Abstract
som fungicid blev almindeligt anvendt til at kontrollere svampesygdomme i landbrug, skovbrug og veterinærlægemidler. I denne undersøgelse blev den akutte og reproduktive toksicitet af C. elegans vurderet ved hjælp af Caenorhabditis elegans (C. elegans) som en model for foreløbigt at evaluere de potentielle risici ved dette fungicid i landbrugsproduktion og anvendelse. Resultaterne viste, at væksten af C. elegans blev hæmmet af 0,01. Behandlingen af 0,1 karbendasim forårsagede et signifikant fald i bevægelsesadfærd og signifikant skade på reproduktions-og antioksidantsystemet, hvilket medførte, at nematodernes levetid blev drastisk forkortet. Disse resultater giver en bedre forståelse af miljørisikoen for carbendam og rejser nye bekymringer om sikkerhed.
1. Introduktion
pesticider, en slags kemiske eller biologiske reagenser, bruges i vid udstrækning i landbruget til at regulere plantevækst og kontrollere sygdomme og insekt skadedyr, som kan fremme afgrødevækst og forbedre afgrødeudbyttet . Den udbredte anvendelse af pesticider vil imidlertid føre til forskellige grader af rester i afgrøder eller fødevarer og dermed påvirke menneskers sundhed . Problemerne med pesticidrester har ikke kun tiltrukket stor opmærksomhed hos forbrugerne, men er også blevet en af de vigtigste faktorer, der påvirker fødevaresikkerheden .som et bredspektret fungicid er det blevet brugt til at bekæmpe svampesygdomme i landbrug, skovbrug og veterinærlægemidler . Det er dog kategoriseret i den farlige kategori af kemikalier af Verdenssundhedsorganisationen og er blevet klassificeret i Europa-Kommissionens prioriterede liste over hormonforstyrrende kemikalier . I de senere år er det indlysende, at den udbredte anvendelse af carbendasim med over-range og overdosering og det faktum, at carbendasim er svært at blive nedbrudt begge føre til problemet med carbendasim rester i landbruget . Selvom den toksiske virkning af carbendasim er blevet rapporteret siden 1980 ‘ erne, bliver toksiciteten af carbendasim et varmt emne på grund af den stigende bekymring for miljømæssige hormonforstyrrende stoffer . Det er blevet forbudt i flere lande på grund af dets negative indvirkning på miljø og sundhed, såsom udvikling og reproduktive forstyrrelser, toksicitet og mutagenicitet . De negative virkninger af carbendasim på de biokemiske, histopatologiske og hæmatologiske parametre i lever, nyre og endokrine kirtler og deres hormonelle niveauer er blevet illustreret hos rotter . Derudover er det nødvendigt yderligere undersøgelse af lav koncentration på grund af rester af carbendasim.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), som en vigtig forskningsmodel, bruges i vid udstrækning til at foretage en vurdering. Ifølge Amrit et al. , C. elegans har mange fordele, såsom lille størrelse, hurtig genereringstid, let at dyrke på laboratoriet og kort voksen levetid. C. elegans blev valgt i denne undersøgelse som modelorganisme til at evaluere toksiciteten af lav koncentration af carbendasim, som kan betragtes som en referenceværdi for anvendelse af carbendasim i landbruget.
2. Materialer og metoder
2.1. Kemikalier og stammer
Carbendasim (renhed, 99%, Aladdin, Chemical Technology Co., LTD, Shanghai, Kina) blev opløst i N, N-dimethylformamid (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, Kina) til at producere 1 g/L carbendasim oprindelige løsning. Koncentrationerne af DMF var 0,1% i endelige eksponeringsopløsninger (0.01, 0.1, 1, 10, 100 L). 0,1% DMF uden carbendasim var kontrolgruppen. C. elegans (vildtype N2) blev oprindeligt opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, MN, USA). Nematoderne blev dyrket på nematodevækstmedium (NGM) plader, der blev podet med Escherichia coli op50 ved 20 liter C som beskrevet . L1-larve C. elegans blev opsamlet ved at vaske de gravide nematoder med en blegeblanding (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2, 2. Lethalitet
originale opløsninger (1 g / L) blev fortyndet med S flydende medium (1,12 g K2HPO4, 5,92 g KH2PO4 og 5,85 g NaCl blev fortyndet med 1 L vand) for at få de endelige koncentrationer af 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, og 1 mg / L, som indeholdt 0,1% DMF. S flydende medium med 0,1% DMF var kontrolgruppen. 30 nematoder (L4) blev testet i 96-brøndsplader for hver koncentration. Overlevelsen af nematoder blev talt under et mikroskop efter dyrkning i 24 timer i inkubatoren. Testprocessen er baseret på metoden for et al. . Der var behov for tre parallelle eksperimenter.
