Zusammenfassung

Für die Isolierung von Candida in der Mundhöhle stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Solche Methoden spielen eine wichtige Rolle bei der Diagnose und Behandlung von oraler Candidose. Die wachsende Bedeutung von Candida hängt zum Teil mit der Entstehung einer HIV-Infektion und der breiteren Anwendung einer immunsuppressiven Chemotherapie zusammen. Zusammen mit den Candida albicans hat es eine größere Anerkennung der Bedeutung der Nonalbicans Candida-Arten bei der oralen Candidose gegeben. Die Identifizierung infizierender Candida-Stämme ist wichtig, da sich Isolate von Candida-Arten sowohl in ihrer Fähigkeit, Infektionen zu verursachen, als auch in ihrer Anfälligkeit für Antimykotika stark unterscheiden. Somit bietet diese Übersicht einen Überblick über die zuverlässigen Methoden der Candida-Isolierung und Identifizierung von Isolaten aus der Mundhöhle.

1. Einleitung

Der Begriff Candida stammt vom lateinischen Wort candid ab und bedeutet weiß. Die Sporen von Candida sind eine kommensale, harmlose Form eines dimorphen Pilzes, der zu invasiven und pathogenen Pseudohyphaen wird, wenn das Gleichgewicht der Flora gestört oder der Wirt geschwächt wird .

Die Translation dieses endogenen Kommensals zum krankheitsverursachenden Parasiten kann mit anderen Faktoren als den pathogenen Eigenschaften des Organismus selbst in Verbindung gebracht werden, was im Vergleich zu den meisten anderen Infektionskrankheiten, bei denen die Virulenz der Organismen als Schlüsselfaktor für die Pathogenese angesehen wird, ziemlich einzigartig ist. Daher sind Candida-Arten streng opportunistisch. Es konnte festgestellt werden, dass weder die oberflächlichen noch die systemischen Formen von Candida-Infektionen ohne zugrunde liegende Pathologie eingeleitet werden konnten .

Es gibt viele Arten von Candida (Tabelle 1), aber die häufigste, die sowohl im kommensalen Zustand als auch bei oraler Candidose aus der Mundhöhle gewonnen wird, ist C. albicans. Es wird geschätzt, dass diese Spezies über 80% aller oralen Hefeisolate ausmacht.

In den letzten Jahren hat das Interesse an Infektionen durch den opportunistischen Erreger Candida zugenommen. Die wachsende Bedeutung von Candida hängt zum Teil mit der Entstehung einer HIV-Infektion und der breiteren Anwendung einer immunsuppressiven Chemotherapie zusammen . Die Identifizierung infizierender Candida-Stämme ist wichtig, da sich Isolate von Candida-Arten sowohl in ihrer Fähigkeit, Infektionen zu verursachen, als auch in ihrer Anfälligkeit für Antimykotika stark unterscheiden .

Zusammen mit C. albicans wurde die Bedeutung der Nicht-Albicans-Candida-Spezies bei menschlichen Krankheiten stärker anerkannt. C. glabrata und C. krusei sind Arten, die aufgrund ihrer erhöhten Resistenz gegen bestimmte Antimykotika Aufmerksamkeit erhalten haben. C. dubliniensis ist eine kürzlich identifizierte pathogene Spezies, die erstmals 1995 beschrieben wurde, als sie mit C. albicans aus Fällen oraler Candidose bei HIV-infizierten Personen koisoliert wurde .

Diese Übersicht bietet einen Überblick über die zuverlässigen Methoden der Candida-Isolierung und Identifizierung von Isolaten aus der Mundhöhle.

2. Pathogene Eigenschaften von Candida

Der Übergang von Candida von einem harmlosen kommensalen zu einem pathogenen Organismus ist komplex und hängt mit subtilen Umweltveränderungen zusammen, die zur Expression einer Reihe von Virulenzfaktoren führen (Tabelle 2). Es ist die kombinierte Wirkung von Wirt- und Candida-Faktoren, die letztendlich zur Entwicklung der oralen Candidose beitragen .

Unabhängig von der Art der Candidose ist die Fähigkeit von Candida-Arten, auf Schleimhautoberflächen gesunder Individuen zu persistieren, ein wichtiger Faktor, der zu ihrer Virulenz beiträgt. Dies ist besonders wichtig in der Mundhöhle, wo der Organismus der mechanischen Waschwirkung eines relativ konstanten Speichelflusses in Richtung Speiseröhre widerstehen muss .

