El virus Coxsackievirus B3 (CVB3) es un enterovirus de la familia Picornaviridae. Tras la unión al receptor del virus coxsackievirus y el adenovirus (6, 64), el ARN viral entra en el citoplasma, donde se traduce en una única poliproteína por la maquinaria de traducción del huésped. La poliproteína es procesada proteolíticamente por proteasas virales para producir todas las proteínas estructurales y no estructurales virales. La ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por virus transcribe ARN virales de cadenas negativas, que sirven como plantillas para la síntesis de múltiples genomas de progenie. Después del empaquetado viral, el virus se libera, potencialmente bajo la influencia de la proteína 2B codificada por el virus (67). Durante el proceso replicativo y la liberación de la progenie viral, se produce el efecto citopático (EPC) y la célula huésped se lesiona, con una eventual pérdida de viabilidad.

Los procesos celulares del huésped múltiple se alteran durante la parasitación del picornavirus. La proteína vírica 2Apro escinde directamente el factor 4 gamma de iniciación eucariótica (eIF4G). La escisión de este factor de iniciación de la traducción no solo elimina la traducción del ARNm dependiente de la cap (19); se cree que los productos de la escisión estimulan la traducción del ARNm sin tapar, como el genoma del picornavirus no celular (43), que utiliza un novedoso mecanismo de entrada de ribosomas internos para comenzar la traducción de proteínas (31, 76). Se ha demostrado que las proteínas 2APRO y 3CPRO del virus de la poliomielitis escinden la proteína de unión a TATA, y la 3Cpro también cierra la transcripción de las ARN polimerasas I, II y III (11, 72, 74). Los factores de transcripción TFIIIC (10), CREB (73) y Oct-1 (75) también son escindidos por 3Cpro durante la infección por picornavirus. Se ha demostrado que la proteína CVB3 2B modifica el retículo endoplásmico y la permeabilidad de la membrana plasmática (14), causando un aumento de la concentración de calcio libre citosólico (28, 67) y lesiones de membrana que pueden facilitar la liberación de la progenie viral. Los gradientes iónicos colapsan (40, 52), y la actividad de la fosfolipasa se altera (24, 29). La infección por CVB3 de las células HeLa produce fosforilación de tirosina de dos proteínas celulares a las 4 h de la infección, y la inhibición de estas fosforilaciones reduce significativamente la producción de progenie viral (27). Está claro que la infección es un proceso celular dinámico en el que las interacciones oportunas entre las proteínas virales y hospederas determinan el resultado tanto para el virus como para las células hospederas.

Ahora está claro que las cisteína proteasas de la familia de enzimas caspasas son moléculas efectoras clave en la muerte celular apoptótica. Una vez activadas, las caspasas escinden sustratos específicos, incluyendo la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (35), factor de fragmentación del ADN (DFF) (37), gelsolina (34), lámina A (58), proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (68), α-fodrina (12, 66), cinasa de adhesión focal (71) y mdm2 (18), entre muchos otros. Tales eventos de escisión resultan en alteraciones importantes de los procesos celulares homeostáticos normales y los cambios morfológico-estructurales celulares correspondientes.

Muchos virus poseen mecanismos bioquímicos para evadir y / o inducir la apoptosis en las células en las que residen (para revisiones, ver referencias 49 y 60). Diferentes virus interactúan en diferentes etapas de la vía de muerte apoptótica. Los virus han desarrollado estrategias dirigidas al complejo de señalización del receptor alfa del factor de necrosis tumoral (TNF-α)-TNF, la familia de reguladores Bcl–2 o la familia de ejecutores de la caspasa (49, 60). Quedan por determinar los mecanismos de muerte de las células infectadas por CVB3; sin embargo, hay evidencia morfológica limitada con respecto a la inducción de apoptosis en células infectadas por picornavirus. La evidencia obtenida con el virus de la encefalitis murina de Theiler (32, 65) y el poliovirus (63) ha indicado que las células infectadas por picornavirus sufren apoptosis, según criterios morfológicos que incluyen condensación nuclear y fragmentación del ADN.

