CRBN nedbrydes effektivt af VHL-CRBN heterodimeriserende PROTACs

PROTAC-teknologi bruger E3-ligaser til at ødelægge målproteiner. Vi spekulerede således på, om en E3-ligase i sig selv kan være allestedsnærværende og nedbrydes af en anden E3-ligase, hvis to forskellige E3-ligaser placeres i nærheden. VHL-nedbrydere kan potentielt være erythropoietinsubstitutter ved aktivering af HIF1a. For at designe dette forbandt vi pomalidomid, et CRBN-målretningsmolekyle, til VHL032, en VHL E3 ligase ligand (Fig. 1A). Linkeren forbandt aminogruppen af pomalidomid og den terminale acetylgruppe af VH032; fordi disse er opløsningsmiddeleksponerede regioner, ville en forbindelse mellem dem sandsynligvis ikke forstyrre deres binding til hver E3-ligase. Til syntese af VHL-CRBN heterodimeriserende PROTACs (Fig. 1b og supplerende Fig. S1A), 4-fluorothalidomid (1) og VHL ligand (5) blev fremstillet som tidligere rapporteret33. 4-Fluorothalidomid (1) blev behandlet med fire aminbindere (2) med en tert-butylestergruppe i nærvær af N,N-diisopropylethylamin (DIPEA) i dimethylsulfokse (DMSO) til dannelse af et mellemprodukt (3). Efter deprotation af tert-butylgruppen i 3 ved behandling med trifluoreddikesyre (TFA) i dichlormethan (DCM) blev syren (4) koblet med VHL-liganden (5 eller 7) i nærvær af 1–1h-1,2,3-triasolopyridinium 3-heksafluorophosphat (HATU) og DIPEA for at give PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 og TD-487 (8).

efter behandling med disse forbindelser undersøgte vi niveauerne af VHL og CRBN ved vestlig blot-analyse. Behandling med TD-158, TD-165 eller TD-343 forårsagede et koncentrationsafhængigt fald i niveauet af CRBN-proteiner (Fig. 1C, øverste panel). Niveauer af både VHL lang form og VHL kort form steg imidlertid, formodentlig på grund af stabilisering ved kemisk-proteininteraktion (Fig. 1C, øverste midterste og nederste midterste paneler) 34. I tilfælde af behandling med 10 liter td-158 blev CRBN-niveauer genoprettet; denne “krog”-effekt er en typisk egenskab, der forekommer i sammenhæng med højdosis PROTAC-induceret proteinnedbrydning9,35,36,37. TD-487, en stereoisomer af TD-165, kunne imidlertid ikke inducere CRBN-nedbrydning (Fig. 1C). TD-343 havde relativt svag aktivitet, hvilket antyder, at inkorporering af ilt i linkeren hæmmer PROTAC-aktivitet. En kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse indikerede, at faldet i CRBN-niveau induceret af VHL-CRBN heterodimeriserende Protac ‘er ikke skyldtes ændringer i mRNA’ et (supplerende Fig. S1B). Værdierne for 50% nedbrydningskoncentration (DC50) og maksimal nedbrydning (DMAKS) blev målt for alle syntetiserede forbindelser. De beregnede DC50-og DMAKS-værdier for TD-158 var 44,5 nM og 97.Henholdsvis 1% og de tilsvarende værdier for TD-165 var 20,4 nM og 99,6% (Fig. 1D og supplerende Fig. S1D). Den kortere linker-holdige degrader TD-156 (DC50 = 100,6 nM, DMAKS = 96,9%) viste svagere aktivitet sammenlignet med TD-165 (supplerende Fig. S1C). TD – 343 (DC50 = 367,8 nM, DMAKS = 85,1%), med ilt inkorporeret i linkeren, førte til ineffektiv nedbrydning af CRBN. For at teste effekten af bindingen til thalidomid undersøgte vi nedbrydning af CRBN ved VHL-CRBN heterodimeriserende PROTACs med en anden binding. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, DMAKS = 82%) med en glykolisk binding og TD-033 (DC50 = 2546,1 nM) med en amidforbindelse udviste reduceret CRBN-nedbrydning, hvorimod TD-759 (DC50 = 28,8 nM) med en glycinforbindelse udviste en styrke svarende til TD-165. For at bestemme, om relative proteinniveauer kan bidrage til denne partiske proteinnedbrydning, behandlede vi celler, der overudtrykkede VHL, CRBN eller begge med TD-158, og analyserede CRBN-og VHL-niveauer. I alle tilfælde blev CRBN-niveauerne reduceret, mens VHL-niveauerne forblev ens eller øgede (Fig. 1E). I tidsforløbsforsøg nedbrudte TD-158 CRBN med mere end 80% inden for 3 timer og nedbrudte det fuldstændigt efter 12 timer (Fig. 1F). TD-158-induceret CRBN-nedbrydning blev også observeret i forskellige humane cellelinjer (supplerende Fig. S2A-D).