2, 3. Lokomotionsadfærd
mindst 10 C. elegans (L4) blev plukket tilfældigt fra hver koncentration for at bestemme lokomotivets opførsel, som blev registreret af både hoved-thrashfrekvensen og kroppens bøjningstider . Antallet af head-thrash-frekvens blev talt ved ændringer i bøjningsretningen ved C. elegans midtkrop på 1 min. Måling af kropsbøjning blev defineret som tiderne for retningsændringerne af den del af nematoderne, der dyrkes i NGM uden E. coli OP50 i 30 s.
2.4. Vækst-og Udviklingsanalyser
C. elegans udsat for carbendasim i 24 timer blev analyseret. Kropslængden af nematoder, der blev udsat for carbendasim, blev vurderet af Image J-programmet. Afkom af hver C. elegans fra L4 larver til dag 1 blev optaget på L3-scenen efter individuelt overførsel til en ny plade hver dag, indtil reproduktionen ophørte . Mindst tre parallelle tests blev udført.
2, 5. Levetidsanalyse
alle C. elegans testet for levetid blev dyrket i samme tilstand ved 20 liter C. De synkroniserede C. elegans blev dyrket i NGM-plader med forskellige koncentrationer af carbendasim indtil dag 4. De testede nematoder overføres derefter til nye NGM-plader hver 2.dag. Overlevende og døde C. elegans blev registreret dagligt (begyndende på den første dag i voksenalderen), indtil alle nematoder for hver koncentration var død . Mindst tre parallelle tests blev udført.
2, 6. Bestemmelse af Oksidativ skade
intracellulær ROS blev målt med 2′,7′-dichlordihydrofluoroscein diacetat (H2DCFH-da), som er den mest almindelige og følsomme reaktive iltdetekteringssonde langt. Vildtype N2 C. elegans blev vasket i M9 buffer og derefter ultralyd forstyrret. Supernatanten blev analyseret ROS-niveauet efter instruktionen af ROS-kittet. Den endelige arbejdskoncentration af H2DCHE – da var 10 liter . Spændings-og emissionsabsorbansbølgelængderne var henholdsvis 485 nm og 535 nm. Mindst tre parallelle tests blev udført.
intracellulær Total superkildesimutase (T-SOD) blev bestemt i henhold til instruktionen fra T-SOD-kittet købt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Efter vask med M9 tre gange blev de undersøgte nematoder ultralydsforstyrret og reageret med et T-SOD-kit. Absorbansbølgelængden var 550 nm. Derudover blev supernatanten anvendt til at detektere niveauet af protein for hver koncentration, hvor absorbansbølgelængden var 595 nm. Mindst tre parallelle tests blev udført.
2, 7. Dataanalyse
alle data blev givet som gennemsnitlig standardfejl i middelværdien (sem) ved hjælp af envejs ANOVA. Grafer blev præsenteret ved hjælp af Origin 8.5 og GraphPad Primer 7, og statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 19.0-programmet. Det statistiske signifikansniveau blev udført ved hjælp af og .