Para determinar si las caspasas están activadas y son responsables de la EPC observada después de la infección por CVB3, células HeLa (Colección de Cultivos de Tipo Americano, Rockville, Md.) se infectaron, a una multiplicidad de infección (MOI) de 5, con CVB3 (generosamente proporcionado por Charles Gauntt, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, San Antonio) o se trataron de forma simulada con un medio esencial mínimo (MEM) que carecía de suero bovino fetal (FBS) durante 45 min. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se sustituyó el MEM completo que contenía 10% de FBS. Un control positivo de la apoptosis consistió en células HeLa tratadas con el anillo monoácido fotosensibilizador derivado de benzoporfirina A (BPD-MA) durante 1 h y luego expuestas a la luz visible como se describió anteriormente (22, 23). Los cultivos fueron examinados y cosechados en 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, y 12 h postinfección. Las células se lavaron dos veces en PBS frío y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis (20 mm Tris , 137 mm NaCl, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P-40, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 0,15 U de aprotinina por ml) por área de cultivo de 75 cm2. Después de una incubación de 20 minutos en hielo, los sobrenadantes se recogieron después de la centrifugación a 10.000 ×g y se almacenaron a -20°C para análisis bioquímicos adicionales.

El patrón temporal de producción de proteínas virales CVB3, virus de la progenie y la evolución de los cambios morfológicos degenerativos de las células HeLa se consideraron en conjunto con un examen de las proteínas de muerte de las células huésped. Las muestras de lisado celular se separaron mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a la nitrocelulosa (membranas de nitrocelulosa Hybond ECL; Amersham). Las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (PBS con 0,1% de Tween 20 y 5% de leche desnatada en polvo). Después de dos lavados en el tampón de lavado (PBS con 0.1% Tween 20), las membranas se incubaron con anticuerpos contra CVB3 (anti-CVB3 policlonal de conejo, 1:1.000; Productos químicos Precisos). Las membranas se lavaron tres veces en tampón de lavado y se incubaron con un anticuerpo secundario de inmunoglobulina anti-conejo de burro (Amersham). Las membranas se lavaron tres veces, y las inmunoglobulinas secundarias conjugadas con peroxidasa de rábano picante se detectaron mediante el método de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham) y se expusieron a una película de autorradiografía de Hiperfilm (Amersham). Se pudieron detectar aumentos significativos en la síntesis de proteínas virales entre las 3 y las 5 h posteriores a la infección (Fig.1B). Las proteasas virales escinden tanto las proteínas virales como las del huésped al principio de la infección. Mediante análisis inmunoblot con anti-eIF4G monoclonal de ratón (1: 1.000; Laboratorios de Transducción), se encontró que la eIF4G es escindida por la proteasa viral 2A a partir de 1 h después de la infección, con una pérdida adicional de detección de la proteína de 220 kDa a las 5 h después de la infección (Fig. 1C). La cantidad de CVB3 en el sobrenadante celular (virus liberado) se determinó en monocapas de células HeLa mediante el método de ensayo de placa superpuesta de agar descrito anteriormente (3). Brevemente, el sobrenadante de la muestra se diluyó en serie 10 veces, las diluciones se superpusieron en monocapas confluentes del 90 al 95% de células HeLa en placas de seis pocillos (Costares), y las células superpuestas se incubaron durante 1 h (5% de CO2, 37°C). Se eliminó el medio que contenía virus no receptivo, y se superpuso MEM completo caliente que contenía agar al 0,75% en cada pocillo. Las placas se incubaron de 36 a 48 h (5% de CO2, 37°C), se fijaron con fijador de Carnoy (95% de etanol–ácido acético) y se teñieron con 1% de violeta cristal. El virus de la progenie estaba presente en el sobrenadante a niveles basales entre 1 y 5 h. A las 6 h después de la infección se detectó un aumento en los niveles del virus sobrenadante, y la producción exponencial del virus comenzó a las 9 h después de la infección, según lo determinado por los ensayos de placa (Fig. 1A). Las células HeLa mostraron cambios marcados en la morfología, incluida la condensación celular, el redondeo y la liberación de la monocapa de cultivo, entre 6 y 7 h después de la infección, como se observa en la microscopía de contraste (Fig. 1D).