nedbrydning af CRBN ved hjælp af VHL-CRBN heterodimeriserende PROTACs er afhængig af CRL2VHL

for at verificere, at CRBN-nedbrydning ved hjælp af TD-158 var afhængig af UPS eller Cullin-RING allestedsnærværende ligaser (CRL), testede vi en proteasominhibitor og MLN4924, en neddyleringsinhibitor. Samtidig behandling med TD-158 og mln4924 forhindrede CRBN-nedbrydning (Fig. 2A og supplerende Fig. S3A). Som forventet steg dannelsen af Poly-allestedsnærværende kæde markant i nærvær af TD-158 (Fig. 2B). Derudover dæmpede nedbrydning af VHL ved lille interfererende RNA (siRNA) TD-158–induceret CRBN-nedbrydning i HEK293T-celler (Fig. 2C). I modsætning hertil gendannede ekspression af VHL i 786-o-celler, en VHL-mangelfuld renalcarcinomcellelinie, TD–158-induceret CRBN-nedbrydning (Fig. 2D). I tråd med disse resultater forhindrede siRNA-medieret nedslagning af Cullin2, et stilladsprotein fra CRL2VHL-komplekset, TD–158-induceret CRBN-nedbrydning (Fig. 2E). Samlet set indikerer disse resultater, at CRBN-nedbrydning af VHL-CRBN heterodimeriserende Protac ‘ er er afhængig af CRL2VHL-komplekset.

effektiv nedbrydning af PROTACs kræver dannelse af et ternært kompleks med målproteinet og E3 ligase9,38. For at teste dette udførte vi co-immunudfældning eksperimenter. Vi fandt, at eksogent udtrykt Flag-mærket CRBN co-immunoprecipiteret endogen VHL i nærvær af TD-158, men ikke i dets fravær (Fig. 2F). GST-nedtrækningsforsøg ved anvendelse af oprensede proteiner viste, at CRBN direkte interagerede med VHL-Elongin B/C-komplekset i nærvær af TD-158 (Fig. 2G). Desuden hæmmede tilsætningen af overskydende pomalidomid eller VHL-ligand TD–158-induceret CRBN-nedbrydning (supplerende Fig. S3B, C). Eksogent udtrykt CRBN Y384 / V386A (AA), en pomalidomid-bindende–defekt mutant16, blev ikke nedbrudt af TD-158 (supplerende Fig. S3D). Disse data antyder således, at dannelse af et ternært kompleks blandt CRBN, VHL og TD-158 er en forudsætning for CRBN-nedbrydning.

en global proteomisk analyse afslører, at TD-158 inducerer nedbrydning af CRBN

for at undersøge nedbrydningen af CRBN på en upartisk måde udførte vi en kvantitativ proteomisk analyse. For at minimere de sekundære virkninger af CRBN-nedbrydning behandlede vi Jurkat-celler, der udtrykte CRBN-og IMiD neo-substrater, med TD-158 eller DMSO (vehicle control) i 12 timer. proteinerne fra hver prøve blev fordøjet, og de fordøjede peptider blev mærket til isobarisk mærkning koblet til væskekromatografi-tandem massespektrometri. Denne analyse identificerede 7.148 proteiner indeholdende mere end tre ikke-overflødige, unikke peptider (supplerende tabel S1). Kun tre proteiner-CRBN, CNIH1 og LMBRD2—opfyldte kriterierne for en P-værdi = 0,05 og mere end en 1,5 gange ændring. Blandt dem var CRBN det eneste protein, der ændrede sig mere end 2 gange (Fig. 3A). Imidlertid forblev niveauerne af andre komponenter i CRL4CRBN-komplekser (CUL4A, CUL4B, DDB1 og RBH1) og CRL2VHL-komplekser (elongin C, elongin B , CUL2 og RBH1) uændrede (Fig. 3B, C). Interessant nok blev niveauerne af tidligere rapporterede neosubstrater af Imider, herunder IKF1, IKF3, TFP91, 276 og 653, ikke ændret ved behandling med TD-158 (Fig. 3B) 39,40,41. Disse resultater blev bekræftet ved immunoblotting i Jurkat og forskellige multiple myelomcellelinjer (Fig. 3D og supplerende Fig. S2A-D).

