Einführung

Die vollständigen Genomsequenzen verschiedener Organismen, einschließlich Säugetieren, sind seit kurzem als Folge der raschen Fortschritte in der DNA-Sequenzierungstechnologie verfügbar. Insbesondere bei Säugetieren spielt die Analyse von Transkripten jedoch immer noch eine Schlüsselrolle bei der Überbrückung der Lücke zwischen Genom und Proteom. Dies liegt hauptsächlich daran, dass wir derzeit die Strukturen von Transkripten, die von einem bestimmten Gen abgeleitet sind, nicht genau anhand der genomischen Informationen allein vorhersagen können. Als Methode zur Analyse von Transkripten ist der Aufbau der cDNA-Bibliothek daher auch in der Zeit nach der Genomsequenzierung von entscheidender Bedeutung. Obwohl die cDNA-Klonierung von Genen von Interesse durch PCR einen vereinfachten alternativen Weg zur Analyse von Transkriptstrukturen ohne cDNA-Bibliothekskonstruktion bereitgestellt hat, ist der Aufbau einer cDNA-Bibliothek der Ansatz der Wahl, wenn eine große Anzahl von cDNAs aus einer einzigen mRNA-Quelle analysiert werden soll. Bisher wurden große Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren zur Herstellung hochwertiger cDNA-Bibliotheken zu entwickeln (1-4). Im Gegensatz dazu wurde die Frage, wie eine qualitativ hochwertige cDNA-Bibliothek aus einem kleinen Pool von RNAs hergestellt werden kann, nicht so aktiv angegangen. Dies ist jedoch zu einem vorrangigen Ziel geworden, da Forscher häufig an hypothetischen Genen interessiert sind, von denen vorhergesagt wird, dass sie nur in bestimmten Arten von Zellen oder Geweben unter bestimmten Bedingungen exprimiert werden, wie sie in pathologischen Proben beobachtet werden.

Es gibt eine Reihe von Berichten, die die Verwendung kleiner Mengen von Quell-RNA zur Erzeugung amplifizierter cDNA oder cRNA beschreiben, aus denen Targets für die Microarray-Analyse hergestellt werden können (5-15). Ihr endgültiges Ziel ist es, in voller Länge zu erhalten, nicht populationsverzerrte RNA, die sehr repräsentativ für die ursprüngliche mRNA ist. Um dies durchzuführen, verwenden diese Methoden üblicherweise PCR oder In-vitro-Transkription durch T7-RNA-Polymerase, um die ursprüngliche mRNA in Form von cDNA bzw. cRNA zu amplifizieren. Obwohl der Vergleich von Expressionsprofilen einer der effizientesten Ansätze zur Untersuchung von Unterschieden in den physiologischen Zuständen von Zellen oder Geweben ist, kann eine strukturelle Charakterisierung von Transkripten (z. B. Identifizierung alternativer Spleißmuster, Transkriptionsstartstelle und Transkriptionsabbruchstelle) nicht durch eine solche Mikroarray-Analyse durchgeführt werden. Die Sequenzanalyse jedes Transkripts ist in diesen Fällen unvermeidlich.

Wir haben eine Methode entwickelt, die es erlaubt, mit einer kleinen Menge an Start-RNA eine cDNA-Bibliothek zu konstruieren, die für die Genklonierung und umfassende Sequenzierungsanalyse geeignet ist. Das Verfahren markiert die 3′- und 5′-Enden der First-Round-cDNAs mit T7- bzw. SP6-Phagenpromotorsequenzen, um Größen-Bias-Effekte während der Amplifikation zu minimieren. Nach zweimaliger cRNA-Amplifikation wandelten wir die amplifizierten cRNAs in cDNAs um, klonierten diese Produkte in ein Plasmid und bewerteten dann die resultierende cDNA-Bibliothek im Vergleich zu der nach konventioneller Methode konstruierten (4,16,17).