Para determinar si la maquinaria de muerte de la célula huésped se activa después de la infección por CVB3, se realizó un análisis inmunoblot del lisado recogido en momentos específicos. La caspasa 3, que está presente en las células como proteína precursora con una masa molecular de 32 kDa, es una molécula primaria involucrada en la ejecución de la muerte celular. Mediante el uso de anti-caspasa 3 monoclonal de ratón (1:1.000; Laboratorios de Transducción), se determinó que las células no infectadas contenían la proteína precursora de 32 kDa. Después de la infección por CVB3, el nivel de la proteína precursora de 32 kDa comenzó a disminuir entre las 7 y las 8 h posteriores a la infección, y fue casi completamente indetectable a las 12 h posteriores a la infección (Fig.2). Para determinar si la pro-caspasa 3 agotada había sido procesada proteolíticamente de un zimógeno de cadena única a su enzima activa de dos cadenas, se incubaron lisados de células HeLa con sustratos fluorescentes de caspasa 3 como se describió anteriormente (23). Brevemente, los lisados celulares se incubaron con tampón de reacción (20 mm Tris , 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glicerol) que contenía 100 µM de sustrato de caspasa 3 acetil-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-metilcumarina (Ac-DEVD-AMC) (Calbiochem, Cambridge, Mass.) o Z-Asp-Glu-Val–Asp-7-amino-4-trifluorometilcumarina (Z-DEVD-AFC) (Enzyme Systems Products, Livermore, Calif.). La mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 2 h, y la excitación por fluorescencia de AMC o AFC a 380 o 400 nm, respectivamente, se midió a 460 o 505 nm, respectivamente, con un citofluorómetro CytoFluor 2350 (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Canadá). Con este enfoque, la actividad de la caspasa 3 fue evidente a las 5 h después de la infección. El aumento de la actividad de la caspasa 3 de 7 a 10 h después de la infección, cuando se alcanzó el nivel máximo de activación, se mantuvo hasta 12 h después de la infección (Fig. 2). Este ensayo de proteasa demostró que la caspasa 3 estaba en forma activa en las células infectadas y que era capaz de procesar proteolíticamente otras caspasas y sustratos.

Caspasa 3 escinde sustratos específicos en residuos de ácido aspártico (42). PARP, una proteína nuclear involucrada en la reparación del ADN (13, 69), ha demostrado ser un sustrato para la caspasa 3 activada, así como para otras caspasas (35). En las células apoptóticas, el PARP se escinde de una proteína de 116 kDa, produciendo fragmentos de 85 y 25 kDa, determinados con anticuerpos para los terminales amino y carboxilo de la proteína, respectivamente. En células HeLa infectadas por CVB3, la degradación de PARP, con la aparición de un fragmento de 85 kDa, fue detectable a las 9 h después de la infección, con una mayor reducción de los niveles del péptido de 116 kDa a las 10 y 12 h después de la infección, según lo determinado por el análisis inmunoblot con anti-PARP monoclonal de ratón (1:2.000; Biomol) (Fig. 3).

La DFF es una proteína citosólica que puede ser escindida por la caspasa 3 (37). Una vez escindida, esta proteína libera una endonucleasa que migra al núcleo, donde puede escindirse el ADN en sitios internucleosómicos, lo que resulta en fragmentación del ADN (16). Se ha demostrado previamente que la degradación del ADN internucleosómico es una característica celular de la infección por picornavirus (32). Según lo determinado mediante el uso de anti-DFF policlonal de conejo (proporcionado generosamente por Xiaodong Wang, Facultad de Medicina del Suroeste de la Universidad de Texas, Dallas), la DFF se escinde de una proteína de 45 kDa, produciendo un fragmento de 30 kDa que comienza a las 9 h después de la infección, con procesamiento continuo y pérdida de la proteína de 45 kDa entre 10 y 12 h después de la infección (Fig. 3).