CRBN nedbrydning ved VHL-CRBN heterodimeriserende PROTACs rekapitulerer en CRBN-mangel

et endogent substrat af CRL4CRBN er glutaminsyntetase limmen, som er et nøglesym i biogenesen af glutamin. Acetyltransferasen CBP / p300 acetylerer to N-terminale lysinrester af limtræ under betingelser med høje niveauer af glutamin, og den resulterende acetylerede limtræ fanges og allestedsnærværende af CRL4CRBN og fjernes derefter af proteasomer22. For at undersøge effekten af TD-158 på LIMTRÆNIVEAUER sultede vi Hep3B-celler af glutamin i 48 timer og forsynede derefter glutamin i nærvær eller fravær af TD-158. TD-158 inducerede CRBN-nedbrydning uanset glutaminstatus, og niveauerne af limtræ faldt langsommere over tid i nærvær af TD-158 end i dets fravær (Fig. 4A, B). Desuden viste in vivo allestedsnærværende analyser, at allestedsnærværende limtræ faldt i nærvær af TD-158 (Fig. 4C). Vi undersøgte også, om TD-165-behandling giver cellulær resistens over for IMiD. To IMiD-følsomme cellelinjer, VSU-DLCL2 og RPMI8226, blev forbehandlet med TD-165 eller DMSO i 24 timer og derefter behandlet med pomalidomid, TD-165 eller begge dele i 3 d. forbehandling med TD-165 reducerede de antiproliferative virkninger af pomalidomid i begge cellelinjer (Fig. 4D, E). Samlet set indikerer disse data, at CRBN-nedbrydning ved VHL-CRBN heterodimeriserende Protac ‘ er rekapitulerer en CRBN-mangel.

for at undersøge in vivo-virkningerne af VHL-CRBN heterodimeriserende Protac ‘ er forsøgte vi at bestemme, om TD-165 kan inducere CRBN-nedbrydning i dyremodeller. Selvom aminosyrerester i mus CRBN (mCRBN), der er vigtige for teratogenicitet, ikke bevares, blev mCRBN tydeligt nedbrudt, omend i lidt mindre grad, af TD-165 i musembryonale fibroblaster (supplerende Fig. S4A). Vi administrerede derefter TD-165 intraperitonealt til mus for at bestemme, om TD-165 inducerer CRBN-nedbrydning in vivo. Imidlertid blev CRBN-niveauer ikke ændret i milten, perifere mononukleære blodceller (Pbmc ‘ er) eller leveren (supplerende Fig. S4B). Da farmakokinetikken for TD-165 er rimelig (supplerende tabel S2), kan dette fravær af en effekt skyldes den høje plasmaproteinbinding (99,9%) af TD-165 (supplerende tabel S3).

N-terminalt trunkeret CRBN nedbrydes ikke af VHL-CRBN heterodimeriserende PROTACs

for at bestemme hvilket domæne af CRBN der er vigtigt for TD-165–medieret CRBN–nedbrydning, genererede vi en række CRBN-sletningsmutanter (D1-D4), som afbildet i Fig. 5A. celler, der udtrykker CRBN i fuld længde eller individuelle deletionsmutanter, blev behandlet med enten DMSO eller TD-165, og cellelysaterne blev undersøgt for nedbrydning efter TD-165-behandling. Overraskende nok blev ingen af de fire CRBN-deletionsmutanter nedbrudt af TD-165, mens CRBN i fuld længde blev effektivt nedbrudt (Fig. 5B). Især var VHL-niveauer let forhøjede formodentlig på grund af stabiliseringen af kemisk-proteininteraktion i nærvær af TD-165, men ikke ændret ved ekspression af trunkerede CRBN-mutanter i nærvær af TD-165 (Fig. 5B). En mulig forklaring på dette ville være manglende evne til at slette mutanter til at danne et ternært kompleks. Imidlertid dannede D1-mutanten et ternært kompleks med TD-165 og VHL (Fig. 5C), og allestedsnærværende D1 steg i nærvær af TD-165 (Fig. 5D). Vi antog derefter, at amino-terminale lysinrester af CRBN er nødvendige for allestedsnærværende. For at teste denne ide erstattede vi alle tre lysinrester inden for N-terminalen af CRBN (a.a. 1-80) med arginin, individuelt og i kombination, og undersøgte derefter cellelysater for CRBN-nedbrydning. TD-158 effektivt nedbrudt alle mutanter i samme omfang som vildtype CRBN (Fig. 5E), hvilket indikerer, at de tre lysinrester ved N-terminalen af CRBN ikke er nødvendige for nedbrydning induceret af VHL-CRBN heterodimeriserende Protac ‘ er.