Materialien und Methoden

cRNA-Amplifikation

Die in dieser Studie verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Um das Protokoll zu erstellen, verwendeten wir 1 µg Gesamt-RNA, die aus dem ICR-Mausgehirn (8 Wochen alte männliche Mäuse) hergestellt wurde, als Vorlage. Eine Mischung (10 µL) aus 1 µg Gesamt-RNA und 100 pmol T7-Not-(dT)18 Primer wurde 10 min bei 70°C inkubiert und anschließend auf Eis schnappgekühlt. Doppelsträngige cDNA-Synthese und Adapterligation wurden nach den Protokollen des SUPERSCRIPT® Plasmid Systems (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (4,16,17) mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, für die Erststrang-cDNA-Synthese wurden 4 µL 5 × Erststrangpuffer (Invitrogen), 1 µL 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µL 10 mM dNTPs, 1 µL (40 U) RNaseOUT ™ (Invitrogen) und 1 µL Wasser zu der denaturierten RNA / T7-Not- (dT) 18-Primermischung gegeben und bei 37 ° C für 3 min inkubiert, um Primer zu tempern. Anschließend wurden 2 µL (400 U) HOCHGESTELLTE III RNase H-reverse Transkriptase (Invitrogen) zu der Reaktionsmischung gegeben und die Temperatur auf 50°C eingestellt, um die Erststrang-cDNA-Synthese zu starten. Nach 1 h wurde die Zweitstrang-cDNA-Synthese wie zuvor von Gubler und Hoffman (18) beschrieben durchgeführt; zur Erststrang-cDNA-Mischung wurden 91 µL Wasser, 30 µL 5× Zweitstrangpuffer (Invitrogen), 3 µL 10 mM dNTPs, 1 µL (10 U) Escherichia coli DNA Ligase, 4 µL (40 U) E. coli DNA Polymerase und 1 µL (2 U) E. coli RNase H zugegeben und die Mischung inkubiert bei 16°C für 2 h. Anschließend wurden cDNA-Termini mit 10 U T4 DNA-Polymerase (Invitrogen) bei 16°C für 5 min endpoliert und die Reaktion durch Zugabe von 10 µL 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gestoppt. Die erhaltenen cDNAs wurden durch Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gereinigt, gefolgt von Ethanolfällung wie zuvor beschrieben (17), mit Ausnahme der Verwendung von 1 µg Hefe-tRNA anstelle von Polyadenylsäure als Träger. Die ausgefällte cDNA wurde in 50 µL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA) gelöst, mit 30 µL einer 20%igen (w/v) Polyethylenglykol (PEG) 6000/2,5 M NaCl-Lösung versetzt und anschließend 1 h auf Eis inkubiert (17). Nach der Inkubation wurde das cDNA-Gemisch bei 18.000×g bei 4°C für 15 min zentrifugiert. Das erhaltene cDNA-Pellet wurde zweimal mit 70%igem Ethanol gespült, getrocknet und anschließend in 30 µL Wasser resuspendiert. Die gereinigten cDNAs wurden mit 500 pmol SP6 Adapter (Tabelle 1) unter Verwendung von 5 U T4 DNA Ligase (Invitrogen) in einem 50 µL Reaktionsvolumen bei 16°C über Nacht ligiert. Die adapterligierte Mischung wurde zweifach mit Wasser verdünnt und anschließend cDNAs mittels einer DNAclear™ Säule (Ambion, Austin, TX, USA) gereinigt. Das Eluat (in 16 µL Wasser) wurde als Template für die cRNA-Synthese verwendet. Mit dem MEGAscript® T7 Kit (Ambion) wurden cRNAs bei 37°C über Nacht in einem 40 µL Reaktionsvolumen synthetisiert. Nachdem Template-cDNAs durch 4 U DNase I abgebaut wurden, wurden die synthetisierten cRNAs mit einem RNeasy® Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) gereinigt und mit 100 µL Wasser eluiert. Die Konzentration der cRNA wurde durch ultraviolette (UV) Absorption bestimmt. Für die Zweitrunden-cRNA-Amplifikation wurden 2 µg der synthetisierten cRNA und 100 pmol SP6-UP-Primer (gleich dem in Tabelle 1 gezeigten Oberstrangoligonukleotid des SP6-Adapters) als Template bzw. Primer verwendet. Die Zweitrunden-cDNA-Synthese wurde wie in der ursprünglichen reversen Transkription aus der Quell-RNA durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das SP6-UP-Primer-Annealing bei 50 ° C für 3 min durchgeführt wurde. Nach Aufreinigung der erhaltenen doppelsträngigen cDNA durch eine DNAclear-Säule wurden 0,5 µg der cDNA als Template für die nächste SP6-RNA-Polymerase-unterstützte cRNA-Amplifikation verwendet. Mit dem MEGAscript SP6 Kit (Ambion) wurde die cRNA-Synthese bei 37°C für 6 h durchgeführt. Nach dem Abbau der Template-cDNA mit DNase I wurden die synthetisierten cRNAs wie oben beschrieben gereinigt.

