Resumen

Existen varias técnicas disponibles para el aislamiento de Candida dentro de la cavidad oral. Estos métodos juegan un papel importante en el diagnóstico y manejo de la candidosis oral. La creciente importancia de la candida está en parte relacionada con la aparición de la infección por el VIH y el uso más generalizado de la quimioterapia inmunosupresora. Junto con la Candida albicans ha habido un mayor reconocimiento de la importancia de las especies de Candida no albicans en la candidosis oral. La identificación de cepas infectantes de Candida es importante porque los aislados de especies de Candida difieren ampliamente, tanto en su capacidad para causar infección como en su susceptibilidad a agentes antifúngicos. Por lo tanto, esta revisión proporciona una visión general de los métodos confiables de aislamiento de la cándida e identificación de aislados de la cavidad oral.

1. Introducción

El término Candida se origina de la palabra latina candid, que significa blanco. Las esporas de la Cándida son una forma comensal e inofensiva de un hongo dimórfico que se convierte en pseudohífas invasivas y patógenas cuando hay una alteración en el equilibrio de la flora o en la debilidad del huésped .

La traducción de este comensal endógeno al parásito causante de la enfermedad puede estar asociada con factores distintos de los atributos patógenos del organismo en sí, que es bastante único en comparación con la mayoría de las otras enfermedades infecciosas, donde la virulencia de los organismos se considera el factor clave en la patogénesis. Por lo tanto, las especies de Candida son estrictamente oportunistas. Se podría afirmar que ni las formas superficiales ni sistémicas de infecciones por candida podrían iniciarse en ausencia de patología subyacente .

Hay muchas especies de Cándida (Tabla 1), pero la más prevalente que se recupera de la cavidad oral, tanto en estado comensal como en casos de candidosis oral, es C. albicans. Se estima que esta especie representa más del 80% de todos los aislados de levaduras orales.

In recent years there has been an increased interest in infections caused by the opportunistic pathogen Candida. La creciente importancia de la candida está en parte relacionada con la aparición de la infección por el VIH y el uso más generalizado de la quimioterapia inmunosupresora . La identificación de cepas infectantes de Candida es importante porque los aislados de especies de Candida difieren ampliamente, tanto en su capacidad para causar infección como en su susceptibilidad a agentes antifúngicos .

Junto con la C. albicans ha habido un mayor reconocimiento de la importancia de la especie Candida no albicans en la enfermedad humana. C. glabrata y C. los krusei son especies que han recibido atención debido a su mayor resistencia a ciertos agentes antifúngicos. C. dubliniensis es una especie patógena recientemente identificada, descrita por primera vez en 1995 cuando se coisoló con C. albicans de casos de candidosis oral en individuos infectados por el VIH .

Esta revisión proporciona una visión general de los métodos confiables de aislamiento de la cándida e identificación de aislados de la cavidad oral.

2. Atributos patógenos de Candida

La transición de Candida de un comensal inofensivo a un organismo patógeno es compleja y está relacionada con cambios ambientales sutiles que conducen a la expresión de una gama de factores de virulencia (Tabla 2). Es el efecto combinado de los factores huésped y candidal que en última instancia contribuyen al desarrollo de la candidosis oral .

Independientemente del tipo de candidiasis, la capacidad de las especies de Candida para persistir en las superficies mucosas de individuos sanos es un factor importante que contribuye a su virulencia. Esto es particularmente importante en la cavidad oral, donde el organismo tiene que resistir la acción de lavado mecánico de un flujo relativamente constante de saliva hacia el esófago .

No se reconoce un solo factor de virulencia predominante para la cándida, aunque hay una serie de factores que han estado implicados en la promoción del proceso de infección. Estos incluyen atributos involucrados en la adhesión de Candida a las superficies orales (por ejemplo, hidrofobicidad relativa de la superficie celular y la presencia de moléculas de adhesina específicas), la capacidad de resistir los mecanismos de defensa inmunitaria del huésped (por ejemplo, conmutación fenotípica de alta frecuencia y transición morfológica), y la liberación de enzimas hidrolíticas (por ejemplo,, aspartil proteinasas y fosfolipasas secretadas) que pueden inducir daño a las células huésped .

3. Candidosis oral

Samaranayake propuso una clasificación en la que las lesiones por candidosis oral se subdividían en dos grupos principales: Grupo I, o candidosis oral primaria limitada a lesiones localizadas en la cavidad oral sin compromiso de la piel u otras mucosas; Grupo II o candidosis oral secundaria, donde las lesiones están presentes en sitios orales y extraorales como la piel (Tabla 3). Las lesiones del grupo I consisten en la tríada clásica—variantes pseudomembranosas, eritematosas e hiperplásicas—y algunas han sugerido una mayor subdivisión de esta última en tipos nodulares y similares a placas .