den uordnede region af det målrettede protein er påkrævet for effektiv PROTAC-induceret nedbrydning

Vi forsøgte derefter at bestemme strukturelle forskelle mellem CRBN i fuld længde og CRBN-deletionsmutanten D1. N-terminalen for CRBN (a. a.1-80) blev forudsagt at indeholde en udfoldet eller iboende forstyrret region baseret på en iupred2a-analyse (supplerende Fig. S5A). Denne uordnede region (a. a. 1-48) var faktisk umærkelig i CRL4CRBN-krystalstrukturen på grund af dens fleksibilitet (FBF-indgang; 6BN7). Det er blevet påvist, at den iboende uordnede region er en af hovedkomponenterne i den proteasomale degron, og den fungerer som initiativtager til proteasomal proteolyse25. Alternativt kan det P97/valosin-holdige protein (p97/VCP) – kompleks udfolde den sekundære struktur i tilfælde af kugleformede proteiner uden en uordnet region, hvilket letter proteinernes proteasomale nedbrydning. For at undersøge forholdet mellem Protac-induceret proteinnedbrydning og P97/VCP-komplekset testede vi effekten af N2, N4-dibentilin-2,4-diamin,en p97 / VCP–hæmmer, på TD-165-induceret CRBN-nedbrydning. Disse eksperimenter viste, at CRBN-nedbrydningen ikke var påvirket af Dbeksbehandling (Fig. 6A). Niveauerne af DNA-skade-inducerbar transkription 3 (DDIT-3; CHOP) og lipideret LC-3II, anvendt som positive kontroller, blev forhøjet ved behandling med Dbekv. Erad og autophagy veje, hvilket fører til opregulering af CHOP, en veletableret UPR markør og akkumulering af LC-3II, en repræsentativ autophagy markør, henholdsvis (Fig. 6A) 42. For at undersøge, om det uordnede område af CRBN Letter PROTAC-induceret proteasomal nedbrydning, knyttede vi det uordnede område (a.A. 1-80) af CRBN til D2 -, D3-og D4-mutanter og undersøgte de kimære proteiner til nedbrydning. Alle kimære proteiner, især D4-kimæren, blev nedbrudt af TD-165 på en koncentrationsafhængig måde (Fig. 6B). Introduktion af et CRBN – forstyrret område til enten N-eller C-terminalen af VHL inducerede imidlertid ikke nedbrydning af fusionsproteinet (Fig. 6C), hvilket indikerer, at fastgørelse af det uordnede område ikke er tilstrækkeligt for alle målrettede proteiner. For at udvide denne ide til nedbrydning induceret af andre PROTACs, testede vi ARCC4, en tidligere rapporteret androgenreceptor (AR) PROTAC43, fordi AR også har en udfoldet region ved N-terminalen (a.A. 1-330), som bestemt ved hjælp af iupred2a analyseværktøjet (supplerende Fig. S5B). Efter ARCC4-behandling blev AR uden den N-terminale uordnede region (PRISN330) nedbrudt mindre effektivt end AR i fuld længde. Interessant nok øgede vedhæftningen af CRBN-uordnet region (a.a.1-80) til AR-KURSN330 nedbrydningseffektiviteten (Fig. 6D og supplerende Fig. S5C). I overensstemmelse med dette fremmede fastgørelse af AR-uordnet region (a.a. 1-170) til CRBN D1-mutant også proteolyse af TD-165 (Fig. 6e og supplerende Fig. S5D).

for yderligere at forstærke disse fund valgte vi Protac ‘ er med høj styrke (DC50< 1 liter) baseret på en litteratursøgning og analyserede dem derefter for en iboende forstyrret region ved hjælp af iupred2a-værktøjet. Interessant nok blev to tredjedele af de udvalgte PROTAC-målrettede proteiner fundet at have en uordnet region på mere end 40 aminosyrer, enten ved en af deres termini eller internt (tabel 1)44, skønt aminosyresekvensbaseret forudsigelse af uordnede eller ustrukturerede regioner ikke tager andre faktorer, såsom protein-proteininteraktion eller post-translationelle modifikationer, i overvejelse44,45,46. I overensstemmelse med dette har VHL-Homo-PROTAC vist sig at inducere nedbrydning af VHL lang form, som har en uordnet region ved sin N-terminal, men ikke VHL kort form47. Dette understøtter således vores ide om, at den uordnede region af målrettede proteiner er nødvendig for effektiv nedbrydning af PROTACs.