Para determinar si las caspasas producen directamente el EPC característico que se produce después de la infección por picornavirus o se activan después de las alteraciones morfológicas, las células se trataron con el inhibidor general de la caspasa benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona (ZVAD.fmk). Solución madre (100 mm en sulfóxido de dimetilo) de ZVAD.la fmk (Bachem) se diluyó en MEM completo a concentraciones que oscilaban entre 0 y 200 µM, y las diluciones se incubaron con células durante 30 minutos antes de la infección o el tratamiento con luz. Después de la infección por CVB3, las células se lavaron con PBS y MEM completo que contenía 10% de FBS y ZVAD fresco.luego se sustituyó fmk (0 a 200 µM). Se ha demostrado que este péptido inhibe la inducción de alteraciones morfológicas por múltiples estímulos apoptóticos (46, 54). ZVAD.fmk a concentraciones de 50, 100 y 200 µM bloqueó la actividad de la caspasa y la escisión de PARP y DFF en células HELA tratadas con BPD-MA y con luz (control positivo para la apoptosis) (Fig. 4). En células HeLa infectadas por CVB3, el inhibidor evitó parcialmente la escisión de PARP y DFF a concentraciones de 50 y 100 µM (Fig. 4). A la concentración más alta del inhibidor (200 µM), no hubo evidencia de fragmentos de escisión de PARP o DFF en células tratadas con CVB3 a las 10 h después de la infección. La escisión de caspasa de proteínas estructurales como actina, gelsolina, lámina B y cinasa de adhesión focal es responsable de las alteraciones morfológicas observadas tras la inducción de apoptosis (42, 45). A las 2 h después de la fotoactivación de BPD-MA, las células HeLa se condensaron, tuvieron una extensa formación de burbujas en la membrana y se liberaron de la monocapa (Fig.5). A concentraciones crecientes de ZVAD.fmk, este fenotipo apoptótico no era aparente, con las células manteniendo una morfología similar a la de las células control (Fig. 5). Las células HeLa infectadas con CVB3 se condensaron y se liberaron de la monocapa, pero no presentaron sangrado de membrana a las 10 h después de la infección (Fig. 5). Bloqueo de la actividad de la caspasa por ZVAD.fmk a concentraciones de hasta 200 µM no alteró el fenotipo citopático, aunque se inhibió la escisión de sustratos (DFF y PARP).

Una característica clásica de los virus de la familia Picornaviridae es el celular CPE después de la infección. Desde el descubrimiento de una técnica de cultivo celular extraneural para la multiplicación de poliovirus (17), se han observado cambios degenerativos en la morfología celular. Descrito por primera vez por Robbins et al. (48) en 1950, estos cambios citopáticos incluyen contracción nuclear, condensación de la cromatina, redondeo celular y liberación de la monocapa, con progresión eventual a citoplasma acidófilo, picnosis nuclear y fragmentación de la cromatina nuclear (cariorrexis) (47).

La comprensión reciente de los mecanismos de muerte celular sienta las bases para el examen de las proteínas de muerte celular huésped y su posible papel en la EPC de la infección por CVB3. Muchos virus inhiben o activan la muerte celular, estrategias que transmiten aspectos distintivos de la lesión celular, las respuestas inflamatorias o la persistencia viral. Como se señaló anteriormente, estudios previos sobre picornavirus han revelado las características morfológicas de la muerte celular apoptótica, incluida la contracción celular, la fragmentación del ADN y la condensación nuclear (21, 32, 47).

