. Sin embargo, queda por determinar si ambas poblaciones cumplen funciones diferentes o pertenecen a una población de células comunes. Debido a que el pDC de la preparación de IE, en contraste con el pDC de la preparación de LP, se puede aislar mediante procedimientos bastante suaves, se utilizó exclusivamente el pDC de la preparación de IE para los ensayos funcionales en este estudio.

Expresión de CCR9 en pDC Intestinal.

Para identificar los mecanismos moleculares que permiten la migración de pDC al intestino, se analizó la expresión de moléculas homing. Aunque está bien establecido que la integrina aE (CD103) media la adhesión de linfocitos a las células epiteliales en el intestino, no pudimos identificar la expresión de esta integrina en la pDC intestinal. Del mismo modo, CCR7 (Fig. 1 E), que participa esencialmente en la localización de linfocitos en órganos linfoides periféricos, no se expresa mediante pDC del intestino. En contraste, observamos niveles altos de CD18 (β2-integrina) y niveles intermedios de α4β7, mientras que ≈50% de pDC expresa ligandos de P-selectina (Fig. 1 E). De interés, la gran mayoría de los pDC intestinales expresaban altas cantidades del receptor de quimiocinas CCR9 (Fig. 1 E), mientras que el mDC del LP expresaba niveles bajos o n de CCR9 .

Expresión CCR9 de pDC Aislada de Diferentes Órganos Linfoides.

Considerando la expresión uniforme de CCR9 en la cPD intestinal, analizamos la expresión de CCR9 en la cPD aislada de órganos linfoides secundarios, incluidos el bazo, el LN drenante de piel, el LN mesentérico y los parches de Peyer (PP; Fig. 2 A) y timocitos CD4+CD8+ usados, conocidos por expresar altos niveles de CCR9, como control positivo (11); Fig. 2 B). Curiosamente, solo una fracción de pDC presente en cualquiera de estos órganos expresaba CCR9 (Fig. 2 A), mientras que ≈95% de la pDC aislada del MB transportaba este receptor (Fig. 2 C). La mayoría de BM pDC también expresan CCR5 y CXCR3, mientras que CCR2 está presente en solo aproximadamente el 25% de las células. El CXCR4, conocido por retener células en el MB, se expresa muy débilmente (Fig. 2 C). Juntos, estos datos demuestran que los pDC están equipados con varios receptores de quimioquinas antes de ser liberados por el BM. Esta característica permite presumiblemente el rastreo no solo a los lugares de inflamación, sino también al intestino no inflamado.

Análisis quimiotaxis de pDC expandido Flt3L.

Basándonos en la fuerte expresión de CCR9 en el MB y la pDC intestinal, comparamos la capacidad de migración de pDC y mDC hacia la quimiocina CCL25/TECK, que es el único ligando conocido para este receptor (12). La frecuencia de pDC varía entre diferentes cepas de ratones y es bien sabido que, por ejemplo, los ratones C57BL/6 (B6) albergan mucho menos pDC que los ratones de 129SV (13). Sin embargo, independientemente de los antecedentes genéticos, el número de pDC que se puede aislar de tejidos de ratón es insuficiente para realizar ensayos estándar de quimiotaxis in vitro. Para superar esta limitación, ampliamos la población de DC in vivo implantando una línea de células tumorales secretoras de Flt3-L (B16-FL) en ratones B6 durante 14 días (14).

Durante este período de tiempo, el porcentaje de células CD11c+ presentes en el bazo aumentó del 3% al 30-35% (datos no mostrados). El ochenta por ciento de la pDC expandida in vivo expresó CCR9, con niveles muy similares a los presentes en la pDC de BM (Figs. 2 C y Fig. 4 C) mientras que la mDC expandida in vivo expresaba solo pequeñas cantidades de este receptor (SI Fig. 6B). La pDC del bazo se enriqueció con la clasificación MACS de CD11c+, dando como resultado una pureza del 95% para las células CD11c+ que contenían ≈15% de Ly6C+B220+ pDC. Los ensayos de migración transwell in vitro revelaron una fuerte respuesta quimiotáctica de pDC a CCL25, así como a CXCL9, un ligando para CXCR3 y a CXCL12, que es un ligando para CXCR4. Solo se observó una respuesta débil hacia CCL19, que sirve como ligando para CCR7. La mDC mostró poca respuesta quimiotáctica hacia CCL25 y CXCL9 y respuesta moderada hacia CXCL12 y CCL19 (Fig. 3 A).

Número reducido de pDC en el Intestino Delgado de Ratones con deficiencia de CCR9.

Con base en estas observaciones, caracterizamos la distribución de pDC en ratones deficientes en CCR9. Encontramos porcentajes similares de cPD en pulmón e hígado (SI Fig. 7), así como en ganglios linfáticos inguinales y mesentéricos, mientras que el número de pDC esplénico aumentó ligeramente en ratones CCR9−/−. Por el contrario, observamos una disminución > del 90% de la disminución intestinal y una reducción del 50% de la CPD de PP (Fig. 3 B).

El pDC Migra Preferentemente al Intestino Delgado.