Tabelle 1. Die für den Bibliotheksbau verwendeten Nukleotidsequenzen von Primern und Adaptoren

cDNA-Bibliotheksbau

Zwei Mikrogramm der resultierenden cRNAs wurden einer doppelsträngigen cDNA-Synthese unter Verwendung von 100 pmol attB2-Not-(dT)18 Primer unterzogen (Tabelle 1). Die cDNA-Synthese-, End-Blunting-, Reinigungs- und Adapterligationsschritte wurden wie in den vorherigen cDNA-Synthesen durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der attB1-Adapter (Tabelle 1, 500 pmol) an die doppelsträngigen cDNAs ligiert wurde. Nachdem die attB1-Adapter-ligierten cDNAs durch aufeinanderfolgende Behandlungen von Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol-Extraktion, Ethanolfällung und PEG / NaCl-Fällung in dieser Reihenfolge gereinigt wurden, wurden sie in 50 µL TE gelöst und mit RNase A (bei einer Endkonzentration von 10 µg / ml; Invitrogen) behandelt, um kontaminierte RNA bei 37 ° C für 30 min abzubauen. Das Reaktionsgemisch wurde erneut durch Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol gereinigt, gefolgt von Ethanolfällung und PEG/NaCl-Fällung. Die resultierenden cDNAs wurden in 15 µL TE gelöst und ihre Menge anhand der Fluoreszenzfärbeintensität nach Elektrophorese an Agarosegel abgeschätzt (4). Die attB1-ligierten cDNAs (36 ng) wurden einer in vitro Rekombinationsreaktion (Gateway® System; Invitrogen) mit 250 ng attP-pSP73 Donorvektor wie zuvor beschrieben (4,16,17) unterzogen. Kurz gesagt, die attB1-ligierte cDNA und der attP-pSP73-Donorvektor wurden gemischt und in einem 10-µL-Reaktionsvolumen mit 2 µL 5 × BP Clonase ™ -Reaktionspuffer und 2 µL BP Clonase (beide von Invitrogen) über Nacht bei 25 ° C inkubiert. Das cDNA-Gemisch wurde mit 2 µg Proteinase K (Invitrogen) bei 37°C für 10 min zum Quenchen der Reaktion versetzt und mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von Ethanolfällung mit 2 µg Hefe-tRNA als Träger. Die ausgefällte cDNA wurde in 10 µL Wasser gelöst und 1 µL der Mischung zur Transformation von ElectroMAX™ DH10B™ E. coli Zellen (Invitrogen) verwendet. Nach Titration der resultierenden cDNA-Bibliothek wurden die cDNA-Plasmide aus etwa 1.000.000 Kolonien durch eine alkalische Natriumdodecylsulfat (SDS)-Methode wie zuvor beschrieben (4,19) gewonnen. Die resultierenden cDNA-Klone lagen in Form eines Plasmids vor, das attL-Stellen trug. Da die attB-Stellen tragenden Plasmide in einigen Anwendungen benötigt werden, wurden diese Plasmide wie zuvor beschrieben in solche mit attB-Stellen umgewandelt (16). Diese cDNA-Bibliothek wurde folglich als MB-AL (mouse brain amplified cRNA-derived library) bezeichnet.

Auf die gleiche Weise wie für MB-AL beschrieben, konstruierten wir eine cDNA-Bibliothek aus nicht verstärkter RNA (100 µg Mausgehirn-Gesamt-RNA) und bezeichneten sie als MB-CL (mouse brain conventionally constructed library).

