Resultados

Expresión de ALDH1 en Páncreas embrionario y Adulto.

En base a estudios previos que documentaron altos niveles de actividad enzimática de ALDH1 en progenitores neurales, hematopoyéticos y epiteliales mamarios (17-19), caracterizamos patrones temporales y espaciales de expresión de la proteína ALDH1 en páncreas embrionario y adulto de ratón (Fig. 1). Usando E-cadherina como marcador de células epiteliales pancreáticas, encontramos que la proteína ALDH1 es detectable por primera vez dentro del epitelio pancreático en desarrollo en E12.5 (Fig. 1A). En este punto, la expresión se restringe a las puntas de los túbulos ramificados, recientemente propuestos para representar un dominio progenitor multipotencial (20). Un patrón similar de expresión ha sido reportado previamente para transcripciones de Aldh1a1 (21). La expresión en las puntas tubulares (y no en los troncos centrales) persiste hasta E14.5 (Fig. 1 B y B’), y posteriormente se regula hacia abajo en la diferenciación de células acinares. En el páncreas adulto, la expresión epitelial de ALDH1 se observa con mayor frecuencia en las células epiteliales centroacinares y ductales terminales (Fig. 1 C a E). También se detectaron células mesenquimales que expresan ALDH1 (E-cadherina negativa) rodeando islotes endocrinos y acinos exocrinos (Fig. S1).

Para caracterizar aún más la expresión de ALDH1 y la actividad enzimática de ALDH1 en células de conducto terminal/centroacinar adultas, utilizamos preparaciones de unidades acinar-ductales periféricas recién aisladas de páncreas exocrino de ratón digerido por colagenasa (22). Es importante destacar que estas unidades periféricas aisladas acinar-ductal están notablemente agotadas de elementos endocrinos y de conductos grandes. En comparación con el páncreas total, las unidades acinar-ductales periféricas mostraron una depleción >de 400 veces en las transcripciones de insulina, evaluadas mediante RT-PCR (Fig. S2A). Cuando se realizó el análisis FACS en unidades ductales acinar periféricas recolectadas de ratones transgénicos Ins1:DsRed que expresaban proteína fluorescente roja en células β, solo 3 de las 10.000 células (0,03%) de esta preparación dieron positivo para DsRed.

Se realizó una caracterización tridimensional adicional de la expresión de la proteína ALDH1 mediante el etiquetado fluorescente de montaje completo de unidades periféricas aisladas de ductal acinar. La proteína ALDH1 se localizó en combinación con E-cadherina como marcador de células epiteliales y con aglutinina Dolichos biflorus (DBA) conjugada con FITC o aglutinina de maní conjugada con FITC (PNA), marcadores de células ductales y acinares, respectivamente. Las imágenes multicanal confirmaron una localización ductal predominantemente centroacinar/terminal de células epiteliales que expresan ALDH1 en el páncreas adulto (Fig. S3). Las células que expresan ALDH1 se interpusieron con mayor frecuencia entre el epitelio ductal terminal y las células acinares más periféricas. Además, también se observaron células epiteliales únicas que expresan ALDH1 inmediatamente adyacentes al epitelio ductal terminal (Fig. S3 A y B). Se identificaron células ALDH1 positivas DBA positivas y DBA negativas, mientras que las células PNA positivas ALDH1 positivas solo se identificaron raramente.

Aislamiento de Células Centroacinares y Ductales Terminales que expresan ALDH1.

Con la esperanza de aislar las células que expresan ALDH1 del páncreas de ratón adulto, aprovechamos un sustrato fluorogénico conocido como «Aldefluor» (StemCell Technologies), que se ha utilizado previamente en el aislamiento basado en el sistema FACS de células madre hematopoyéticas, neuronales y epiteliales mamarias (17-19). Antes de intentar el aislamiento basado en FACS de células epiteliales pancreáticas que expresan ALDH1, primero aplicamos este reactivo para visualizar células vivas que expresan ALDH1 en unidades ductales acinar periféricas (Fig. 2). Como se muestra en la Fig. 2 E y F, estos estudios confirmaron la localización ductal centroacinar/terminal de células aldefluoras positivas de baja abundancia en páncreas de ratón adulto. Las células ductales centroacinares/terminales con aldefluor positivo se distinguieron fácilmente de las células acinares adyacentes en virtud de su pequeño tamaño y la falta de gránulos de zimógeno. Otros ejemplos de imágenes de células vivas utilizando el Aldefluor reactivo se proporcionan en la Fig. S4. Estos hallazgos implicaron que la inmunofluorescencia anti-ALDH1 y la citofluorescencia a base de aldefluores marcaban una población centroacinar/ductal terminal similar, y además sugirieron que estas células podrían aislarse con éxito con FACS.