Con base en los hallazgos descritos hasta el momento, parecía probable que el pDC requiriera CCR9 para dirigirse al intestino delgado. Para probar esta hipótesis, transferimos células de donantes B6 y CCR9−/− que portaban un tumor secretor de Flt3-L durante 14 días. Bajo la influencia de Flt3L, el pDC se expandió en un grado similar en ratones B6 y CCR9−/− (Fig. 4 A y SI Fig. 8) y eran indistinguibles en cuanto a la expresión de CCR2, CCR5 y CXCR3, mientras que CCR9 solo se detectó en pDC derivado de donantes B6 pero no deficientes en CCR9 (Fig. 4 C). Sin purificación adicional, los esplenocitos de estos donantes fueron marcadas con 5(6)-diacetato de carboxifluoresceína N-succinimidil éster (CFSE) y 5(6)-carboxytetramethylrhodamine N-succinimidil éster (TAMRA), respectivamente. Una mezcla de células con deficiencia de WT y CCR9, ajustada para contener un número igual de pDC, se transfirió por vía intravenosa a los receptores B6. Después de 18 h de transferencia, primero analizamos la composición de las células de PESO transferidas adoptivamente presentes en el IE, así como en la preparación de LP y notamos que el 54% y el 25% de todas las células recuperadas de la fracción IE y LP respectivamente eran pDC (Fig. 4 B). Estos hallazgos demuestran que, entre las diversas poblaciones celulares, la pDC se transfiere a casa de manera más eficiente al intestino. Estas transferencias competitivas también revelaron que la pDC con deficiencia de CCR9 se ve en gran medida afectada en su capacidad para llegar al intestino, como se refleja en el bajo cociente de migración de la pDC con deficiencia de CCR9 vs.WT que se encuentra en la preparación de IE y LP (Fig. 4 D). Por el contrario, la pDC deficiente en CCR9 y B6 migró con eficiencia similar a los ganglios linfáticos periféricos y mesentéricos (Fig. 4 D). La naturaleza del etiquetado de las células no tuvo ningún impacto en estos experimentos porque el intercambio de los colorantes entre las células B6 y CCR9−/− produjo resultados idénticos (no se muestran datos). Aunque estos datos demuestran claramente que la pDC requiere CCR9 para un seguimiento eficiente en el intestino, debe mencionarse que las propiedades de tráfico de pDC de ratones tratados con ligando Flt3 podrían ser diferentes de las presentes en situaciones fisiológicas.

Los pDC Se Reclutan para el Intestino Inflamado.

Debido a que se sabe que la pDC juega un papel importante en la inmunidad antiviral (4, 10), especulamos que la pDC podría ser reclutada al intestino durante los procesos inflamatorios para fortalecer la defensa de primera línea. Se sabe que la toxina del cólera (TC) induce inflamación intestinal cuando se administra por vía oral y se ha informado de que dentro de las 2 h después de la aplicación oral, el número de mDC reclutados transitoriamente en el intestino aumenta 4 veces (15). Observamos que, además de mDC, los números de pDC también aumentaron 3 veces al alimentar ratones B6 con 10 µg de TC (Fig. 4 E). De interés, la configuración experimental idéntica nunca resultó en ningún aumento de pDC ni en el IE ni en la preparación de LP de ratones deficientes en CCR9 después de 1, 2 o 3 h de tratamiento con TC (Fig. 4 E y no se muestran los datos). El requisito específico de CCR9 en pDC para su reclutamiento al intestino durante los procesos inflamatorios se confirmó mediante la transferencia adoptiva de WT y pDC con deficiencia de CCR9 a receptores con deficiencia de CCR9, seguida de la aplicación de TC como se describió anteriormente. Mientras que el pDC de PESO transferido adoptivamente estaba ampliamente presente en la preparación de IE y LP, el pDC deficiente en CCR9 se excluyó casi por completo de estos compartimentos (Fig. 4 F). Juntos, estos resultados muestran que durante los eventos inflamatorios la pDC puede ser reclutada a la mucosa intestinal y que este mecanismo depende en gran medida de la CCR9.

Función de la CP Intestinal para la Movilización Rápida de la DC Mieloide en LP.

Se ha demostrado recientemente que la aplicación oral del ligando TLR7/8 resiquimod (R848) resulta en la rápida movilización de LP DC y que el TNFa, posiblemente liberado por pDC, está involucrado en este proceso (16). Por lo tanto, especulamos que la cPD intestinal podría ser la fuente de TNFa que potencialmente desencadena la movilización de la cPD vecina. Para probar esta hipótesis, se estimuló in vitro el pDC B6 de la preparación de IE y LP para 16 h con R848. De hecho, pDC secretan cantidades considerables de TNFa pero no para producir cantidades detectables de IL-2, IL-4, IL-5, o IFNy (Fig. 5 A). Luego analizamos la movilización de LP mDC in vivo después de la aplicación oral de R848. Mientras que los ratones B6 y CCR9−/− no tratados no diferían en cuanto a la presencia de mDC intestinal (Fig. 5 B), dentro de las 2 h R848 oral indujo la movilización de ≈60% de mDC en PESO, pero solo 10,8% en ratones CCR9−/−. Es importante destacar que una vez que los ratones con deficiencia de CCR9 recibieron por vía intravenosa pDC esplénico de donantes de peso tratados con Flt3L 16 h antes de la aplicación oral de R848, esta deficiencia en la movilización intestinal de mDC podría ser completamente rescatada (Fig. 5 C). Estos experimentos muestran que un homing dependiente de CCR9 de pDC al intestino está involucrado en la rápida movilización de mDC intestinal después de la aplicación oral de un ligando TLR7/8. Debido a que otros han demostrado en el modelo de ratas que la aplicación de LPS también induce la movilización de mDC en LP (17), aplicamos 50 µg de LPS i.p. a animales con deficiencia de WT y CCR9. De interés, en estas condiciones experimentales no se observó ninguna diferencia entre los animales con deficiencia de peso y CCR9 con respecto a la movilización de mDC en LP (SI Fig. 9).