Untersuchung des Size-Bias-Effekts auf amplifizierte cRNAs

Zur Untersuchung des Size-Bias-Effekts auf cRNAs wurden die von T7-RNA-Polymerase transkribierten First-Round-cRNAs und die von SP6-RNA-Polymerase transkribierten Second-Round-cRNAs auf 1,0% Agarosegel (je 1 µg) gefahren und anschließend auf Nylonmembran (Biodyne® B Nylon Membrane; PALL, East Hills, NY, USA) geblottet. Sie wurden mit 32P-markiertem SP6-UP-Primer (Tabelle 1) bzw. Nicht-(dT)18(5′-GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′)-Oligonukleotid hybridisiert. Zehn Picomole jeder Sonde wurden mit ATP markiert (ungefähr 3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Takara, Kyoto Japan). Nach Hybridisierung über Nacht in GMC-Puffer (20) bei 45°C wurden diese Membranen dreimal bei Raumtemperatur ausgiebig in 1× Standardsalzcitrat (SSC)/1%iger SDS-Lösung gewaschen. Die Analyse hybridisierter Signale wurde an einem BAS 2000 Image Analyzer (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)

Auswertung von cDNA-Bibliotheken

Gelelektrophorese durchgeführt. Die Verteilung der cDNA-Insertgrößen wurde durch Elektrophorese von cRNAs untersucht, die durch T7-RNA-Polymerase unter Verwendung von nicht verdauten MB-AL- und MB-CL-Plasmid-cDNAs als Templates synthetisiert wurden. Nach Aufreinigung mit einem RNeasy Mini Kit wurden die cRNAs auf einem formaldehydhaltigen Agarosegel mit Perfect RNA Markern elektrophoresiert (EMD Biosciences, Madison, WI, USA). Nach Anfärbung des Gels mit SYBR® Green II (Invitrogen) wurde die Fluoreszenzfarbintensität mit der Software ImageQuant® (Version 5.0) auf einem FluorImager 595 (Amersham Biosciences) analysiert.

Random Single-pass Sequencing Analyse. 3′-Endsequenzen von cDNA-Klonen wurden durch DNA-Sequenzierung untersucht. Plasmid-DNA von 768 zufällig ausgewählten Klonen wurde mit einem MFX-9600 Magnia® (Toyobo, Osaka, Japan) gereinigt und mit einem RISA 384-Kapillarsequenzer (Shimadzu, Kyoto, Japan) analysiert (16). Nach dem Trimmen der Vektorsequenz mit Sequencher™ Software Version 4.1 (Hitachi Software, Tokyo, Japan) wurden die erhaltenen cDNA-Sequenzen, die länger als 200 Nukleotidreste waren, mit cDNA-Einträgen in der GenBank®-Datenbank und unserer hauseigenen Mausdatenbank geclustert. Die Untersuchung der Integrität der 3′-Enden von cDNA-Klonen wurde durch eine Analyse durchgeführt, ob ein kanonisches Polyadenylierungssignalhexamer (5′-AATAAA-3′) oder seine Einzelbasenvarianten (11 Signalhexamere) innerhalb der 50 Nukleotidreste stromaufwärts des Poly (A) -Schwanzes von cDNAs (21) gefunden wurden.In:cDNA microarray. Microarray-Analysen wurden durchgeführt, um cDNA-Populationen in den MB-AL- und MB-CL-Bibliotheken zu vergleichen. Hausgemachte cDNA-Nylon-Mikroarrays mit 3534 Sonden wurden hergestellt und ein radioisotopischer Nachweis durchgeführt (22). Kurz gesagt, cDNA-Plasmide, die in unserem Institut isoliert wurden und für die bereits vollständige Sequenzen oder Endsequenzen bekannt waren, wurden mit GeneTAC ™ RA1 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, USA) auf Biodyne B-Nylonmembranen getupft und dann gemäß den Anweisungen des Herstellers fixiert. Die Liste der auf diesem Microarray immobilisierten cDNAs ist auf Anfrage bei den Autoren erhältlich. MB-AL- und MB-CL-Ziel-cDNAs wurden unter Verwendung der reversen Transkription aus jeder der 1 µg cRNA-Proben hergestellt, die für die Insertgrößenanalyse wie oben beschrieben verwendet wurden. Diese Targets wurden synthetisiert und in der Reaktionsmischung markiert, die 1 µg jeder cRNA, 100 ng zufälliges Hexamer, 1× Erststrangpuffer, 10 mM DTT, jeweils 800 µM dATP, dTTP und dGTP, 800 nM dCTP, 5 µL dCTP (>2500 Ci/mmol; Amersham Biosciences) und 100 U Hochgestellte II RNase H- reverse Transkriptase bei Raumtemperatur für 10 min und dann bei 42°C für 1 h. Nach alkalischer Lyse und Neutralisation wurden die markierten cDNAs mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN) gereinigt und gezählt. Die Ziel-cDNA wurde mit dem cDNA Nylon Microarray in Gegenwart von 1 µg Polyadenylsäure und 2,5 µg Maus-Cot-1 DNA® (Invitrogen) in 250 µL PerfectHyb™ Puffer (Toyobo) bei 68°C über Nacht hybridisiert. Nach stringentem Waschen bei 68°C mit 2× SSC/1% SDS (zwei Wäschen zu je 15 min) und anschließend mit 0,1× SSC/1% SDS (zwei Wäschen zu je 30 min) wurden die Hybridisierungssignale auf einem FLA-8000 (Fuji Photo Film) detektiert und analysiert. Die cDNA-Spots mit stärkeren Signalen als die der Hintergrundkontrolle wurden selektiert und einer weiteren Analyse unterzogen. Nach Durchführung einer globalen Normalisierung wurden Streudiagramme der Signalintensitäten von cDNA-Spots erhalten, die von MB-AL- und MB-CL-Targets stammen.

