Discusión
En el presente estudio se ha descubierto un papel de la proteína de unión al Ca luminal SR, CSQ2, en la regulación del acoplamiento excitación-contracción y del RIC en el corazón. Específicamente, mostramos que la sobreexpresión mediada por Ad de CSQ2 aumentó dramáticamente la magnitud de los transitorios de Ca inducidos pora promediados celulares y las chispas espontáneas de Ca en células cardíacas aisladas. El análisis de la fase ascendente y la velocidad de cambio de estas señales de Ca indicó que su tamaño aumentado se debía a la terminación lenta de los flujos de liberación de Ca subyacentes del SR. Además de prolongar la liberación activa de Ca, la dinámica de recarga funcional de los almacenes de Ca SR también se ralentizó en células con niveles elevados de proteína CSQ2, como lo indica el tiempo de recuperación lento para chispas repetitivas de Ca. Esencialmente, obtuvimos los resultados opuestos en los miocitos, en los que los niveles de CSQ2 se redujeron mediante transducción antisentido mediada por Ad. Estos miocitos mostraron una liberación de Ca más corta, pero una restitución acelerada de los sitios de liberación de Ca. Además, en miocitos estimulados periódicamente con niveles reducidos de CSQ2, la aplicación de isoproterenol causó oscilaciones arritmogénicas intracelulares . Estos resultados muestran que CSQ2 es un determinante clave de la función de liberación de Ca SR que actúa gobernando la duración de la liberación de Ca y la refractariedad del sitio de liberación. A la luz de las alteraciones observadas dependientes de isoproterenol en el ciclo rítmico de Ca en miocitos que no expresan CSQ2, nuestros resultados son relevantes para comprender los mecanismos celulares de las arritmias inducidas por catecolaminas vinculadas a mutaciones del gen CSQ2.
Mecanismos Moleculares de Acción de CSQ2. Atribuimos los efectos observados de CSQ2 en la liberación de Ca SR a la capacidad de esta proteína para funcionar como un tampón molecular que controla la liberación en el espacio luminal SR (ver esquema propuesto en la Fig. 5). Se sabe a partir de estudios de bicapa lipídica que la unión de Ca al aspecto luminal del complejo RyR (es decir, sensor de Ca luminal) aumenta la actividad del canal, mientras que a una luz más baja , la actividad del canal se reduce (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Debido a que muchos RyRs estarían en un estado activado a niveles normales de Ca luminal en reposo (≈1 mm), la disminución de la luz durante el proceso de liberación disminuiría, por lo tanto, la actividad general del canal (un proceso denominado desactivación dependiente de Ca luminal; ref. 3). Nuestros resultados sugieren que al estabilizar el luminal libre local en las proximidades de RyRs durante el proceso de liberación, CSQ2 ralentiza el cierre luminal dependiente de Ca del canal RyR, aumentando así la cantidad de Ca liberada del SR al citosol. CSQ2 también controla la dinámica de recuperación de intra-SR libre durante la recaptación de Ca al servir como sumidero de Ca en el lumen SR. Por lo tanto, CSQ2 no solo potencia el eflujo de Ca SR, sino que también estabiliza el CICR al modular la restitución funcional, o preparación, de los sitios de liberación de Ca después de cada liberación. Recientemente, invocamos un mecanismo similar para explicar los efectos de los quelantes de Ca de baja afinidad (sales orgánicas) cargados en el SR en la liberación de Ca (3). La importancia de nuestros hallazgos actuales es que muestran cómo el proceso de liberación está controlado por una proteína de unión a Ca residente en SR endógena, CSQ2. También revelan las consecuencias patológicas de la reducción de las cantidades de CSQ2 en la RS de las células cardíacas.
Ilustración de los efectos del aumento y la reducción de los niveles de CSQ2 en las propiedades funcionales de la tienda SR Ca. El tamaño funcional de los almacenes SR Ca está determinado por el nivel de CSQ2. El canal de liberación de Ca SR es controlado positivamente por el luminal libre a través del sensor de Ca luminal. El aumento de los niveles de CSQ2 aumenta la cantidad de Ca liberada de SR al retrasar el cierre luminal dependiente de los canales RyR. La reducción de CSQ2 produce un efecto opuesto. Después de su descarga, el almacén SR Ca es rellenado por SERCA. La tienda se recarga funcionalmente cuando luminal Ca se vuelve a asociar con el sensor luminal Ca. El aumento de los niveles de CSQ2 prolonga el tiempo necesario para la recarga funcional de la tienda, mientras que los niveles de CSQ2 reducidos acortan la recuperación. En las células de CSQ2 con baja expresión, los RyRs son propensos a la activación prematura. El aumento de la actividad de SERCA por estimulación adrenérgica acelera aún más la recarga de la tienda de Ac, proporcionando una explicación del papel de las catecolaminas en el desencadenamiento de episodios de TVPC. JSR, junctional SR.