4. Diagnóstico de Candidosis oral

El diagnóstico de candidosis oral a menudo se puede hacer sobre la naturaleza de las características de presentación clínica, aunque se deben tomar muestras microbiológicas si es posible para identificar y cuantificar cualquier Candida que pueda estar presente y proporcionar aislados para pruebas de sensibilidad antifúngica.

5. Métodos de aislamiento

Las técnicas disponibles para el aislamiento de Candida dentro de la cavidad oral incluyen el uso de un frotis, un hisopo liso , un cultivo de huellas , la recolección de saliva completa , el enjuague oral concentrado y la biopsia de mucosa. Cada método tiene ventajas y desventajas y la elección de la técnica de muestreo se rige fundamentalmente por la naturaleza de la lesión para ser investigados (Tabla 4). Cuando una lesión accesible y definida es evidente, a menudo se prefiere un enfoque de muestreo directo, como el uso de un hisopo o una huella, ya que esto proporcionará información de los organismos presentes en la lesión en sí. En los casos en que no hay lesiones obvias o en los casos en que la lesión es difícil de acceder, una muestra indirecta basada en muestras de saliva de cultivo o un enjuague oral es más aceptable.

La estimación cuantitativa de la carga fúngica se puede hacer utilizando impresiones, enjuague oral concentrado y cultivo de enjuague oral, como medio de diferenciar entre transporte comensal y existencia patógena de Candida oral, con cargas más altas consideradas probables en este último .

6. Se deben examinar las características morfológicas de las especies de candida mediante microscopía directa

(Tabla 5) para su identificación. Un frotis es de valor para diferenciar entre levaduras y formas hifales, pero es menos sensible que los métodos culturales . La preparación de hidróxido de potasio (KOH) de la muestra revela hifas septadas no pigmentadas con ramificación dicotómica característica (en un ángulo de aproximadamente 45°) . En el método de tinción fluorescente KOH-Calcofluor, las características fúngicas como hifas, células de levadura y otros elementos fúngicos se fluorescirán .

Un frotis tomado del sitio de la lesión se fija en portaobjetos de microscopio y luego se tiñe con la tinción de gram o con la técnica de ácido periódico de Schiff (PAS). Usando estos métodos, las hifas y levaduras de cándida aparecen de color azul oscuro (tinción de Gram) o rojo/púrpura (PAS).

En caso de candidiasis hiperplásica crónica, es necesaria una biopsia de la lesión para la detección posterior de Candida invasora mediante tinción histológica utilizando las tinciones PAS o metenamina de Gomori. La demostración de elementos fúngicos dentro de los tejidos se realiza a medida que se tiñen profundamente con estas manchas. La presencia de blastosporas e hifas o pseudohifas puede permitir al histopatólogo identificar el hongo como una especie de Candida y, dada la presencia de otras características histopatológicas, hacer un diagnóstico de candidiasis hiperplásica crónica .

7. Cultivo de laboratorio

7.1. Hisopo

Un hisopo de un sitio lesional es un método relativamente simple para detectar el crecimiento y se puede obtener una estimación semicuantitativa de la Candida. El enfoque de muestreo implica frotar suavemente un hisopo de algodón estéril sobre el tejido lesional y luego inocular un medio de aislamiento primario, como el agar de dextrosa de Sabouraud (SDA) .

7.2. Enjuague oral concentrado

La técnica de enjuague oral implica que el paciente mantenga 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (0,01 M, pH 7,2) en la boca durante 1 minuto. La solución se concentra (10 veces) por centrifugación y un volumen conocido, generalmente de 50 µL, se inocula en un medio de agar utilizando un sistema de enchapado en espiral. Después de 24-48 horas de incubación a 37°C, el crecimiento se evalúa mediante el recuento de colonias y se expresa como unidades formadoras de colonias de cándida por ml (ufc mL−1) de enjuague .

7.3. Cultivo de impresión

El método de impresión utiliza una almohadilla de espuma estéril de tamaño conocido (normalmente 2,5 cm2), sumergida previamente en un medio líquido apropiado, como el caldo de Sabouraud, inmediatamente antes de su uso. La almohadilla se coloca en el sitio objetivo (prótesis mucosa o intraoral) durante 30 segundos y luego se transfiere a un agar para su cultivo .