RNA-Blot-Hybridisierung. RNA-Blot-Hybridisierung wurde durchgeführt, um Size-Bias-Effekte zu untersuchen. Die MB-AL und MB-CL cRNAs (je 1,5 µg, synthetisiert wie oben beschrieben) wurden auf formaldehydhaltigem Agarosegel elektrophoresiert und auf Biodyne B Nylonmembran übertragen. Die Sonden-cDNAs wurden mittels PCR-Amplifikation hergestellt. Primer wurden basierend auf den in der GenBank-Datenbank oder in unserer hauseigenen Datenbank registrierten Sequenzen entwickelt; vorlagen waren die cDNA-Plasmide, die wir isoliert hatten. Die Sonde des ribosomalen S6-Proteins war 724 bp lang, amplifiziert mit 5′-CGCTCGGCTGTGTCAAGATG-3′ und 5′-GAGGACAGCCTACGTCTCTTGG-3′ Primern, und die Sonde des Hitzeschockproteins (hsp) 70, 940 bp lang, wurde mit 5′-GATGGACAAGGCGCAGATCC-3′ und 5′- CTCGATGGTGGGTCCTGAGC-3′-Primer. Diese Sonden wurden mit dCTP (ca.3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences) unter Verwendung des RadPrime DNA-Markierungssystems (Invitrogen) markiert. Nach Hybridisierung über Nacht in PerfectHyb-Puffer bei 65°C wurden die Membranen nacheinander mit 0,1× SSC/1% SDS bei Raumtemperatur 5 min und 15 min und anschließend 30 min bei 65°C gewaschen. Die Hybridisierungssignale wurden auf einem BAS 2000 Image Analyzer detektiert.