Se ha propuesto que CSQ2 podría afectar la función del canal de liberación de Ca a través de interacciones directas con proteínas que comprenden el complejo del canal de liberación de Ca (es decir, RyR, junctina y/o triadina) (ref. 13; para más información, véase ref. 9). Nuestros estudios no han revelado diferencias considerables en los parámetros de liberación de Ca SR entre las células que contienen aproximadamente 3 veces niveles elevados de proteína CSQ2 y las células en las que se cargaron tampones orgánicos en el SR (3). Por lo tanto, la explicación más simple para nuestros hallazgos es que los efectos predominantes de CSQ2 en la liberación de Ca SR se deben a las acciones de amortiguación de esta proteína dentro de la SR. La aclaración del mecanismo detallado por el cual CSQ2 y proteínas asociadas como la junctina y la triadina regulan la liberación de Ca debe esperar estudios que involucren la manipulación de los niveles y la expresión de formas mutantes de estas proteínas con capacidades alteradas para interactuar entre ellas y la RyR.
La tasa máxima de liberación de Ca de los miocitos estimulados fue similar independientemente de las cantidades de CSQ2 expresadas en el SR (Figs. 2B y 3D). Estos resultados apoyan la noción de que CSQ2 controla la terminación del proceso de liberación, pero estos resultados no son lo que uno necesariamente predeciría en función de los efectos de amortiguación esperados de esta proteína en el SR. De hecho, se esperaría que la tasa máxima de liberación sea mayor en las células con un aumento de las fuerzas de amortiguación luminal de Ca causada por la disminución lenta del intra-SR libre , porque, en estas células, se esperaría que la disminución retardada en el gradiente de Ca a través de la membrana del SR generara intensidades de flujo de Ca más grandes. Varias posibles razones explican por qué esto no se observó. Una posibilidad es que el intra-SR libre inicial pueda ser menor en células con sobreexpresión de CSQ2 que en células con sobreexpresión de CSQ2. Aunque en el estado estacionario el compartimento libre en un compartimento cerrado como el SR no debe verse influenciado por el número de puntos de unión a Ca (esto solo debe influir en la cinética a la que se alcanza el estado estacionario intra-SR), es posible que en nuestros experimentos no se haya alcanzado un verdadero estado estacionario (es decir, miocitos sometidos a estimulación de baja velocidad). Otra posibilidad es que la presencia de niveles elevados de proteína CSQ2 ralentice la difusión de Ca en el espacio luminal, ralentizando así el éxodo de Ca a través de los canales abiertos. Es evidente que se necesita más investigación, tanto experimental como teórica, para resolver este problema.
Terminación del CICR. La forma en que se termina el CICR, un proceso con una propensión inherente a la autoregeneración, ha sido objeto de una intensa investigación, primero mediante el uso de mediciones de transitorios globales de Ca y, más recientemente, mediante el examen de chispas de Ca (3, 27-30). Una posibilidad que se ha considerado es que los canales RyR sufran inactivación o adaptación dependiente de Ca como resultado del aumento del lado citosólico del canal (27-29). Otra posibilidad es que la disminución en el intra-SR proporcione una señal activa para el cierre de los RyRs después de que se abran (3, 30-32). Recientemente hemos encontrado evidencia experimental directa de un papel de los cambios inducidos por Ca luminal en la actividad de RyR (es decir, desactivación dependiente de Ca luminal) en la terminación de la liberación de Ca SR al sujetar los niveles de CA intra-SR con tampones Ca de baja afinidad cargados en las cisternas de SR (3). Utilizando estos tampones, prolongamos drásticamente la duración de la liberación activa de Ca subyacente a los transitorios de Ca focales y globales en los miocitos. De acuerdo con esos hallazgos, nuestros resultados actuales muestran que el aumento de los niveles del tampón luminal CSQ2 de CA de alta capacidad SR prolonga la duración de liberación de Ca, mientras que la reducción de las cantidades de este tampón endógeno acorta la duración de liberación, aparentemente al ralentizar o acelerar el cierre luminal dependiente de Ca de RyRs, respectivamente. En conjunto, estos resultados proporcionan pruebas convincentes del papel de la desactivación luminal dependiente de Ca de los RyRs en la terminación del CICR. Aunque se demuestra la importancia de los cambios en la Ca luminal en la terminación de la liberación de Ca SR, nuestros resultados no excluyen necesariamente la posibilidad de que mecanismos adicionales, como la inactivación o adaptación de RyR en los sitios reguladores de la Ca citosólica, también puedan influir en la terminación de la liberación de Ca.