A continuación, perseguimos la caracterización y clasificación basada en FACS de células individuales disociadas de unidades ductales acinares periféricas. Como medio inicial para establecer la apertura específica de las células que expresan ALDH1, empleamos un inhibidor farmacológico de la actividad enzimática de ALDH1 (DEAB). Como se muestra en la Fig. 2 A–D, esta estrategia permitió el aislamiento de una población celular de baja abundancia caracterizada por altos niveles de actividad enzimática ALDH1 sensible a DEAB, que comprende 0,9% ± 0.2% de todas las células clasificadas en el páncreas de ratón adulto. Utilizando un anticuerpo E-cadherina para identificar simultáneamente células epiteliales, se encontró que las células aldefluoras (+) de E-cadherina (+) representaban el 0,5 ± 0,13% de todas las células clasificadas en el páncreas de ratón adulto (Fig. 2D).

Usando RT-PCR cuantitativo para comparar las poblaciones de Aldefluor positivo, E-cadherina positiva (A+E+), Aldefluor negativo, E-cadherina positiva (A-E+), Aldefluor positivo, E-cadherina negativa (A+E -) y Aldefluor negativo, E-cadherina negativa (A−E -) aisladas de páncreas de ratón adulto, encontramos que la población A+E+ está significativamente enriquecida para la codificación de transcripciones Aldh1a1 y Aldh1a7, y se agotaron las transcripciones de otras dos isoformas de ALDH1, Aldh1a2 y Aldh1a3 (Fig. 3G). No se detectó Aldh8a1 en ninguna de las muestras. En comparación con la población A−E+, las células A+E+ se agotaron modestamente de transcripciones para Pdx1 (P < 0,09), Amilasa (P < 0,001) y Citoqueratina-19 (P < 0,01) (marcadores expresados en células β diferenciadas, células acinares y células de conductos, respectivamente). En contraste, las células A + E + se caracterizaron por una expresión de alto nivel de Ptf1a, a pesar de que estaban agotadas de transcripciones de amilasa y proteína de amilasa (Fig. 3G y Fig. S5). Además, estas células se enriquecieron para transcripciones que codifican Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 y Hey2, marcadores previamente asociados con poblaciones progenitoras en páncreas y otros tejidos. Mediante el etiquetado inmunofluorescente en preparaciones de citospinas de células clasificadas por el sistema FACS, se confirmó un marcado enriquecimiento de las proteínas ALDH1 y Sox9, y el agotamiento de la amilasa en las células A+E+ (Fig. S5). Además, también realizamos análisis FACS para determinar la frecuencia con la que las células aldefluoras (+) también fueron positivas para marcadores de células madre como CD133 y proteína Sca-1, y observamos que más del 90% de las células aldefluoras (+) coexpresaron adicionalmente ambos marcadores de células madre. Por el contrario, solo el 0,11% de las células aldefluoras (+) también fueron positivas para el marcador endotelial vascular PECAM, mientras que el 0,08% fueron positivas para el marcador hematopoyético CD45. Cuando se realizó el análisis de FACS en unidades ductales acinar periféricas recolectadas de ratones transgénicos Ins1-DsRed que expresaban proteína fluorescente roja en células β, se encontró que todas las células aldefluoras (+) eran negativas para DsRed.

Análisis de la Pancreatosfera de la Función Progenitora Endocrina y Exocrina.