Caspasa 3, una proteasa cisteína con homología a la proteína Caenorhabditis elegans Ced-3 (77), se considera una de las proteínas clave involucradas en la etapa de ejecución de la muerte celular. La apoptosis inducida por múltiples estímulos, incluidos el Saf, el TNF, el etopósido, la estaurosporina, la terapia fotodinámica, la radiación ionizante y la retirada del factor de crecimiento, implica el procesamiento de la pro-caspasa 3 y la activación posterior(15, 23, 30, 33, 51). A partir de las 7 a 8 h de la postinfección con CVB3, la pro-caspasa 3 se agota, y los ensayos de activación de caspasa han demostrado que esta proteína se escinde en su forma activa. Varias proteínas pueden activar la caspasa 3, incluyendo la caspasa 8 (a través de la señalización a través de los receptores TNF o Fas) (55), la granzima B de los linfocitos citotóxicos (62) y la caspasa 9 (a través de la liberación del citocromo c mitocondrial y el ensamblaje de los factores de activación de la proteasa apoptótica) (36). Una vez activada, la caspasa 3 puede degradar sustratos específicos, lo que a su vez resulta en alteraciones estructurales y pérdida de la regulación homeostática de los procesos celulares. Se ha demostrado que numerosas proteínas son escindidas por caspasas activadas. De acuerdo con la activación de caspasa 3, tanto PARP como DFF se escinden después de la infección por CVB3. La activación de la caspasa y la fragmentación del ADN están directamente vinculadas a través de la escisión de la DFF (37). La DFF es un factor citosólico humano que consta de dos subunidades de 45 y 40 kDa, la mayor de las cuales se degrada en polipéptidos más pequeños por la caspasa 3. En estudios recientes de Enari et al. (16) utilizando células de linfoma murino, se aisló una endonucleasa, DNasa activada por caspasa (CAD). El equivalente murino de la proteína DFF se aisló y se denominó inhibidor de la EAC (50). La escisión de caspasa 3 del inhibidor de CAD (DFF) permite la translocación nuclear CAD y la degradación del ADN. La DFF se escinde a partir de las 9 h posteriores a la infección, lo que resulta en un fragmento de 30 kDa (Fig. 3) que se puede procesar en un fragmento de 11 kDa (37). El PARP se encuentra en el núcleo y participa en la reparación del ADN. La escisión de PARP comienza a las 9 h después de la infección, lo que sugiere que una vez que las caspasas se activan en el citosol, pueden acceder a sustratos localizados en el núcleo.

Cabe destacar la inhibición de la caspasa con el inhibidor general de la caspasa ZVAD.la fmk no previno el EPC inducido por CVB3 después de la infección. Entre las 6 y las 7 h de postinfección, el EPC se hizo evidente por microscopía de contraste en nuestro modelo de infección CVB3. El tiempo entre la infección y la aparición del EPC, observado por microscopía de contraste, fue consistente en el ZVAD.concentraciones de fmk de 50 a 200 µM. Además de no afectar el tiempo hasta el EPC, ZVAD.el tratamiento con fmk dio lugar a células con un aspecto morfológico similar al de las células infectadas no tratadas (Fig. 5). Utilizamos el tratamiento con BPD-MA y luz como método alternativo de inducción de apoptosis en células HeLa (22, 23). Inhibición de la activación de la caspasa con el inhibidor ZVAD.la fmk impidió el fenotipo apoptótico (Fig. 5). A partir de estos resultados, concluimos que la actividad de la caspasa y la escisión de los sustratos no tienen en cuenta el DPEC característico asociado a la infección por picornavirus, sino que se activan después de los cambios morfológicos.

El punto de intersección del ciclo replicativo viral y la activación de la vía de muerte de la célula huésped aún no se ha determinado. La infección por picornavirus pronto resulta en la inhibición del ARN celular y la síntesis de proteínas (19, 74). Los primeros estudios de las relaciones entre las alteraciones metabólicas inducidas por picornavirus y el EPC inducido por virus indicaron que la inhibición de la síntesis de proteínas y ARN no estaba directamente relacionada con los cambios morfológicos celulares (4). Los inhibidores de la síntesis de proteínas y ARN retrasaron la muerte celular, pero las células mostraron menos cambios morfológicos que las células infectadas por picornavirus (5). La inhibición de la síntesis de proteínas y ARN con cualquiera de los múltiples agentes, como la actinomicina D, la puromicina y la toxina diftérica, produce apoptosis (39). Los primeros estudios realizados en sistemas de infección por poliovirus mostraron que la puromicina, un inhibidor de la traducción de proteínas virales y hospederas, retrasa la aparición de cambios citopáticos, lo que sugiere que ciertas proteínas virales pueden ser directamente citotóxicas (4). El aumento del MOI conduce a un inicio más rápido de ECP (observaciones no publicadas), aunque casi toda la traducción de proteínas del huésped se interrumpe en 3 h a un MOI relativamente bajo (25) como el utilizado en este estudio (MOI = 5). Recientemente se ha demostrado que la proteína 2B codificada por el virus coxsackievirus y el poliovirus se asocia con fracciones de membrana celular, incluyendo el plasmalema y el retículo endoplásmico, e interrumpe el movimiento iónico, incluyendo el movimiento de Ca2+ al citosol (1, 67). La afluencia de Ca2 + ocurre en la apoptosis (7, 44), pero no está claro si la afluencia ocurre antes o después de la activación de la caspasa. Al examinar los requisitos iónicos de las caspasas, se ha determinado que la concentración de iones de calcio tiene poco efecto sobre la actividad de la caspasa (56). Un influjo temprano de calcio después de la infección por virus coxsackie podría ser el resultado de la influencia de la proteína 2B en la permeabilidad de la membrana, y el gran influjo tardío de calcio observado (>6 h postinfección) (67) podría ser un efecto descendente de la activación de la caspasa.