Es wird kein einziger vorherrschender Virulenzfaktor für Candida erkannt, obwohl es eine Reihe von Faktoren gibt, die an der Förderung des Infektionsprozesses beteiligt sind. Dazu gehören Attribute, die an der Adhäsion von Candida an oralen Oberflächen beteiligt sind (z. B. relative Hydrophobie der Zelloberfläche und das Vorhandensein spezifischer Adhäsinmoleküle), die Fähigkeit, Immunabwehrmechanismen des Wirts zu widerstehen (z. B. hochfrequentes phänotypisches Schalten und morphologischer Übergang) und die Freisetzung von hydrolytischen Enzymen (z., sezernierte Aspartylproteinasen und Phospholipasen), die eine Schädigung der Wirtszellen induzieren können .

3. Orale Candidose

Samaranayake schlug eine Klassifikation vor, bei der die oralen Candidose-Läsionen in zwei Hauptgruppen unterteilt wurden: Gruppe I oder primäre orale Candidosen, die auf Läsionen beschränkt sind, die in der Mundhöhle lokalisiert sind, ohne dass Haut oder andere Schleimhäute betroffen sind; Gruppe II oder sekundäre orale Candidosen, bei denen die Läsionen sowohl an oralen als auch an extraoralen Stellen wie der Haut vorhanden sind (Tabelle 3). Läsionen der Gruppe I bestehen aus der klassischen Triade — pseudomembranöse, erythematöse und hyperplastische Varianten — und einige haben eine weitere Unterteilung der letzteren in plaqueartige und knotige Typen vorgeschlagen .

4. Diagnose einer oralen Candidose

Die Diagnose einer oralen Candidose kann häufig anhand der Art der klinischen Merkmale gestellt werden, obwohl nach Möglichkeit mikrobiologische Proben entnommen werden sollten, um möglicherweise vorhandene Candida zu identifizieren und zu quantifizieren und Isolate für antimykotische Empfindlichkeitstests bereitzustellen.

5. Methoden der Isolierung

Techniken, die für die Isolierung von Candida in der Mundhöhle zur Verfügung stehen, umfassen die Verwendung eines Abstrichs, eines einfachen Tupfers , einer Abdruckkultur , der Sammlung von ganzem Speichel , der konzentrierten Mundspülung und der Schleimhautbiopsie. Jede Methode hat besondere Vor- und Nachteile, und die Wahl der Probenahmetechnik richtet sich in erster Linie nach der Art der zu untersuchenden Läsion (Tabelle 4). Wo eine zugängliche und definierte Läsion offensichtlich ist, Ein direkter Probenahmeansatz wie die Verwendung eines Tupfers oder eines Abdrucks wird häufig bevorzugt, da dies Informationen über die an der Läsion vorhandenen Organismen liefert. In Fällen, in denen es keine offensichtlichen Läsionen gibt oder in Fällen, in denen die Läsion schwer zugänglich ist, ist eine indirekte Probe, die auf kultivierenden Speichelproben oder einer Mundspülung basiert, akzeptabler.

Die quantitative Abschätzung der Pilzbelastung kann unter Verwendung von Abdrücken, konzentrierter Mundspülung und Kultivierung der Mundspülung erfolgen, um zwischen kommensaler Beförderung und pathogener Existenz von oraler Candida zu unterscheiden, wobei höhere Belastungen als wahrscheinlich angesehen werden letzteres .

6. Direkte Mikroskopie

Morphologische Merkmale von Candida-Arten (Tabelle 5) müssen zur Identifizierung untersucht werden. Ein Abstrich ist bei der Unterscheidung zwischen Hefe- und Hyphen-Formen von Wert, aber weniger empfindlich als kulturelle Methoden . Kaliumhydroxid (KOH) Die Präparation der Probe zeigt nicht pigmentierte septierte Hyphen mit charakteristischer dichotomer Verzweigung (in einem Winkel von ungefähr 45 °) . Bei der KOH-Calcofluor-Fluoreszenzfärbemethode fluoreszieren Pilzmerkmale wie Hyphen, Hefezellen und andere Pilzelemente.

