Selected rates and yields for C-limited aerobic chemostat cultivations of S. cerevisiae ST938 a 3-HP yield (C-mol C-mol−1) on glucose, b biomass yield on glucose (g mol−1), c specific 3-HP production rate (mmol gCDW−1 h−1) and d specific glucose uptake rate (mmol gCDW−1 h−1) at different dilution rates for S. cerevisiae ST938. Cultivations were carried out in triplicates at 30 °C and pH 5.5 under C-limited conditions. Fejl svarer til standardafvigelser afledt af triplikatdyrkning

dyrkningen af S. cerevisiae ST938 under C-begrænsende betingelser viste en overgang fra overvejende fermentativ metabolisme observeret i batch-tilstand til en respiratorisk metabolisme i kemostater, hvilket afspejles i højere biomasseudbytter såvel som i ubetydelig ethanol-og glyceroldannelse (tabel 1). Desuden er mindre mængder restglukose under 0.1 mM blev påvist i prøverne taget fra udstrømningen af de forskellige reaktorer, hvilket verificerede, at kulturerne var glukosebegrænsede. Kulstofbegrænsede betingelser fundet i steady-state kemostatkulturer syntes at fremme dannelsen af 3 hk, da udbyttet af dette produkt var 20 til 25 gange højere end udbyttet bestemt i batchkultur (tabel 1). Dette skyldes sandsynligvis den mere effektive omdannelse af kulstof til energi i form af ATP under respiration sammenlignet med gæring i batchkulturer. Interessant nok er kultiveringerne af S. cerevisiae ST938 under C-begrænsende betingelser afslørede, at med faldende specifikke vækstrater kunne der observeres en konstant stigning i 3-hk kulstofudbytter med det højeste 3-hk udbytte på 16,6% C-mol observeret ved en fortyndingshastighed på 0,04 h−1 (Fig. 2a). Udbyttet på biomasse på 3 hk er ti gange højere end udbyttet i batchkulturer og steg mere end to gange fra 0,19 til 0,43 g vægt−1 ved at sænke fortyndingshastigheden fra 0,21 til 0,04 h−1 (Tabel 1). Den maksimale specifikke produktivitet for 3 HK på ca. 0,50 mmol kropsvægt-1 time−1 blev set ved fortyndingshastigheder på 0,17 og 0.21 h-1, som er omtrent firedoblet højere end målt i batchdyrkning (Fig. 2C, tabel 1). Som forventet steg den specifikke glukoseoptagelseshastighed med højere fortyndingshastigheder fra 0, 51 til 2, 1 mmol gcdv−1 h−1 (Fig. 2d). Disse værdier er op til 20 gange under den maksimale specifikke glukoseoptagelseshastighed på 10,7 mmol gkdv-1 h−1 observeret ved L. A. under glucosebegrænsede vækstbetingelser i batch−tilstand (tabel 1). Værdier opnået for den specifikke substratoptagelseshastighed og biomasseudbyttet ved en fortyndingshastighed på 0.09 h-1 (Tabel 1) var i overensstemmelse med data fra kemostatdyrkninger med vildtype S. cerevisiae ved en fortyndingshastighed på 0,10 h−1 med angivelse af henholdsvis 1,1 og 1,25 mmol gkdv−1 h−1 såvel som 0,49 g g−1 . Det har vist sig, at biomasseudbyttet pr .substrat stiger med stigende fortyndingshastigheder, for vildtype S. cerevisiae, imidlertid, denne parameter er generelt konstant under Dcrit, så længe vedligeholdelsesmetabolisme udgør en betydelig kulstofvask, der reducerer biomasseudbyttet ved lave fortyndingshastigheder. I tilfælde af S. cerevisiae stamme ST938 syntes imidlertid, at kulstof, som ikke var rettet mod biomassedannelse, bidrog til en vis grad til dannelsen af både 3-hk og biprodukter.

for at konkludere, forskelle oplevet i kontinuerlige kulturer ved forskellige fortyndingshastigheder såvel som i sammenligning med lignende opsætninger med S. cerevisiae vildtype antyder, at den integrerede biosyntetiske vej til fremstilling af 3-hk har en enorm indflydelse på gærfysiologi, som formodentlig forstærkes af adaptive stressresponser. Endelig C-begrænset kemostatdyrkning med den laveste fortyndingshastighed på 0.04 h – 1 resulterede i det højeste kulstofudbytte på 3 hk.