3. Resultater
3.1. Bestemmelse af C ‘ S Bevægelsesadfærd. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. ved at analysere dataene om hoved-thrashfrekvens og kropsbøjningstider for nematoder (Figur 1(A) og 1(b)). Begge viste signifikante fald ved carbendasim-koncentrationerne i området fra 0,01 liter / L til 100 liter/L (). Derudover faldt hovedspidserne af nematoder udsat for 100 liter/L til 68,27%. For kropsbøjningstesten, når carbendasimkoncentrationerne var 10 liter/L og 100 liter/L, havde den en signifikant hæmmende virkning på kroppens bøjninger af C. elegans med henholdsvis 36,77% og 35,48% sammenlignet med kontrol en.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Bestemmelse af vækst og udvikling af C. sammenlignet med kontrolgruppen (Figur 1(c) og 1(d)) blev kropslængden og kropsoverfladearealet signifikant () reduceret i eksponeringsgrupperne fra 0,01 liter/L til 100 liter/L. begge blev reduceret med henholdsvis 19,16% og 22,15% ved behandling af 0,01 liter/L sammenlignet med kontrolgruppen. Koncentrationen på 10 liter / L viste de mest negative virkninger, og kropslængde og kropsoverfladeareal af C. elegans blev reduceret med henholdsvis 35,21% og 65,22% sammenlignet med kontrolgruppen.
3, 3. Bestemmelse af Stamstørrelserne af C. elegans efter akut eksponering
ifølge figur 2 havde stamstørrelserne af nematoder et signifikant fald () i behandlingsgrupperne fra 0,1 larg/L til 100 larg/L. stamstørrelserne af C. elegans faldt mest markant, hvilket faldt til 43,71% ved behandling af 10 larg/L sammenlignet med kontrolgruppen.
3.4. C. elegans levetid blev signifikant hæmmet af 0,01 liter/L til 100 liter/L ifølge levetidskurven vist i figur 3. Resultaterne viste, at C. elegans levetid blev reduceret fra 24 til 20 dage med behandling af 0,01. Levetiden for nematoder, der blev behandlet med 0,01 g / L, blev reduceret med 20,00%. Når eksponeringskoncentrationen var 100 liter / L, blev C. elegans levetid reduceret mest med 45,83%.
figur 3
effekter af C. elegans på overlevelse udsat for carbendasim. Data (middelkurs-sem) vises som den procentvise værdi sammenlignet med kontrolgruppen. Asteriskerne viser betydningen mellem hver eksponeringsgruppe og kontrolgruppe ( og ).
3, 5. C. elegans
ROS-niveauerne for kontrol og behandlet C. elegans ved eksponering af forskellige koncentrationer er vist i figur 4(A). Det blev indikeret, at niveauet af intracellulær ROS blev signifikant forøget () i området fra 0,01 Perl/L til 100 perl/L. Sammenlignet med kontrolniveauet blev ROS-niveauet højst forøget med 70,60% ved behandling af 10 liter/L. ifølge resultaterne af intracellulære SODNIVEAUER havde den en stigning ved behandlingen fra 0.01 G/L til 100 g / L (figur 4 (b)). SOD-niveauet blev øget med 10,70% ved 0,1 kg/L sammenlignet med kontrolgruppen.
(a)
(a)
(a)
>
(a) 
(b)
figur 4
effekter af C. elegans på antioksidativt system udsat for carbendasim. (a) ROS-niveauet for C. elegans efter eksponering for carbendasim; (b) SODNIVEAUET for C. elegans efter eksponering for carbendasim. Data (middelkurs-sem) vises som den procentvise værdi sammenlignet med kontrolgruppen. Asteriskerne viser betydning mellem hver eksponeringsgruppe og kontrolgruppe ( og ).