Ein Abstrich von der Läsionsstelle wird auf Objektträgern fixiert und dann entweder mit der Gram-Färbung oder mit der Periodic Acid Schiff (PAS) -Technik gefärbt. Mit diesen Methoden erscheinen Candida-Hyphen und Hefen entweder dunkelblau (Gram-Färbung) oder rot / violett (PAS) .

Bei chronischer hyperplastischer Candidose ist eine Biopsie der Läsion erforderlich, um anschließend eindringende Candida durch histologische Färbung entweder mit den PAS- oder Gomoris Methenamin-Silberflecken nachzuweisen. Die Demonstration von Pilzelementen in Geweben erfolgt, wenn sie durch diese Flecken tief gefärbt werden. Das Vorhandensein von Blastosporen und Hyphen oder Pseudohyphen kann es dem Histopathologen ermöglichen, den Pilz als Candida-Art zu identifizieren und bei Vorliegen anderer histopathologischer Merkmale eine chronische hyperplastische Candidose zu diagnostizieren .

7. Laborkultur

7.1. Tupfer

Ein Tupfer einer Läsionsstelle ist eine relativ einfache Methode zum Nachweis von Wachstum und eine semiquantitative Schätzung von Candida kann erhalten werden. Der Probenahmeansatz besteht darin, ein steriles Wattestäbchen vorsichtig über das Läsionsgewebe zu reiben und anschließend ein primäres Isolationsmedium wie Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) zu inokulieren .

7.2. Konzentrierte Mundspülung

Bei der Mundspültechnik hält der Patient 10 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,01 M, pH 7,2) 1 Minute lang im Mund. Anschließend wird die Lösung durch Zentrifugation aufkonzentriert (10-fach) und ein bekanntes Volumen, üblicherweise 50 µL, mit einem Spiralplattiersystem auf ein Agarmedium inokuliert. Nach 24-48 Stunden Inkubation bei 37 ° C wird das Wachstum durch Aufzählung der Kolonien beurteilt und als Candida−koloniebildende Einheiten pro ml (kbe mL-1) Spülung ausgedrückt.

7.3. Abdruckkultur

Bei der Abdruckmethode wird ein steriles Schaumkissen bekannter Größe (typischerweise 2,5 cm2) verwendet, das zuvor unmittelbar vor der Verwendung in ein geeignetes flüssiges Medium wie Sabouraud-Brühe getaucht wurde. Das Pad wird dann 30 Sekunden lang auf die Zielstelle (Schleimhaut oder intraorale Prothese) gelegt und dann zur Kultur in einen Agar überführt .

8. Kulturmedien

Das am häufigsten verwendete primäre Isolationsmedium für Candida ist SDA, das zwar das Wachstum von Candida ermöglicht, aber aufgrund seines niedrigen pH-Wertes das Wachstum vieler Arten von oralen Bakterien unterdrückt. Typischerweise wird SDA aerob bei 37 °C für 24-48 Stunden inkubiert. Candida entwickelt sich als Creme, glatt, pastös konvexe Kolonien auf SDA und Differenzierung zwischen den Arten ist selten möglich . Es wird geschätzt, dass mehr als eine Candida-Art in ungefähr 10% der oralen Proben vorkommt, und in den letzten Jahren ist die Fähigkeit, Nicht-Albicans-Arten nachzuweisen, immer wichtiger geworden .