Ergebnisse und Diskussion

Die in dieser Studie entwickelte cDNA-Bibliothekskonstruktionsmethode ist in Abbildung 1 dargestellt (neu eingeführte Schritte sind mit einem Stern markiert). Diese Methode besteht aus zwei Runden des cRNA-Amplifikationsschritts, der Umwandlung von cRNAs in cDNAs und der rekombinativen Klonierung in ein Plasmid. Der Schlüsselschritt in dieser Methode ist die Adapterligation, um cDNA-Enden mit SP6-Promotorsequenz zu markieren. Sobald wir cDNAs in diesem Format erfolgreich synthetisieren können, wird es möglich, die CRNAS der ersten Runde, die die SP6-Promotorsequenz an ihrem 3′-Ende enthalten, spezifisch umzukehren. Die zweitrunden cRNAs werden mit SP6-RNA-Polymerase unter Verwendung der resultierenden doppelsträngigen cDNAs als Templates synthetisiert. Nach den beiden Runden der RNA-Polymerase-unterstützten Amplifikation werden die resultierenden cRNAs dann durch reverse Transkription unter Verwendung des attB2-Not-(dT) 18-Primers in doppelsträngige cDNAs umgewandelt. Die Verwendung von attB2-Not-(dT)18-Primer in der reversen Transkription ermöglicht es uns, nur die cRNAs zu konvertieren, die die Sequenz 5′- (A) 18GCGGCCGC-3′ an ihren 3′-Enden tragen. Da diese Modifikationen nur die Amplifikation und Klonierung von cDNAs ermöglichen sollten, die korrekt markierte Enden haben, erwarten wir, dass diese Methode die Größenverzerrung während der RNA-Polymerase-unterstützten Amplifikation minimiert.

Um die Wirksamkeit der Methode zu testen, konstruierten wir cDNA-Bibliotheken nach einer konventionellen Methode (16) unter Verwendung von nicht verstärkter Gesamt-RNA aus dem Mausgehirn (100 µg) und nach der oben beschriebenen Methode unter Verwendung von 1 µg Gesamt-RNA aus dem Mausgehirn. Tabelle 2 fasst die in jedem Schritt erhaltenen Mengen an cDNA und cRNA zusammen, berechnet als Durchschnitt von drei unabhängigen experimentellen Durchläufen der MB-AL-Konstruktion. Wir erhielten durchschnittlich 6,4 × 107 unabhängige cDNA-Klone als endgültige Ausgabe. Da diese Anzahl von cDNA-Klonen aus insgesamt 36 ng cDNA stammt, die mit dem Amplifikationsprotokoll generiert wurden, berechnen wir, dass diese Methode ungefähr 1,2 × 1011 cDNA-Klone aus 1 µg Gesamt-RNA ergibt.

Tabelle 2. Mengen an cRNA und cDNA, die bei jedem Schritt synthetisiert wurden

Um den Size-Bias-Effekt während der Amplifikationsschritte experimentell zu untersuchen, verglichen wir als nächstes die Größenverteilungen der cRNA der ersten Runde und der zweiten Runde durch RNA-Blot-Hybridisierungsanalyse. In diesen Experimenten wurden die Erstrunden- und die Zweitrunden-cRNAs mit SP6-UP-Primer bzw. mit Not-(dT) 18-Oligonukleotid hybridisiert, da diese Oligonukleotidsonden nur cRNAs nachweisen, die korrekt bis zum Ende transkribiert wurden. Wie in Abbildung 2 gezeigt, war die RNA-Größe an der Spitze des Hybridisierungssignals in der cRNA der zweiten Runde fast die gleiche wie in der cRNA der ersten Runde, jedoch mit einer leichten Verschiebung zu einer kleineren Größe. Wir vermuten, dass die Trunkierung von cRNAs wahrscheinlich während der Zweitrunden-cDNA-Synthese mit dem SP6 UP-Primer stattgefunden hat.

Um die Qualität der resultierenden amplifizierten cDNA-Bibliothek weiter zu bewerten, haben wir auch verschiedene Merkmale der mit und ohne Amplifikation erzeugten cDNA-Bibliotheken (MB-AL bzw. MB-CL) verglichen. Wir untersuchten zunächst die Größenverteilung der cDNA-Inserts, wie in Abbildung 3A gezeigt. Die Ergebnisse der Fluoreszenzintensitätssignale, die aus dem Gelfärbebild erhalten wurden, zeigten, dass die cDNA-Insertgrößen von MB-AL und MB-CL ähnlich waren, aber der Peakpunkt war in MB-AL (0,65 kb) etwas kleiner als in MB-CL (0,8 kb). Als nächstes analysierten wir 3′-End-Sequenzen von zufällig abgetasteten cDNA-Klonen aus jeder Bibliothek. Die Clustering-Ergebnisse für diese exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) sind in Abbildung 3B dargestellt und legen nahe, dass die Komplexität von MB-AL genauso hoch war wie die von MB-CL. Es ist jedoch erwähnenswert, dass hochredundante cDNA-Klone in MB-AL verschwanden. Durch eine statistische Analyse (Chi-Test) wurde gezeigt, dass der Unterschied der Redundanzen zwischen MB-AL und MB-CL signifikant war (die Wahrscheinlichkeit, dass die Redundanzen in MB-AL und MB-CL ähnlich sind, beträgt <0,001). Zusätzlich untersuchten wir die Integrität der 3′-Enden von cDNAs, indem wir analysierten, ob jedes EST ein Polyadenylierungssignalhexamer enthielt oder nicht. Die Ergebnisse zeigten, dass 80,1% und 87,3% der cDNA-Klone in MB-AL bzw. MB-CL plausible Polyadenylierungssignalsequenzen enthielten (21). Die Abnahme der Auftretensrate von Polyadenylierungssignalhexameren in MB-AL deutete wahrscheinlich auf eine Zunahme der Anzahl von cDNA-Klonen hin, bei denen die cDNA-Synthese aufgrund von zwei Runden dT-Priming intern grundiert wurde.