undersøgelse af nitrogen-og fosfatbegrænsning for øgede 3-HP-udbytter i små kemostatkulturer

efter karakterisering af S. cerevisiae ST938 under C – begrænsende betingelser blev der udført dyrkninger under nitrogen – og fosfatbegrænsende betingelser, da de tidligere har vist sig at være gunstige for produktionen af forskellige native og ikke-native metabolitter i forskellige organismer . Her blev de tilsvarende dyrkninger under nitrogen (N) og fosfor (P) begrænsning undersøgt i det lille kontinuerlige dyrkningssystem (Fig. 1) med en indstillet fortyndingshastighed på 0,04 h−1, hvilket tidligere havde resulteret i det højeste kulstofudbytte på 3 hk under C-begrænsede betingelser (tabel 1). Parametrene og de respektive standardafvigelser fra N – og P-begrænsede dyrkninger af gærstammen ST938 er opsummeret i tabel 2.

for n – og P-begrænsede dyrkningsbetingelser blev der ikke påvist restammonium eller phosphat i prøverne taget fra udstrømningen fra de forskellige reaktorer, hvilket verificerede, at kulturerne var begrænset med hensyn til den tilsvarende substratbegrænsning (tabel 2). Imidlertid blev mindre mængder restglukose i området 0,63 og 0,19 mM påvist under n – og P-begrænsning (tabel 2). Under C-begrænsning var restglukoseniveauerne langt under 0,1 mM (tabel 2). Kultiveringer, der anvender n-og P-Begrænsninger, afslørede et 3-hk udbytte på henholdsvis 17,7 og 21,1% C-mol og viste en signifikant højere værdi under P-begrænsede betingelser sammenlignet med 3-hk kulstofudbytte på 16,6% C-mol beregnet for C-begrænsede dyrkningsbetingelser (tabel 1, 2). Tilsvarende blev den specifikke produktivitet for 3 hk signifikant øget for n – og P-begrænsede kultiveringer, der afslørede værdier på 0,22 og 0,23 mmol gkdv−1 h−1 sammenlignet med 0,17 mmol gkdv−1 h−1 nået i C-begrænsede kulturer. Desuden viste udbyttet på 3 HK på biomasse sammenlignelige værdier på 0,43 og 0.44 g vægt-1 for C-og N-begrænsende betingelser blev der imidlertid i tilfælde af p−begrænsning observeret et forøget udbytte på 0,50 g vægt-1. På grund af de samlede lave koncentrationer af biprodukter, der er kvantificeret, er disse ubetydelige (tabel 2). Værdierne for den specifikke substratoptagelseshastighed for C-og P−begrænsning var sammenlignelige, og en let forhøjet værdi på 0,61 mmol gcdv−1 h-1 blev opnået under N-begrænsede betingelser. Biomasseudbytter pr. substrat afsløret for N – og P-begrænsede betingelser tilsvarende værdier på henholdsvis 72,4 og 75,2 g mol-1. Sammenlignet med biomasseudbyttet på 78.4 g mol – 1 opnået under C-begrænsede betingelser, disse værdier er ens. Vores undersøgelse understøtter begrundelsen for, at højere produktudbytter pr.substrat blev opnået under n – og P-begrænsende betingelser. Følgelig ser det ud til, at en højere specifik substratoptagelseshastighed i tilfælde af N-begrænsning kombineret med den minimale dannelse af biprodukter i sidste ende favoriserede produktdannelse. Under P-begrænsende betingelser blev de mindste mængder biprodukter dannet, hvilket kunne favorisere produktsyntese. Det kan yderligere spekuleres i, at nogle metaboliske ændringer muligvis fører til, at en sænket mængde kulstof frigives som CO2.

sammenfattende afslørede kemostatkultiveringer under N – og P-begrænsning øgede udbytter på 3 hk og specifikke produktionshastigheder sammenlignet med C-begrænsede betingelser, hvor P-begrænsning muliggør de højeste produktudbytter.

overførbarhed af de fysiologiske parametre målt i små kemostater til fed-batchkulturer i 1-L bænk-top bioreaktorer under C-og P – begrænsende betingelser