4. Diskussion
carbendasim, som fungicider, er meget udbredt i landbruget for at hæmme væksten af svampe. Det er forbudt at anvende carbendam i Australien, det meste af EU og USA på grund af dets alvorlige toksikologi og vedvarende karakter . Til denne undersøgelse var det første gang at bruge C. som modelorganismer til at evaluere virkningerne af carbendasim på lokomotivadfærd, vækst og udvikling, reproduktion, levetid og antioksidantsystemer. Desuden viste resultaterne, at det havde en negativ indflydelse på C. elegans.
ifølge 24 h-LC50 er den akutte toksicitetskoncentration af C. elegans udsat for forskellige koncentrationer af carbendasim 0,867 mg/L. 96-h LC50 af carbendasim som respons på sebrafisk er illustreret som 1,75 mg/L . Æggene fra preussisk karpe Carassius gibelio har vist toksicitetseffekterne i koncentrationen på 0, 036 mg/L . Undersøgelser viste, at væksten og udviklingen af Navicula sp. med en 24 h-EC50-værdi på 2,18 mg/L. selvom algevæksthastigheden genvindes efter 72-h-eksponering, forbliver chlorophyll-a-indholdet signifikant reduceret, når behandlingen af carbendasim var over 0,5 mg/l . I denne nutid blev C. elegans udsat for en lav koncentration af carbendasim valgt til at evaluere dens virkninger afhængigt af den faktiske koncentration af menneskelig daglig eksponering. Lave koncentrationer af carbendam betyder ikke, at det er sikkert. Det viser negative biologiske virkninger ved meget lavere doser i nogle undersøgelser.Lokomotivadfærd blev evalueret for at vurdere neurotoksiciteten af C. elegans (L4 larve) efter 24-timers eksponering for carbendasim. Resultaterne viste, at carbendasim kunne have negative virkninger på Lokomotiv adfærd gennem påvisning af hoved thrashing og krop bøjning af C. elegans, som begge var mere følsomme på den højere eksponeringsgruppe. Lokomotivopførslen hos sebrafiskembryoner, der udsættes for carbendasim, er følsom . Tidligere undersøgelser har vist, at fisk har en unormal adfærd, når subletale koncentrationer af carbendasim er 0,22–0,43 mg/l .
udviklingsmæssige misdannelser kan også være en årsag til unormal bevægelse . Væksten og udviklingen af C. elegans blev analyseret i vores undersøgelse. Resultaterne viste, at kropslængden og kropsarealet af C. elegans blev signifikant indsnævret ved behandlingen, der oversteg 0,01. Den normale vækst af hvirveldyr er relateret til det metaboliske thyroidhormonhomeostase . Thomas et al. kan forårsage tab af sædceller efter implantation, føtal misdannelse, og langsom vækst og udvikling.det er påvist, at mikrotubuli-polymerisationen af svampe-og pattedyrceller kan hæmme reproduktionstoksiciteten, hvilket kan forårsage forstyrrelse af mikrotubuli-samlingen ved at virke med larrus-tubulin, hvilket resulterer i forringelse af adskillelsen af kromosomer i processen med celledeling . Dannelsen af mikrotubuli ved hjælp af ikke – kovalente bindinger af kurr-og kurr-tubulin er ansvarlig for kromosomsegregering i processen med mitose og meiose . Stamstørrelsen af C. elegans falder signifikant ved 0,1. Det har vist sig at påvirke reproduktionssystemerne i japanske vagtler og hamstere . Det blev konkluderet, at C. elegans levetid blev signifikant reduceret med karbendasim koncentration på 0,01 karrg/L baseret på vores undersøgelse. Undersøgelser har vist, at carbendasim har ført til infertilitet og udviklingstoksicitet og manifesterer embryotoksicitet, kimcelleapoptose og teratogenese hos forskellige pattedyrarter .
apoptose er en kompleks programmeret celledød, som er et stærkt reguleret fænomen præget af en række cellulære processer . Mange undersøgelser har vist, at produktionen af ROS induceret af oksidativ stress er relateret til apoptotisk celledød . Vores undersøgelse viste, at carbendasim kunne fremkalde en signifikant stigning i niveauet af ROS-værdier og en lille stigning i niveauet af SOD-værdier. Stress forårsaget af miljøforurening inducerer den øgede ekspression af ROS og efterfølgende skader antioksidant forsvarssystem . SOD er ansvarlig for afgiftning af giftige frie radikaler og deres aktiviteter, som bruges til at evaluere det oksidative stressniveau og cellulær antioksidantstatus . Metalloenzyme SPADESTIK accelererer transformation af endogene cytotoksiske superoxid radikaler H2O2, og forøgelsen af SOD udtryk niveauer kan bidrage til at forbedre enzym aktiviteter med henblik på at fjerne de superoxid radikaler, fremkaldt af carbendazim og for at forhindre forekomsten af cellulære dysfunktion i løbet af eksponering af carbendazim . Højere eksponeringskoncentrationer kan forårsage alvorlig oksidativ stress, som efterfølgende ødelægger balancen i cellehomeostase og fremmer apoptose . Imidlertid kan carbendasim i lave koncentrationer stadig betydeligt skade reproduktionssystemet ifølge vores resultater.