Durch Microarray-Hybridisierung untersuchten wir die cDNA-Population von MB-AL im Vergleich zu der von MB-CL. Abbildung 3C zeigt ein Streudiagramm der Hybridisierungssignale von MB-AL- und MB-CL-Targets. Die Ergebnisse zeigten eine erheblich hohe Korrelation der Hybridisierungssignale zwischen MB-AL- und MB-CL-Targets, was darauf hindeutet, dass die Amplifikation in der cDNA-Population keinen nachteiligen Effekt hatte.

Schließlich führten wir eine RNA-Blot-Hybridisierungsanalyse durch, um Größen-Bias-Effekte unter Berücksichtigung von Housekeeping-Genen zu untersuchen (Abbildung 3D). Für ribosomales S6-Protein und hsp 70 waren die cRNA-Größen sowohl in MB-AL als auch in MB-CL ähnlich und vergleichbar mit denen, die von ihren berichteten Nukleotidsequenzen erwartet wurden. Das Hybridisierungsmuster von hsp 70-cRNAs in MB-AL unterschied sich jedoch geringfügig von dem in MB-CL, was darauf hinweist, dass der Größen-Bias-Effekt nicht vollständig beseitigt wurde.

Die in diesem Bericht beschriebene Methode der cDNA-Bibliothekskonstruktion wurde entwickelt, um Größenverzerrungen während der Amplifikationsschritte zu minimieren, die durch RNA-Polymerase unterstützt werden. Eine solche RNA-Polymerase-unterstützte Bibliotheksbaumethode aus einem kleinen RNA-Pool für eine umfassende Sequenzierungsanalyse wurde nicht gut untersucht, während cDNA / cRNA-Bibliotheksbaumethoden für die Microarray-Hybridisierung aktiv verfolgt wurden. Obwohl Lukyanov et al. (23) und Piao et al. (24) bei Methoden, bei denen die PCR-Amplifikation zum Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus einer Submikrogramm-Menge der Gesamt-RNA verwendet wird, weist die PCR-Amplifikation an sich Nachteile wie eine starke Größen- und Populationsverzerrung und eine geringe Wiedergabetreue der cDNA-Amplifikation auf. Aus diesem Grund haben wir in dieser Studie versucht, eine cDNA-Bibliothekskonstruktionsmethode basierend auf RNA-Polymerase-unterstützter Amplifikation zu entwickeln.

Zu diesem Zweck haben wir eine neue RNA-Polymerase-unterstützte Amplifikationsstrategie entwickelt, wie in Abbildung 1 gezeigt, da die Methoden von Eberwine et al. (5), Huang et al. (10) und Lin et al. (11) besitzen noch Nachteile für die Herstellung einer plasmidhaltigen cDNA, die für eine umfassende Genstrukturanalyse geeignet ist. Im ersteren Fall erfolgt die cDNA-Synthese nach der cRNA-Amplifikation mit zufälligen Hexameren, wodurch die amplifizierten cDNAs zwangsläufig kürzer sind als die ursprünglichen (5,7). In letzterem Fall ist die Einführung eines homopolymeren Schwanzes am cDNA-Ende des ersten Strangs durch terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) oder Moloney murine Leukemia Virus (MMLV) Reverse Transkriptase-Aktivität (10,11) sinnvoll, um den Größen-Bias-Effekt während der RNA-Polymerase-unterstützten Amplifikation wie in unserer Methode zu minimieren. Es ist jedoch bekannt, dass das homopolymere Tailing-Verfahren aufgrund eines unerwarteten Primings der cDNA-Synthese aus einem homopolymeren Abschnitt interner RNA-Sequenzen eine Trunkierung von cDNAs verursacht. Da die in dieser Studie beschriebene Adapterligationsmethode eine spezifische Sequenz für das cDNA-Priming bereitstellen könnte, könnten wir erwarten, das Ausmaß der cDNA-Trunkierung mit unserer Methode zu reduzieren.