8. Medio de cultivo

El medio de aislamiento primario más utilizado para la candida es el SDA que, aunque permite el crecimiento de la Candida, suprime el crecimiento de muchas especies de bacterias orales debido a su bajo pH. La incorporación de antibióticos en el SDA aumentará aún más su selectividad . Normalmente, el SDA se incuba aeróbicamente a 37°C durante 24-48 horas. La cándida se desarrolla como colonias convexas pastosas, suaves y cremosas en el SDA y la diferenciación entre especies rara vez es posible . Se estima que más de una especie de candida se encuentra en aproximadamente el 10% de las muestras orales y en los últimos años la capacidad de detectar especies no líquidas se ha vuelto cada vez más importante .

En los últimos años, se han desarrollado otros medios diferenciales que permiten la identificación de ciertas especies de Candida en función de la apariencia y el color de la colonia tras el cultivo primario. La ventaja de estos medios es que se puede determinar la presencia de múltiples especies de candida en una sola infección, lo que puede ser importante para seleccionar las opciones de tratamiento posteriores . Ejemplos de estos incluyen el agar Pagano-Levin o los agares cromogénicos disponibles comercialmente, a saber, CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplato o Candichrom albicans .

El agar Pagano-Levin distingue entre las especies de Candida basándose en la reducción del cloruro de trifeniltetrazolio. El medio produce colonias de color pálido de C. albicans, mientras que las colonias de otras especies de Candida exhiben diversos grados de coloración rosa. El agar Pagano-Levin tiene una sensibilidad similar al SDA, pero es superior para la detección de más de una especie en la muestra, CHROMagar Candida identifica a C. albicans, C. tropicalis y C. krusei se basan en el color y la apariencia de la colonia, mientras que Albicans ID y Fluroplato han demostrado ser beneficiosos para la presunta identificación de C. albicans . Se ha informado que la especificidad de la identificación es del 95% para la candida CHROMagar y del 98,6% para los agares Albicans ID y Fluroplato . El uso de CHROMagar Candida como agar de aislamiento primario ha sido citado como un enfoque que permite la discriminación de la C. dubliniensis recientemente descrita de la C. albicans. En CHROMagar Candida, C. dubliniensis se desarrolla como colonias verdes más oscuras en comparación con las de C. albicans . Sin embargo, la discriminación entre estas dos especies que utilizan CHROMagar parece disminuir en la subcultura y el almacenamiento de aislados. El fracaso de C. dubliniensis para crecer en medios de agar a la elevada temperatura de incubación de 45 ° C se ha sugerido recientemente como una prueba alternativa para discriminar entre estas dos especies .

9. Identificación de especies de Candida

La identificación de levaduras basada en medios de cultivo primarios puede confirmarse a través de una variedad de pruebas complementarias basadas tradicionalmente en las características morfológicas (Tabla 5) y fisiológicas de los aislados.

9.1. Criterios morfológicos

La prueba de tubo germinativo es el método estándar de laboratorio para identificar a C. albicans. La prueba consiste en la inducción de excrecencias de hifas (tubos germinativos) cuando se subcultura en suero de caballo a 37°C durante 2-4 horas. Aproximadamente el 95% de los aislados de C. albicans producen tubos germinales, una propiedad también compartida por C. stellatoidea y C. dubliniensis .

C. albicans y C. dubliniensis también se pueden identificar de otras especies en base a su capacidad para producir características morfológicas conocidas como clamidosporas. Las clamidosporas son estructuras esféricas refractarias generadas en los terminales de las hifas tras el cultivo de aislados en un medio nutricionalmente pobre, como el agar de harina de maíz. Los aislados se inoculan en un patrón de eclosión cruzada en el agar y se superponen con un cubreobjetos estéril. Los agares se incuban durante 24-48 horas a 37 ° C y luego se examinan microscópicamente para detectar la presencia de clamidosporas .

9.2. Criterios fisiológicos / Identificación bioquímica

La identificación bioquímica de especies de Candida se basa en gran medida en la utilización de carbohidratos. Las pruebas tradicionales habrían implicado el cultivo de aislados de prueba en un agar basal que carecía de una fuente de carbono. Las soluciones de carbohidratos se colocarían en pocillos del agar sembrado o en discos de papel de filtro ubicados en la superficie del agar. El crecimiento en las proximidades de la fuente de carbono indicaría la utilización. Los sistemas comerciales se basan en el mismo principio, pero los carbohidratos de prueba se alojan en pozos de plástico ubicados en una tira de prueba. El crecimiento en cada pozo se lee por cambios en la turbidez o cambios de color en ciertos sistemas de kit. Los códigos numéricos obtenidos a partir de los resultados de los ensayos se utilizan para identificar el organismo de ensayo basándose en la comparación de la base de datos .