Durante las primeras fases de la infección, sería ventajoso para el virus inhibir la muerte de la célula huésped, permitiendo así la producción máxima de progenie viral. En las últimas etapas del ciclo de vida viral, también sería beneficioso para el virus inducir apoptosis en lugar de necrosis. Tal mecanismo de muerte es un medio potencial de evasión del sistema inmune del huésped por parte del virus durante su liberación al tejido circundante. La apoptosis se caracteriza por la rápida fagocitosis de las células afectadas sin la liberación de citocinas proinflamatorias (53).

Se ha demostrado que los virus interactúan en varios niveles de la vía apoptótica. Varios gammaherpesvirus (incluido el herpesvirus humano 8 asociado al sarcoma de Kaposi), así como el virus del molusco contagioso tumorígeno, contienen proteínas inhibidoras de FLICE que interactúan con la proteína adaptadora Fas FADD y compiten para inhibir el reclutamiento de la caspasa 8 y su posterior activación (61). La expresión del virus de la viruela vacuna serpina CrmA bloquea la activación mediada por la caspasa 8 de las caspasas posteriores, como la caspasa 1 y la caspasa 3 (55). Las proteínas IAP (para inhibidores de la apoptosis) constituyen una familia de proteínas, expresadas por baculovirus, que bloquean la apoptosis inducida por infección viral o por caspasa 1 (78). Además, se han descubierto varios homólogos virales de la familia de proteínas Bcl-2(2, 8, 20, 70). El adenovirus (9, 20, 57), el virus de la peste porcina africana (41) y el virus de Epstein-Barr (26, 41, 59) codifican proteínas (E1B-19K, LMWS-HL y BHRF1, respectivamente) que exhiben homología de secuencia a los genes pro supervivencia de la familia Bcl-2.

La identificación de proteínas virales que inducen directamente la apoptosis no está tan ampliamente documentada como la de proteínas virales que inhiben la muerte celular. Los lentivirus virus de inmunodeficiencia humana y virus de leucemia de células T humanas tipo 1 codifican los reguladores de transcripción Tat e Tax, que han demostrado aumentar la expresión del ligando Fas mientras disminuyen la expresión de los miembros de la familia Bcl-2 (79, 80). Los productos de los genes E1A, E3 y E4 codificados por adenovirus humanos causan muerte celular tras su expresión en cultivos celulares. Los genes que inducen la muerte de adenovirus se expresan al final del ciclo de infección y, en última instancia, abruman a los genes que inhiben la muerte codificados por virus (38).

Nuestros datos demuestran que la activación de la caspasa 3 sigue, en lugar de preceder, a los cambios morfológicos degenerativos inducidos por CVB3 en células HeLa infectadas. Las caspasas activadas procesan sustratos específicos, incluidos PARP y DFF. Sin embargo, la inhibición de la actividad de la caspasa no elimina la apariencia morfológica (EPC) de las células infectadas por el virus, según lo determinado por microscopía de contraste. El procesamiento de la caspasa y la escisión de los sustratos pueden ser importantes en la alteración final de los procesos homeostáticos normales en las células infectadas y pueden facilitar el aclaramiento final de las células infectadas por el virus. Las proteasas virales 2A, 3C y 3CD pueden escindir proteínas estructurales específicas, lo que resulta en alteraciones morfológicas consistentes con el EPC, de una manera análoga a la acción de las caspasas, que escinden sustratos separados para lograr un fenotipo apoptótico distinto.

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