Im Prinzip sollte unsere Methode nur die cDNAs, flankiert von einem intrinsischen Poly(A)-Schwanz und der SP6-Adaptersequenz, amplifizieren, die in der First-Round-cDNA-Synthese erzeugt wurden. Die in Abbildung 2 und Abbildung 3A gezeigten Ergebnisse stimmten im Wesentlichen damit überein, obwohl die cDNA-Population im kleineren Größenbereich etwas erhöht war. Die Ergebnisse der RNA-Blot-Analyse (Abbildung 3D) zeigten auch, dass der Size-Bias-Effekt auch bei unserer Methode reduziert, aber nicht vollständig beseitigt werden konnte. Dies lag wahrscheinlich daran, dass abgeschnittene cDNAs, die an einen Poly (A) -Schwanz und die SP6-Promotorsequenz angehängt waren, während der Umwandlung von cRNA in cDNA erzeugt wurden. Diese Ansicht wurde durch die Tatsache gestützt, dass die Auftrittsrate der Polyadenylierungssignalsequenzen in MB-AL signifikant niedriger war als die in der konventionellen cDNA-Bibliothek beobachtete (21). Die Trunkierung von cDNAs könnte während der cDNA-Synthese aufgrund der internen Primierung von RNA mit dem dT-Tailed-Primer und dem SP6-Primer auftreten. Da homopolymere Dehnungen häufig in eukaryotischen mRNAs auftreten, könnte die homopolymere Tailing-Methode eine stärkere Größenverzerrung bei der multiplen cRNA-Amplifikation hervorrufen als unsere Adapterligierungsmethode. Obwohl eine Erhöhung der Reaktionstemperatur während der reversen Transkription und eine Verringerung der Primerkonzentration das aberrante interne Priming in der cDNA-Synthese bis zu einem gewissen Grad unterdrücken könnten, ist es bekannt, dass es derzeit schwierig ist, dieses vollständig zu eliminieren. Obwohl wir zur Demonstration des Gesamtprotokolls eine cRNA-Amplifikation in zwei Runden durchgeführt haben, empfehlen wir in der Praxis, die cRNA-Amplifikation in der zweiten Runde zu überspringen, wenn in der ersten Runde genügend cRNA erhalten werden kann.

In Anbetracht dieser Ergebnisse schlussfolgern wir, dass unsere neue Methode für den Aufbau von cDNA-Bibliotheken aus einer kleinen Menge an Start-RNA nützlich ist. Tatsächlich haben wir diese Methode erfolgreich und routinemäßig für den Aufbau von cDNA-Bibliotheken verwendet, wenn die Menge an Gesamt-RNA weniger als 1 µg beträgt (Daten nicht gezeigt). Da 1 µg Gesamt-RNA aus 105-106 Säugetierzellen oder 1 mg Säugetiergewebe gewonnen werden konnte, können cDNA-Bibliotheken leicht aus Zellen konstruiert werden, die durch Zellsortierer oder Mikrodissektion mit unserer Methode fraktioniert wurden. Da wir berechnen, dass diese Methode es uns ermöglicht, mehr als 105 cDNA-Klone aus 1 pg Gesamt-RNA zu erhalten, was der Menge an Gesamt-RNA in einer einzelnen Zelle nahe kommt, könnte eine von einer einzelnen Zelle abgeleitete cDNA-Bibliothek basierend auf dieser adapterligierungsunterstützten cRNA-Amplifikation konstruiert werden.