In den letzten Jahren wurden andere Differentialmedien entwickelt, die die Identifizierung bestimmter Candida-Arten anhand des Aussehens und der Farbe der Kolonie nach der Primärkultur ermöglichen. Der Vorteil solcher Medien besteht darin, dass das Vorhandensein mehrerer Candida-Arten in einer einzigen Infektion bestimmt werden kann, was für die Auswahl nachfolgender Behandlungsoptionen wichtig sein kann . Beispiele hierfür sind Pagano-Levin-Agar oder kommerziell erhältliche chromogene Agare, nämlich CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate oder Candichrom albicans .Pagano-Levin-Agar unterscheidet zwischen Candida-Arten basierend auf der Reduktion von Triphenyltetrazoliumchlorid. Das Medium produziert blass gefärbte Kolonien von C. albicans, während Kolonien anderer Candida-Arten unterschiedliche rosa Färbungen aufweisen. Pagano-Levin-Agar hat eine ähnliche Empfindlichkeit wie SDA, ist jedoch für den Nachweis von mehr als einer Spezies in der Probe überlegen , CHROMagar Candida identifiziert C. albicans, C. tropicalis und C. krusei basierend auf Koloniefarbe und Aussehen , während sich Albicans ID und Fluroplate als vorteilhaft für die mutmaßliche Identifizierung von C. albicans erwiesen haben . Es wird berichtet, dass die Spezifität der Identifizierung 95% für CHROMagar Candida und 98,6% für Albicans ID- und Fluroplate-Agare beträgt . Die Verwendung von CHROMagar Candida als Primärisolationsagar wurde als Ansatz angeführt, der eine Unterscheidung des neu beschriebenen C. dubliniensis von C. albicans ermöglicht. Auf CHROMagar Candida entwickelt sich C. dubliniensis Berichten zufolge als dunklere grüne Kolonien im Vergleich zu denen von C. albicans . Die Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten unter Verwendung von CHROMagar scheint jedoch nach Subkultur und Lagerung von Isolaten abzunehmen. Das Versagen von C. dubliniensis, auf Agarmedien bei der erhöhten Inkubationstemperatur von 45 ° C zu wachsen, wurde kürzlich als alternativer Test zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten vorgeschlagen .

9. Identifizierung von Candida-Arten

Die Identifizierung von Hefen auf der Basis von Primärkulturmedien kann durch eine Vielzahl von ergänzenden Tests bestätigt werden, die traditionell auf morphologischen (Tabelle 5) und physiologischen Eigenschaften der Isolate basieren.

9.1. Morphologische Kriterien

Der Keimröhrchentest ist die Standard-Labormethode zur Identifizierung von C. albicans. Der Test beinhaltet die Induktion von Hyphen-Auswüchsen (Keimröhrchen) bei Subkultur in Pferdeserum bei 37 ° C für 2-4 Stunden. Etwa 95% der C. albicans-Isolate produzieren Keimröhren, eine Eigenschaft, die auch von C. stellatoidea und C. dubliniensis geteilt wird.C. albicans und C. dubliniensis können auch von anderen Arten identifiziert werden, basierend auf ihrer Fähigkeit, morphologische Merkmale zu produzieren, die als Chlamydosporen bekannt sind. Chlamydosporen sind refraktile, sphärische Strukturen, die an den Enden von Hyphen nach der Kultur von Isolaten auf einem nährstoffarmen Medium wie Maismehlagar erzeugt werden. Isolate werden in einem Schraffurmuster auf den Agar inokuliert und mit einem sterilen Deckglas überzogen. Agare werden 24-48 Stunden bei 37 ° C inkubiert und dann mikroskopisch auf Chlamydosporen untersucht.

9.2. Physiologische Kriterien / Biochemische Identifizierung

Die biochemische Identifizierung von Candida-Arten basiert weitgehend auf der Kohlenhydratverwertung. Traditionelle Tests hätten die Kultivierung von Testisolaten auf einem Basalagar ohne Kohlenstoffquelle beinhaltet. Kohlenhydratlösungen würden dann in Vertiefungen des ausgesäten Agars oder auf Filterpapierscheiben auf der Agaroberfläche platziert. Das Wachstum in der Nähe der Kohlenstoffquelle würde eine Nutzung anzeigen. Kommerzielle Systeme basieren auf dem gleichen Prinzip, jedoch sind die Testsubstanzen in Kunststoffschächten untergebracht, die sich auf einem Teststreifen befinden. Das Wachstum in jeder Vertiefung wird durch Trübungsänderungen oder Farbänderungen in bestimmten Kit-Systemen abgelesen. Numerische Codes, die aus den Testergebnissen erhalten werden, werden verwendet, um den Testorganismus basierend auf einem Datenbankvergleich zu identifizieren .

9.3. Serologie

Serologische Tests werden häufig verwendet, um die klinische Bedeutung von Candida-Spezies-Isolaten festzustellen. Steigende Titer von lgG-Antikörpern gegen C. albicans können eine invasive Candidiasis bei immunkompetenten Personen widerspiegeln. Der Nachweis von IgA- und IgM-Antikörpern ist wichtig, um eine akute Infektion zu identifizieren. Immunsupprimierte Personen zeigen häufig eine Variabilität in der Antikörperproduktion, und in einem solchen Fall wird die Verwendung eines Antigennachweistests empfohlen. Tests wie ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) und RIA (Radio Immuno Assay) zum Nachweis von Candida-Antigen, entweder Zellwand-Mannan oder zytoplasmatischen Bestandteilen, sind jetzt in Industrieländern verfügbar .