da denne undersøgelse yderligere havde til formål at vurdere overførbarhed og sammenlignelighed af de fysiologiske parametre målt under forskellige dyrkningsbetingelser, blev dyrkningsparametrene opnået fra de C-og P – begrænsende betingelser bestemt i kemostatkulturer overført til 1-L omrørte bænk-topreaktorer, der kører i fed-batch-tilstand. Konceptet med denne tilgang var derfor at holde nøglebetingelser og parametre konstante for kemostat-og fed-batch-kulturer for at sikre sammenlignelighed. Disse betingelser omfattede (i) det samme C: P-forhold som anvendt i P-begrænsende kemostatkultiveringer, (ii) de identiske procesbetingelser som pH og temperatur og (iii) de samme specifikke vækstrater som anvendt i kemostater opnået gennem en eksponentiel foderprofil. For at optimere produkttiteren er parametrene med det maksimale produktudbytte pr. substrat fra kemostateksperimenterne (D = 0.04 h-1) under C-og P-begrænsning blev valgt til overførsel til fed-batch-systemet. På grund af tekniske begrænsninger i opsætningen blev fed-batch-kultiveringer udført med en vækstrate på 0,05 h−1, hvilket er lidt højere sammenlignet med den indstillede fortyndingshastighed på 0,04 h−1 i kemostat-kultiveringer. Fed-batchdyrkningen bestod af en indledende batchfase til generering af biomasse efterfulgt af en eksponentiel, næringsbegrænset fodringsfase for at kontrollere vækstraten. Kun fodringsfasen blev anset for relevant for overførbarhedsvurderingen af parametrene opnået fra det kontinuerlige dyrkningssystem, da substratkoncentrationen udelukkende i denne fase kontrollerede og dermed begrænsede mikrobiel vækst. Fed-batch dyrkning profiler af S. cerevisiae ST938 anvender C-og P-begrænsende betingelser er vist i Fig. 3, og de tilsvarende dyrkningsparametre med deres respektive standardafvigelse er opsummeret i tabel 3.

aerob fed-batch dyrkning i 1-L bænk-top fermentorer af S. cerevisiae ST938 ved hjælp af en eksponentiel fodringsrampe ved D = 0,05 h−1 med det begrænsende substrat a kulstof eller B fosfor. Sorte cirkler henviser til biomassetiter, røde firkanter til 3-hk titer og blå stiplede linje til den absolutte mængde glukose, der tilføres reaktorerne

biomasseudbyttet observeret i fed−batch – kulturer var henholdsvis 77,9 og 67,7 g mol-1 For C-og P-begrænsning. Biomasseudbyttet for C-begrænset dyrkning var sammenligneligt blandt kemostat-og fed-batch-operationer, mens der for P-begrænsning blev observeret et let nedsat biomasseudbytte under fed-batch-drift (tabel 2, 3), hvilket er inden for de standardafvigelser, der blev observeret for begge biomasseudbytter. Carbonudbyttet pr. substrat for 3 hk var 15,9% for C-begrænsning, hvilket er næsten identisk sammenlignet med værdien beregnet i kemostatsystemet (Fig. 4a). Udbyttet på 3 hk bestemt i denne undersøgelse er yderligere i tæt overensstemmelse med et carbonudbytte pr .substrat på 14% opnået i tidligere c-begrænsede fed-batch-studier ved pH 5,0 med en S. cerevisiae-stamme konstrueret til at bruge den kur-alaninvej og på 13% med en S. cerevisiae, der anvender den malonyl-CoA-reduktaseafhængige vej. Højere kulstofudbytter på 3 hk pr. substrat via Kurt-alaninvejen blev bestemt i undersøgelser med Escherichia coli med angivelse af en værdi på 42% i fed-batch-kultiveringer på glucose .

sammenligning af dyrkningsparametre under forskellige begrænsninger bestemt i småskala kemostater og 1-L bænk-topreaktorer i fed-batch-tilstand. et 3-hk kulstofudbytte (%C-mol) og B 3-hk udbytte på biomasse (g g−1). Fejl svarer til standardafvigelser afledt af triplicate kultiveringer

for P-begrænsende betingelser viste vores undersøgelse imidlertid en betydelig stigning i 3-hk kulstofudbytte på 25,6% (Fig. 4a). De observerede 3 hk-udbytter på biomasse var henholdsvis 0,38 og 0,65 g vægt−1 for C – og P-begrænsende betingelser. For C-begrænsning bekræftede dette de værdier, der blev observeret i kemostatopsætningen (Fig. 4b). På grund af stigningen i udbyttet på 3 hk pr.substrat under P-begrænsende betingelser og det lille fald i biomasseudbyttet pr. substrat på samme tid blev udbyttet på 3 hk pr. biomasse signifikant øget sammenlignet med kemostat-eksperimentet. I modsætning til dyrkningerne udført i kemostater blev der ikke påvist nogen signifikant akkumulering af ethanol eller glycerol i fed-batch-dyrkninger. En lukket kulstofbalance for C-og P-begrænsende betingelser viste, at der ikke blev dannet relevante mængder af andre (bi -) produkter (tabel 3). Denne forskel i biproduktspektrum kan forklare stigningen i 3 hk udbytte pr.