5. Konklusion
så vidt vi ved, vurderede denne undersøgelse sikkerheden af carbendasim udsat for C. elegans for første gang. Det viste sig, at carbendasim kunne have en skadelig virkning på lokomotivets adfærd, udvikling og vækst, reproduktion, levetid og antioksidant system af C. elegans. Håber, at det skal være mere opmærksom på anvendelsen af carbendasim baseret på resultaterne. Derudover skal sikkerheden ved brug af carbendam til brug evalueres yderligere, især bioakkumuleringstoksicitet og potentielle genotoksiske virkninger.
datatilgængelighed
alle data genereret eller analyseret under denne undersøgelse er inkluderet i denne artikel.
interessekonflikter
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
anerkendelser
denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31501569).
3, 5. C. elegans
ROS-niveauerne for kontrol og behandlet C. elegans ved eksponering af forskellige koncentrationer er vist i figur 4(A). Det blev indikeret, at niveauet af intracellulær ROS blev signifikant forøget () i området fra 0,01 Perl/L til 100 perl/L. Sammenlignet med kontrolniveauet blev ROS-niveauet højst forøget med 70,60% ved behandling af 10 liter/L. ifølge resultaterne af intracellulære SODNIVEAUER havde den en stigning ved behandlingen fra 0.01 G/L til 100 g / L (figur 4 (b)). SOD-niveauet blev øget med 10,70% ved 0,1 kg/L sammenlignet med kontrolgruppen.
(a) (a)
(a) >
(a)
(b)
4. Diskussion
carbendasim, som fungicider, er meget udbredt i landbruget for at hæmme væksten af svampe. Det er forbudt at anvende carbendam i Australien, det meste af EU og USA på grund af dets alvorlige toksikologi og vedvarende karakter . Til denne undersøgelse var det første gang at bruge C. som modelorganismer til at evaluere virkningerne af carbendasim på lokomotivadfærd, vækst og udvikling, reproduktion, levetid og antioksidantsystemer. Desuden viste resultaterne, at det havde en negativ indflydelse på C. elegans.
ifølge 24 h-LC50 er den akutte toksicitetskoncentration af C. elegans udsat for forskellige koncentrationer af carbendasim 0,867 mg/L. 96-h LC50 af carbendasim som respons på sebrafisk er illustreret som 1,75 mg/L . Æggene fra preussisk karpe Carassius gibelio har vist toksicitetseffekterne i koncentrationen på 0, 036 mg/L . Undersøgelser viste, at væksten og udviklingen af Navicula sp. med en 24 h-EC50-værdi på 2,18 mg/L. selvom algevæksthastigheden genvindes efter 72-h-eksponering, forbliver chlorophyll-a-indholdet signifikant reduceret, når behandlingen af carbendasim var over 0,5 mg/l . I denne nutid blev C. elegans udsat for en lav koncentration af carbendasim valgt til at evaluere dens virkninger afhængigt af den faktiske koncentration af menneskelig daglig eksponering. Lave koncentrationer af carbendam betyder ikke, at det er sikkert. Det viser negative biologiske virkninger ved meget lavere doser i nogle undersøgelser.Lokomotivadfærd blev evalueret for at vurdere neurotoksiciteten af C. elegans (L4 larve) efter 24-timers eksponering for carbendasim. Resultaterne viste, at carbendasim kunne have negative virkninger på Lokomotiv adfærd gennem påvisning af hoved thrashing og krop bøjning af C. elegans, som begge var mere følsomme på den højere eksponeringsgruppe. Lokomotivopførslen hos sebrafiskembryoner, der udsættes for carbendasim, er følsom . Tidligere undersøgelser har vist, at fisk har en unormal adfærd, når subletale koncentrationer af carbendasim er 0,22–0,43 mg/l .