Die serologische Diagnose ist oft verzögert und den Tests fehlt es immer noch an Sensitivität und Spezifität. Darüber hinaus ist die Antikörperproduktion bei immungeschwächten Patienten variabel, was die Diagnose erschwert . Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass Pilzantigene und -metaboliten häufig schnell aus dem Kreislauf entfernt werden und das Vorhandensein von Antikörpern nicht immer eine Candida-Infektion impliziert, insbesondere bei Patienten mit schweren Grunderkrankungen oder bei Patienten, die Immunsuppressiva einnehmen .

Serologische Tests sind normalerweise kein diagnostisches Instrument für orale Candidose. Solche Tests können jedoch ein prognostisches Instrument bei Patienten mit schwerer oraler Candidose sein, die schlecht auf eine antimykotische Therapie ansprechen .

9.4. Molekularbasierte Identifizierungsmethoden

Die Identifizierung durch Analyse der genetischen Variabilität ist ein stabilerer Ansatz als die Verwendung von Methoden, die auf phänotypischen Kriterien basieren. Zur Identifizierung von Candida anhand genetischer Variation werden Analysen von elektrophoretischen Karyotypunterschieden und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) mittels Gelelektrophorese oder DNA-DNA-Hybridisierung durchgeführt .

Spezies-spezifische PCR-Ansätze wurden auch für die Identifizierung von Candida-Arten verwendet. Es wurden mehrere Zielgene für die Diskriminierung von Candida-Arten berichtet, obwohl die am häufigsten amplifizierten die Sequenzen des ribosomalen RNA-Operons sind. Die Identifizierung kann auf der Grundlage von PCR-Produktgrößen erhalten werden, die nach Gelelektrophoreseauflösung erhalten wurden, oder PCR-Produktsequenzvariation bestimmt entweder durch direkte Sequenzierung oder durch Verwendung von Restriktionsfragmentanalyse nach Schneiden von PCR-Sequenzen mit Restriktionsendonukleasen .

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit Peptid-Nukleinsäure-Methode (PNA Fish) ist eine neue Nachweistechnik, die auf hochkonservierte Spezies-spezifische Sequenzen in der reichlich vorhandenen rRNA lebender C. albicans abzielt. Einzelne Zellen können direkt nachgewiesen werden, ohne dass eine Amplifikation erforderlich ist . Diese Technik erreicht eine Sensitivität von 98,7-100% bei einer Spezifität von 100%, was die Unterscheidung von C. albicans von dem phänotypisch ähnlichen C. dubliniensis ermöglicht . Molekulare Technologie kann auch verwendet werden, um Stämme von Candida-Arten zu identifizieren, obwohl die Verwendung von Techniken wie gepulste Feldgelelektrophorese (PFGE), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Analyse und Repeat Sequence Amplification PCR (REP) weitgehend für epidemiologische Untersuchungen in der Forschung der oralen Candidose vorbehalten sind .

10. Schlussfolgerung

In den letzten Jahren wurde ein größerer Schwerpunkt auf die zuverlässige Identifizierung von Candida-Arten aus menschlichen klinischen Proben gelegt. Eine schematische Darstellung zur Isolierung und Identifizierung von Candida ist in Abbildung 1 dargestellt. Da Candida die residente Mikroflora ist, sind geeignete Isolationsmethoden erforderlich, um das Vorhandensein im Mund zusammen mit ihrer Anzahl festzustellen. Es ist auch wichtig, die infizierenden Stämme von Candida zu identifizieren, da sich Isolate von Candida-Arten sowohl in ihrer Fähigkeit, Infektionen zu verursachen, als auch in ihrer Anfälligkeit für Antimykotika stark unterscheiden. Es stehen verschiedene phänotypische Techniken zur Identifizierung isolierter Candida zur Verfügung, einschließlich morphologischer Kulturtests, Differentialagarmedien und biochemischer Assimilationstests. Ergänzt werden diese Methoden durch neuere molekulare Techniken, die weitgehend epidemiologischen Untersuchungen vorbehalten sind.

Abbildung 1

Schematische Darstellung der Isolierung und Identifizierung von Candida-Arten aus der Mundhöhle.