i sammenligning med dyrkningerne udført i kemostater viser de specifikke glukoseoptagelseshastigheder bestemt i fed-batchkulturer betydeligt højere værdier på henholdsvis 0,75 og 0,77 mmol gkdv−1 h−1 For C – og P-begrænsende betingelser. Som nævnt ovenfor blev setpunktet for den eksponentielle faktor for foderprofilen sat til 0,05 h−1 og varierede op til 0,059 h−1, hvilket resulterede i en 30-45% højere specifik vækstrate i foderbatch-kultiveringer sammenlignet med kemostateksperimenterne med 0.04 h – 1 (Tabel 3), hvilket medfører øgede specifikke glukoseoptagelseshastigheder. Ikke desto mindre var biomasseudbyttet på glukose for C-begrænsede fermenteringer sammenligneligt mellem kemostat og fed-batch dyrkning. Tilsvarende blev de specifikke produktionshastigheder på 3 hk forhøjet i fed-batch-kultiveringer med henholdsvis 0,24 mmol gkdv−1 h−1 og 0,38 mmol gkdv−1 h−1. 3-HP-udbytter pr. substrat var sammenlignelige mellem kemostat og fed-batch-dyrkning, hvilket tyder på, at udbyttet er en robust dyrkningsparameter, der er resistent over for forstyrrelser induceret af mindre udsving i dyrkningsopsætningen. Der blev ikke påvist noget restphosphat såvel som glucose i prøverne taget fra de forskellige reaktorer til P-begrænsende betingelser, hvilket bekræfter, at kulturerne er begrænset med hensyn til den tilsvarende begrænsning. Tilsvarende blev der for C-begrænsning ikke påvist restglukose i prøverne.

de her præsenterede forbedringer af et lille kemostatsystem, tidligere udviklet af Klein et al. , omfattede blandt andet en stigning i antallet af reaktorer til 24 og en reduktion i dyrkningsvolumen til 6,5 mL. Denne øgede grad af parallelisering gør systemet til et passende screeningsværktøj med høj kapacitet, da forskellige sammenlignelige kemostatsystemer i lille skala fungerer med højere arbejdsmængder og med et lavere antal reaktorer: det kontinuerlige parallelle rystede bioreaktor (CosBios) system bruger henholdsvis seks otte parallelle kulturbeholdere med et kulturvolumen på 20-25 mL . Det modificerede bioreaktorsystem til kontinuerlig dyrkning til engangsbrug omrørt tank (bioreaktor, 2MAG AG) fungerer med otte parallelle reaktorer med et arbejdsvolumen på 10 mL . Mini-chemostat (MC) – systemet udviklet af Bergenholm et al. består af 16 parallelle reaktorer og kræver et arbejdsvolumen på 40 mL. Vores system er derfor velegnet til enkel og omkostningseffektiv screening af mikrobiel ydeevne i kontinuerlig tilstand. Det kan imidlertid være relevant i yderligere omfang systemet ved at overvåge yderligere parametre, såsom udstødningsgas, for at muliggøre en detaljeret analyse af kulstoffordelingen, hvilket er af særlig betydning for fysiologiske belastningskarakteriseringer.

da vores undersøgelse foreslog, at N-og P-begrænsning var gunstig for 3 – HP-dannelse i S. cerevisiae, kunne fremtidige eksperimenter involvere yderligere screening af vækstrater med n-og P-begrænsning anvendt for at finde den optimale 3-HP-produktion med hver respektive begrænsning. Vores undersøgelse viste yderligere overførbarheden af fysiologiske parametre fra kemostat til fed-batch kultiveringer. Dette finder kun muligt, hvis der ikke akkumuleres toksiske eller hæmmende forbindelser under fed-batchdyrkning, da fysiologiske parametre vil ændre sig over tid og afvige fra de erhvervede parametre i kemostater. Som en generel tilgang kan kemostateksperimenter tjene som et redskab til at undersøge indflydelsen af en potentiel toksisk eller hæmmende forbindelse ved at tilsætte stoffet til selve foderet. Da alle andre parametre er konstante, kan indflydelsen af forbindelsen og dens koncentration direkte vurderes og evalueres. I vores undersøgelse blev der ikke påvist nogen biproduktdannelse i foderbatch-kultiveringer, og en formodentlig lignende stressrespons blev induceret på grund af svage syrer, hvilket tillod fysiologiske tilstande i små kemostater at ligne dem i foderbatch-betingelser.

sammenfattende viste denne undersøgelse, at begrebet C – og P-begrænsende betingelser for produktion af 3-hk blev undersøgt i et nyt paralleliseret kemostatdyrkningssystem og kunne med succes overføres til 1-L bænk-top bioreaktorer, der opererer i fed-batch-tilstand. Derfor kan fysiologiske parametre erhvervet i kemostater bruges til design og ydeevnevurdering af fed-batch-kultiveringer ved hjælp af udbyttebaserede parametre til procesopsætningen.