Como cribado inicial para la actividad de tipo progenitor, analizamos las células aldefluoras (+) y Aldefluoras (–) para determinar la capacidad de formar pancreatosferas (Fig. 3), similar al ensayo de neuroesferas comúnmente utilizado para identificar progenitores neuronales (23). En estos ensayos, las células ductales centroacinares / terminales A + E + fueron capaces de formar esferas en cultivo en suspensión. Las celdas A + E + mostraron una eficiencia de formación de esferas >100 veces mayor que la de sus contrapartes A-E+ (Fig. 3 A y B y cuadro S1). Con eficiencias más bajas, las celdas individuales A + E+ incluso pudieron formar esferas cuando se platearon a densidad clonal (una celda por pocillo) en placas de 96 pocillos (Tabla S1). Ninguna de las poblaciones negativas de E-cadherina exhibió una capacidad significativa de formación de esferas. Cuando se cultivaron durante un período de 5 a 7 días, las pancreatosferas derivadas de células A+E+ exhibieron una fuerte expresión de E-cadherina (Fig. 3C), confirmando su identidad epitelial, y las células individuales dentro de las esferas comenzaron a acumular cantidades considerables de amilasa o insulina y péptido C de insulina (Fig. 3 D y E). A los 5 días, ≈50% de las pancreatosferas mostraron expresión de amilasa, mientras que un 30% mostró inmunorreactividad al péptido C de insulina. Las esferas individuales fueron generalmente positivas para insulina o amilasa, pero no para ambas. Pequeños subconjuntos de células dentro de las esferas mantuvieron la expresión de ALDH1 durante el período de cultivo, y también demostraron la expresión nuclear de la proteína Sox9 (Fig. 3 F y G), sugiriendo el posible mantenimiento de un grupo progenitor autorrenovable. Esta capacidad aparente de autorrenovación se vio reforzada por el hecho de que las pancreatosferas generadas por células ductales centroacinares/terminales aldefluores (+) podían someterse a disociación enzimática en serie, manteniendo su capacidad de formación de esferas durante un mínimo de tres pasajes secuenciales a intervalos de 7 días. Además, las células dentro de esferas eran altamente proliferativas, evaluadas por la incorporación nocturna de EdU añadida al principio o al final del período de cultivo (Fig. 3H).

En base a las distintas capacidades progenitoras mostradas por las células A+E+, examinamos más a fondo las poblaciones de células clasificadas para la expresión de Ngn3, un marcador de células progenitoras endocrinas (Fig. S2B). De acuerdo con estudios previos (7), no pudimos detectar una expresión significativa de Ngn3 en el páncreas total de adultos ni en ninguna de las poblaciones de células recién clasificadas. Sin embargo, una vez que las células A+E+ se colocaron en cultivo, comenzaron a generar una expresión detectable de Ngn3 inmediatamente antes del inicio de la expresión de insulina, confirmando aún más la capacidad progenitora endocrina de las células epiteliales centroacinar y ductal terminal que expresan ALDH1.

Las Pancreatosferas Derivadas de las Células Ductales/Centroacinares Terminales Aldefluor (+) Muestran Secreción de Insulina Sensible a la Glucosa.

La detección de células que expresan insulina y péptido C de insulina en pancreatosferas cultivadas motivó la evaluación de si estas células eran capaces de secreción de insulina sensible a la glucosa, una característica de las células β funcionales. Como control positivo, utilizamos células Ins – 1 (clon 832/13), una línea de células β inmortalizadas que se usa comúnmente para estudios de secreción de insulina en respuesta a concentraciones fisiológicas de glucosa. Después de la incubación nocturna de pancreatosferas o células Ins-1 en glucosa de 0, 5 y 11 mM, se recolectaron sobrenadantes de medios de cultivo y lisados celulares y se analizaron para el péptido C de insulina secretada y celular utilizando un ensayo basado en ELISA. Pancreatosferas derivadas de células ductales centroacinares/terminales de Aldefluor (+) secretadas por péptido C de forma dependiente de la glucosa, con una sensibilidad a la glucosa similar a la mostrada por las células Ins-1 (Fig. 3I).