Aunque existe evidencia clara de un papel de los cambios en la Ca luminal en la terminación de las chispas cardíacas(ref. 3; presente estudio), estudios previos indicaron que las chispas de Ca en el músculo esquelético pueden no estar acompañadas de un agotamiento sustancial de la RS . Lacampagne et al. (33) se utilizó el análisis cinético de grabaciones de Ca spark de alta resolución temporal para sugerir que el flujo de liberación de Ca subyacente a la Ca spark es constante en las fibras musculares de anfibios. Debido a que el flujo de Ca SR debe disminuir cada vez que el SR cae, este resultado podría significar que los niveles luminales de Ca se mantengan estables durante las chispas de Ca. Por lo tanto, existe la posibilidad de que los mecanismos básicos responsables de la terminación de la chispa sean diferentes en el músculo cardíaco y el músculo esquelético. La realización de estudios complementarios en estos dos tipos de células (es decir, modulación de los niveles de proteína CSQ en fibras musculares esqueléticas y mediciones rápidas de cinética de chispa de Ca en miocitos cardíacos) debería ayudar a aclarar este problema.
Relevancia para CPVT. Uno de los aspectos más importantes de nuestros resultados es que muestran cómo los niveles reducidos de CSQ2 pueden causar arritmias cardíacas a nivel celular. La TVPC es una enfermedad arritmogénica caracterizada por síncope y muerte súbita inducible por ejercicio e infusión de catecolaminas (34). Hasta ahora, se han vinculado cuatro mutaciones a la TVPC. Tres de estas mutaciones parecen dar lugar a una expresión reducida de CSQ2 (17), y se ha propuesto que una mutación provoque una unión interrumpida de Ca (16). Nuestros resultados sugieren que la causa subyacente de la TVPC podría estar relacionada con la restitución anormal del mecanismo de liberación de Ca causada por la reducción de los niveles de CSQ2 (Fig. 5). Debido a la menor concentración de sitios de unión a Ca en el SR de las células que no expresan CSQ2, el llenado del almacén de Ca por la bomba SERCA se produce más rápido que en las células normales. La recarga de la tienda se hace aún más rápida cuando la actividad de SERCA es estimulada por la proteína quinasa A, lo que potencialmente explica la dependencia de catecolaminas de los episodios clínicos de TVPC. En los miocitos con niveles reducidos de CSQ2, la recuperación prematura de los canales de liberación de Ca de un estado refractario luminal dependiente de Ca condujo a descargas espontáneas y extrasistólicas de los depósitos de Ca SR. Se sabe que la liberación espontánea de Ca puede inducir corrientes internas y oscilaciones en el potencial de membrana, lo que resulta en arritmia desencadenada (4-7). Por lo tanto, las alteraciones observadas en el manejo de Ca podrían explicar, al menos en parte, la patogénesis de la TVPC asociada con defectos genéticos que dan lugar a una reducción de la actividad de unión a Ca (16) o a una reducción de los niveles de expresión de CSQ2 (17).
Comparación con Estudios Previos en Ratones Transgénicos. Nuestros hallazgos difieren de los resultados anteriores obtenidos en ratones transgénicos que sobreexpresan CSQ2 (14, 15). En esos estudios, una sobreexpresión de 10 a 20 veces de CSQ2 aumentó la capacidad de almacenamiento de Ca SR de miocitos cardíacos aislados; sin embargo, la Ca luminal no estaba disponible para su liberación, lo que llevó a señales de liberación de Ca globales y locales deprimidas. Estos cambios en el manejo de la Ac se acompañaron de varias alteraciones estructurales, funcionales y bioquímicas a nivel celular y subcelular y desarrollo de hipertrofia y fallo cardiacos. Por otro lado, el presente estudio mantiene los niveles de proteína CSQ2 más cercanos a los niveles fisiológicos en condiciones agudas en lugar de crónicas; por lo tanto, es probable que estos datos reflejen con mayor precisión las consecuencias fisiológicas directas de los cambios en los niveles de proteína CSQ2 en el manejo intracelular de Ca. Estos resultados destacan los posibles problemas para interpretar los efectos de la expresión constitutiva de alto nivel de proteínas en modelos animales transgénicos y el valor de los estudios complementarios en entornos más agudos.
Conclusión. En conclusión, hemos encontrado que el CSQ2 es un determinante esencial de la capacidad del RS para almacenar y liberar Ac en el músculo cardíaco. CSQ2 parece servir como un reservorio de Ca que es fácilmente accesible para el CICR y también como un tampón activo de Ca que modula el cierre luminal local dependiente de Ca de RyRs. Al mismo tiempo, CSQ2 estabiliza el mecanismo CICR al ralentizar la recarga funcional de las tiendas SR Ca. El comportamiento de reprogramación anormal de los canales de liberación de Ca podría explicar, o contribuir a, arritmias ventriculares asociadas con mutaciones en el gen CSQ2.