udviklingsmæssige misdannelser kan også være en årsag til unormal bevægelse . Væksten og udviklingen af C. elegans blev analyseret i vores undersøgelse. Resultaterne viste, at kropslængden og kropsarealet af C. elegans blev signifikant indsnævret ved behandlingen, der oversteg 0,01. Den normale vækst af hvirveldyr er relateret til det metaboliske thyroidhormonhomeostase . Thomas et al. kan forårsage tab af sædceller efter implantation, føtal misdannelse, og langsom vækst og udvikling.det er påvist, at mikrotubuli-polymerisationen af svampe-og pattedyrceller kan hæmme reproduktionstoksiciteten, hvilket kan forårsage forstyrrelse af mikrotubuli-samlingen ved at virke med larrus-tubulin, hvilket resulterer i forringelse af adskillelsen af kromosomer i processen med celledeling . Dannelsen af mikrotubuli ved hjælp af ikke – kovalente bindinger af kurr-og kurr-tubulin er ansvarlig for kromosomsegregering i processen med mitose og meiose . Stamstørrelsen af C. elegans falder signifikant ved 0,1. Det har vist sig at påvirke reproduktionssystemerne i japanske vagtler og hamstere . Det blev konkluderet, at C. elegans levetid blev signifikant reduceret med karbendasim koncentration på 0,01 karrg/L baseret på vores undersøgelse. Undersøgelser har vist, at carbendasim har ført til infertilitet og udviklingstoksicitet og manifesterer embryotoksicitet, kimcelleapoptose og teratogenese hos forskellige pattedyrarter .
apoptose er en kompleks programmeret celledød, som er et stærkt reguleret fænomen præget af en række cellulære processer . Mange undersøgelser har vist, at produktionen af ROS induceret af oksidativ stress er relateret til apoptotisk celledød . Vores undersøgelse viste, at carbendasim kunne fremkalde en signifikant stigning i niveauet af ROS-værdier og en lille stigning i niveauet af SOD-værdier. Stress forårsaget af miljøforurening inducerer den øgede ekspression af ROS og efterfølgende skader antioksidant forsvarssystem . SOD er ansvarlig for afgiftning af giftige frie radikaler og deres aktiviteter, som bruges til at evaluere det oksidative stressniveau og cellulær antioksidantstatus . Metalloenzyme SPADESTIK accelererer transformation af endogene cytotoksiske superoxid radikaler H2O2, og forøgelsen af SOD udtryk niveauer kan bidrage til at forbedre enzym aktiviteter med henblik på at fjerne de superoxid radikaler, fremkaldt af carbendazim og for at forhindre forekomsten af cellulære dysfunktion i løbet af eksponering af carbendazim . Højere eksponeringskoncentrationer kan forårsage alvorlig oksidativ stress, som efterfølgende ødelægger balancen i cellehomeostase og fremmer apoptose . Imidlertid kan carbendasim i lave koncentrationer stadig betydeligt skade reproduktionssystemet ifølge vores resultater.
5. Konklusion
så vidt vi ved, vurderede denne undersøgelse sikkerheden af carbendasim udsat for C. elegans for første gang. Det viste sig, at carbendasim kunne have en skadelig virkning på lokomotivets adfærd, udvikling og vækst, reproduktion, levetid og antioksidant system af C. elegans. Håber, at det skal være mere opmærksom på anvendelsen af carbendasim baseret på resultaterne. Derudover skal sikkerheden ved brug af carbendam til brug evalueres yderligere, især bioakkumuleringstoksicitet og potentielle genotoksiske virkninger.
datatilgængelighed
alle data genereret eller analyseret under denne undersøgelse er inkluderet i denne artikel.
interessekonflikter
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
anerkendelser
denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31501569).