Las Células Ductales/Centroacinares Terminales Adultas Aldefluoras ( + ) Pueden Contribuir a los Linajes Endocrinos y Exocrinos Embrionarios.

Como una prueba aún más estricta para la actividad progenitora pancreática, microinyectamos células aisladas de Aldefluor (+) y Aldefluor (–) en yemas pancreáticas dorsales microdisectadas aisladas de embriones de ratón E12.5, y analizamos la capacidad de contribuir productivamente al desarrollo de linajes endocrinos y exocrinos (Fig. 4). Este enfoque se utilizó recientemente para documentar la actividad progenitora de las células que expresan Ngn3 que surgen después de la ligadura del conducto pancreático (7). Para trazar el linaje de las células donantes derivadas de adultos y distinguirlas de sus contrapartes derivadas de embriones, aislamos células aldefluor (+) y Aldefluor (–) del páncreas de ratones portadores de un pCAG omnipresente:el transgén mCherry, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 4A (pCAG:Los ratones mCherry fueron amablemente proporcionados por Michael Wolfgang, Universidad Johns Hopkins). En comparación con las células aldefluoras ( – ), las células aldefluoras (+) tenían un potencial dramáticamente mejorado para contribuir a los linajes endocrinos emergentes dentro de las yemas dorsales en maduración, como lo demuestra la coexpresión de mCherry con cualquiera de los péptidos C (Fig. 4 B-E) o glucagón (Fig. 4 F-I). Utilizando el etiquetado de E-cadherina superpuesta para permitir el recuento de células mCherry positivas individuales, evaluamos cuantitativamente la capacidad de las células aldefluoras (+) y Aldefluoras (−) adultas para entrar en linajes embrionarios. Siete días después de la microinyección de Aldefluor (+) las células en E12.5 yemas dorsales, se observó expresión de glucagón en el 11,7% de las células mCherry positivas residuales, con expresión de péptido C de insulina observada en un 11,6% adicional (Fig. 5N). En contraste, el 2,4% de las células aldefluoras (-) positivas a mCherry residuales expresaban glucagón, y solo el 0,2% expresaba péptido C de insulina. Curiosamente, las poblaciones de Aldefluor (+) y Aldefluor (–) mostraron capacidades equivalentes para entrar en linajes epiteliales no endocrinos, tal vez reflejando el hecho de que la mayoría de la población de Aldefluor (–) estaba compuesta de células acinares ya diferenciadas. Se observaron frecuencias similares de E-cadherina, amilasa y positividad a la ANP en células mCherry positivas residuales derivadas de poblaciones de Aldefluor (+) o Aldefluor (-) (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

Para evaluar el comportamiento in vivo de las células centroacinares y de los conductos terminales que expresan ALDH1, se evaluaron los patrones de expresión de ALDH1 en el contexto de inflamación crónica y metaplasia regenerativa inducida por la administración secuencial de dosis bajas de caeruleína. Como se informó anteriormente (15), el tratamiento de ratones adultos con tres inyecciones de caeruleína (50 µg/kg) por semana durante 3 semanas consecutivas indujo un estado de pancreatitis crónica seguido de una regeneración y reparación casi completas. Este proceso se caracteriza por infiltrados inflamatorios, expansión estromal y la formación de complejos tubulares metaplásicos regenerativos, que incluyen complejos tubulares de tipo 1 que anteriormente se habían demostrado que eran derivados de células acinares y complejos tubulares de tipo 2 (TC2), que anteriormente se habían demostrado que eran derivados de células de conductos terminales proliferantes (15). En contraste con la abundancia relativamente baja de conductos terminales que expresan ALDH1 y células centroacinares observada en el páncreas adulto normal (Fig. 5 A y B), conducto terminal de expresión de ALDH1 (Fig. 5 C y D) y centroacinar (Fig. Las células 5 E y F) se expandieron notablemente en el contexto de la pancreatitis crónica inducida por caeruleína. Cabe destacar que los complejos tubulares de tipo 2 estaban compuestos predominantemente por células que expresaban ALDH1 (Fig. 5H), mientras que los complejos tubulares tipo 1 no mostraron evidencia de expresión de ALDH1 (Fig. 5G).