9.3. Serología

Las pruebas serológicas se utilizan con frecuencia para determinar la importancia clínica de los aislados de especies de Candida. El aumento de los títulos de anticuerpos lgG contra C. albicans puede reflejar candidiasis invasiva en individuos inmunocompetentes. La detección de anticuerpos IgA e IgM es importante para identificar una infección aguda. Los individuos inmunodeprimidos a menudo muestran variabilidad en la producción de anticuerpos y, en tal caso, se recomienda el uso de una prueba de detección de antígenos. Pruebas como el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y el ensayo de inmunoabsorción radioeléctrica (RIA) para la detección de antígeno candídeo, ya sea manano de pared celular o constituyentes citoplasmáticos, ya están disponibles en los países desarrollados .

El diagnóstico serológico a menudo se retrasa y las pruebas aún carecen de sensibilidad y especificidad. Además, la producción de anticuerpos en pacientes inmunodeprimidos es variable, lo que complica el diagnóstico . Esto se debe al hecho de que los antígenos y metabolitos fúngicos a menudo se eliminan rápidamente de la circulación y la presencia de anticuerpos no siempre implica una infección por candida, especialmente en pacientes con enfermedades subyacentes graves o que están tomando medicamentos inmunosupresores .

Las pruebas serológicas normalmente no son una herramienta de diagnóstico para la candidosis oral. Sin embargo, tales pruebas pueden ser un instrumento pronóstico en pacientes con candidiasis oral grave que responden mal a la terapia antimicótica .

9.4. Métodos de Identificación Basados en moléculas

La identificación por análisis de variabilidad genética es un enfoque más estable que el uso de métodos basados en criterios fenotípicos. Para la identificación de Candida basada en la variación genética, se analizan las diferencias de cariotipo electroforético y los polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLPs) utilizando electroforesis en gel o hibridación ADN-ADN .

También se han utilizado enfoques de PCR específicos de especies para la identificación de especies de Candida. Se han reportado varios genes diana para la discriminación de especies de Candida, aunque los más frecuentemente amplificados son las secuencias del operón de ARN ribosómico. La identificación puede obtenerse en función de los tamaños de los productos de PCR obtenidos tras la resolución de electroforesis en gel, o de la variación de la secuencia de productos de PCR determinada por secuenciación directa o mediante el uso de análisis de fragmentos de restricción tras el corte de secuencias de PCR con endonucleasas de restricción .

La hibridación fluorescente in situ con el método de ácido nucleico peptídico (PNA Fish) es una nueva técnica de detección que se dirige a secuencias específicas de especies altamente conservadas en el ARNr abundante de C. albicans vivo. Las células individuales se pueden detectar directamente sin necesidad de amplificación . Esta técnica alcanza una sensibilidad del 98,7-100%, con una especificidad del 100%, lo que permite la discriminación de C. albicans de la C. dubliniensis fenotípicamente similar .

La tecnología de base molecular también se puede utilizar para identificar cepas de especies de Candida, aunque el uso de técnicas como la Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE), el análisis aleatorio de ADN Polimórfico Amplificado (RAPD) y la PCR de amplificación de secuencia repetida (REP) se reservan en gran medida para investigaciones epidemiológicas en la investigación de la candidosis oral .

10. Conclusión

En los últimos años se ha dado mayor énfasis a la identificación confiable de especies de Candida a partir de muestras clínicas humanas. En la Figura 1 se presenta una representación esquemática para el aislamiento y la identificación de la cándida. Dado que la Candida es la microflora residente, se requieren métodos de aislamiento adecuados para determinar la presencia en la boca junto con su número. También es importante identificar las cepas infectantes de Candida porque los aislados de especies de Candida difieren ampliamente, tanto en su capacidad para causar infección como en su susceptibilidad a los agentes antifúngicos. Varias técnicas fenotípicas están disponibles para identificar Candida aislada, incluyendo el uso de pruebas de cultivo morfológico, medios de agar diferenciales y pruebas de asimilación bioquímica. Estos métodos se complementan con técnicas moleculares recientes, reservadas en gran medida para investigaciones epidemiológicas.

Figura 1.

representación Esquemática de aislamiento e identificación de especies de Candida en la cavidad bucal.